Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
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Diese Studie wurde 2018 vom Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund und dem Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226) unterstützt.

Die Studie wurde vom Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee genehmigt. Die Einverständniserklärung der Teilnehmer wurde vor der Entnahme der Endometriumbiopsien eingeholt. Im Einleitungsabschnitt finden Sie die Einschlusskriterien der Kontroll- und RM-Gruppen.
1. Probenvorbereitung
<ol><li>Stellen Sie sicher, dass sich alle Frauen in dieser Studie ab Tag 9 des Menstruationszyklus einem täglichen Urinmessstabtest unterziehen, u...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. 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Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Kritische Schritte innerhalb des Protokolls Es ist wichtig zu beachten, dass die Multiplexfärbung eine sorgfältige Optimierung erfordert. Die Antigengewinnung unter Verwendung der Citratpuffer- und Mikrowellentechnologie erfordert eine Optimierung, um ein vollständiges Antikörper-Stripping sicherzustellen und die Lebensfähigkeit des Gewebes zu erhalten. Da TSA-Reagenzien kovalent an Stellen binden, die das Antigen umgeben, können sie möglicherweise die Bindung eines nachfolgenden primären Anti...

Wiederkehrende Fehlgeburten (RM) können als der Verlust von zwei oder mehr Schwangerschaften vor der 24. Schwangerschaftswoche definiert werden1. Diese häufige Fortpflanzungsstörung betrifft bis zu 1% der Paare weltweit2,3. Die Pathophysiologie ist multifaktoriell und kann in embryologisch getriebene Ursachen (hauptsächlich aufgrund eines abnormalen embryonalen Karyotyps) und mütterlich getriebene Ursachen unterteilt werden, die die Endometrium- und / oder Plazentaentwicklung beeinflussen. Diese Manifestation kann aus elterlichen genetischen Anomalien, Uterusanomalien, prothrombotischen Zuständen, endokrinologischen Faktoren und immunologischen Störungenresultieren 4.
In den letzten Jahren wurde die Dysfunktion der Immuneffektorzellen mit der Pathogenese des frühen Schwangerschaftsverlustes in Verbindung gebracht5. Dies hat viele Untersuchungen zur Aufklärung der spezifischen Populationen von Immunzellen im Endometrium während des Menstruationszyklus, der Implantation und der frühen Schwangerschaft mit spezifischen Rollen in der frühen Schwangerschaft inspiriert. Unter diesen Immunzellen spielen Uteruszellen des natürlichen Killers (uNK) eine entscheidende Rolle während der Embryonenimplantation und Schwangerschaft, insbesondere bei den Prozessen der trophoblastischen Invasion und Angiogenese6. Studien haben eine erhöhte uNK-Zelldichte im Endometrium von Frauen mit RM7, 8gezeigt,obwohl dieser Befund nicht miteinemerhöhten Risiko für eine Fehlgeburt verbunden war9. Dies stimulierte jedoch die Forschung zur Bewertung der Dichte anderer Immunzelltypen (wie Makrophagen, dendritische Uteruszellen) im Endometrium bei Frauen mit RM10,11. Dennoch bleibt ungewiss, ob es bei Frauen mit RM zu einer signifikanten Veränderung der Immunzelldichte im Periimplantations-Endometrium kommt.
Eine mögliche Erklärung für die Unsicherheit ist, dass die Bewertung der endometrialen Immunzelldichte aufgrund der schnellen Veränderungen des Endometriums während des Implantationsfensters schwierig sein könnte. Während des 24-Stunden-Zeitrahmens verändern signifikante Veränderungen im Endometrium die Immunzelldichte und die Zytokinsekretion, was zu einer Variationsquelle in diesen Ergebnissenführt 12. Darüber hinaus stützen sich die meisten Berichte hauptsächlich auf die Verwendung von Einzelzellfärbungen (z. B. traditionelle IHC-Methoden), die nicht mehrere Marker auf demselben Gewebeschnitt untersuchen konnten. Obwohl die Durchflusszytometrie zum Nachweis mehrerer Zellpopulationen in einer einzigen Probe verwendet werden kann, behindern die großen Mengen an benötigten Zellen und die zeitaufwändige Optimierung die Popularität und Effizienz dieser Methode. Daher könnte die jüngste Weiterentwicklung der Multiplex-IHC-Färbung dieses Problem lösen, indem mehrere Marker auf demselben Objektträger immungefärbt werden, um mehrere Parameter zu bewerten, einschließlich der Zelllinie und der histologischen Lokalisation einzelner Immunsubpopulationen. Darüber hinaus kann diese Technologie die erhaltenen Informationen im Falle einer begrenzten Gewebeverfügbarkeit maximieren. Letztendlich kann diese Technik helfen, die Unterschiede in den Immunzellinteraktionen im Endometrium zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit RM aufzuklären.
Zwei Gruppen von Frauen wurden aus dem Prince of Wales Hospital rekrutiert, darunter fruchtbare Kontrollfrauen (FC) und Frauen mit unerklärlichen wiederkehrenden Fehlgeburten (RM). Fruchtbare Kontrolle war definiert als Frauen, die mindestens eine Lebendgeburt ohne spontane Fehlgeburt in der Vorgeschichte hatten, und RM-Frauen wurden als diejenigen definiert, die vor der 20. Schwangerschaftswoche eine Vorgeschichte von ≥2 aufeinanderfolgenden Fehlgeburten hatten. Die Probanden aus den beiden Gruppen erfüllten die folgenden Einschlusskriterien: (a) Alter zwischen 20 und 42 Jahren, (b) Nichtraucher, (c) regelmäßiger Menstruationszyklus (25-35 Tage) und normale Gebärmutterstruktur, (d) keine Anwendung eines hormonellen Regimes für mindestens 3 Monate vor der Endometriumbiopsie, (e) keine Hydrosalpinx durch Hystero-Salpingogramm. Darüber hinaus hatten alle rekrutierten Probanden eine normale Karyotypisierung, ein normales 3-dimensionales Ultraschall-Hysterosalpingogramm, ein follikelstimulierendes Hormon am Tag 2 < 10 IE / L, mittelluteales Progesteron > 30 nmol / L, eine normale Schilddrüsenfunktion und wurde negativ auf Lupus-Antikoagulans und Anticardiolipin-IgG- und IgM-Antikörper getestet.
Um die immunologischen Grundlagen der RM besser zu verstehen, wäre es am wünschenswertesten, die wichtigsten Immunzelltypen, die zum Zeitpunkt der Implantation im Endometrium vorhanden sind, gleichzeitig zu quantifizieren und zu lokalisieren. Dieser Beitrag beschreibt das gesamte Protokoll von der Probenvorbereitung über die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen bis hin zum Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug zum Nachweis endometrieller Immunzellen. Darüber hinaus beschreibt diese Arbeit, wie die Dichte und Clusterbildung der Immunzelltypen gleichzeitig im Endometrium bestimmt werden kann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

Die Immunhistochemie ist die am häufigsten verwendete Methode zur Identifizierung und Visualisierung von Gewebeantigenen in der biologischen Forschung und klinischen Diagnostik. Es kann verwendet werden, um verschiedene biologische Prozesse oder Pathologien wie Wundheilung, Immunantwort, Gewebeabstoßung und Gewebe-Biomaterial-Interaktionen zu charakterisieren. Die Visualisierung und Quantifizierung mehrerer Antigene (insbesondere für Immunzellen) in einem einzigen Gewebeschnitt mittels konventioneller immunhistochemischer (IHC) Färbung bleibt jedoch unbefriedigend. Daher wurden in den letzten Jahren multiplexe Technologien eingeführt, um mehrere biologische Marker in einer einzelnen Gewebeprobe oder einem Ensemble verschiedener Gewebeproben zu identifizieren. 
Diese Technologien können besonders nützlich sein, um die Veränderungen der Immun-Zell-zu-Zell-Interaktionen innerhalb des Endometriums zwischen fruchtbaren Frauen und Frauen mit wiederkehrenden Fehlgeburten während der Implantation zu differenzieren. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Protokoll für die multiplexierte Fluoreszenz-IHC-Färbung, um die Dichte und Clusterbildung von vier wichtigen Immunzelltypen gleichzeitig in genau getimten Endometriumproben während der Embryonenimplantation zu untersuchen. Die Methode umfasst die Probenvorbereitung, die Multiplex-Optimierung mit Markern für Immunzellsubtypen und das Scannen der Objektträger, gefolgt von einer Datenanalyse mit spezifischem Bezug auf den Nachweis endometrialer Immunzellen. 
Mit dieser Methode kann die Dichte und Clusterbildung von vier großen Immunzelltypen im Endometrium gleichzeitig in einem einzigen Gewebeschnitt analysiert werden. Darüber hinaus werden in diesem Artikel die kritischen Faktoren und die Fehlerbehebung diskutiert, um mögliche Fluorophor-Interferenzen zwischen den aufgetragenen Fluoreszenzsonden zu überwinden. Wichtig ist, dass die Ergebnisse dieser Multiplex-Färbetechnik dazu beitragen können, ein tiefes Verständnis der immunologischen Interaktion und Regulation während der Embryonenimplantation zu vermitteln.

Der schematische Gesamtprozess zur Durchführung eines 4-Farben-Multiplex-Assays zum Nachweis von 4 endometrialen Immunzelltypen ist in Abbildung 1 dargestellt. Kurz gesagt, das Protokoll für diese Multiplex-Immunfluoreszenzfärbung erforderte 8 Schlüsselschritte: 1. Objektträgervorbereitung, 2. Epitop-Retrieval, 3. Blockierung, 4. Primäre Antikörperanwendung, 5. Sekundäre Antikörperanwendung, 6. Signalamplifikation, 7. Entfernung von Antikörpern und 8. Gegenfleck und Mount. Die Bild...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Trotz der Fortschritte in der Multiplex-Immunhistochemie und der multispektralen Bildgebung bleibt die Charakterisierung der Dichte und Clusterbildung der wichtigsten Immunzellen gleichzeitig im Endometrium eine Herausforderung. Dieser Artikel beschreibt ein detailliertes Multiplex-Färbeprotokoll und eine Bildgebung für die gleichzeitige Lokalisierung von vier Immunzelltypen im Endometrium.

Gemultiplexte fluoreszierende immunhistochemische Färbung von vier endometrialen Immunzelltypen bei wiederkehrenden Fehlgeburten

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Die derzeitige Technologie ermöglicht die Verwendung von Antikörpern, die in derselben Spezies aufgezogen wurden, um bis zu sieben Marker nachzuweisen. Das Verfahren wird von Loucia Chan, einem Techniker aus dem Labor, demonstriert. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der formalinfesten paraffininierten Glasobjektträger, die mit der Gewebeprobe montiert sind, indem Sie die Objektträger flach in einen Ofen legen, um bei 60 Grad Celsius mit dem Gewebe nach oben zu backen.Nach einer Stunde entwachsen und rehydrieren Sie die Objektträger pro 10 Minuten mit der Reihe von Chemikalien, wie im Manuskript beschrieben. Tauchen Sie die Objektträger in tris-gepufferte Kochsalzlösung und dann in einen Kunststoff-Objektträgerkasten, der mit einer Mischung aus in Methanol verdünntem Formaldehyd gefüllt ist, um die Proben zu fixieren. Als nächstes waschen Sie die Folien zweimal in entionisiertem Wasser für zwei Minuten.Fahren Sie mit der Epitopentnahme fort, indem Sie das Dia-Rack in eine Hitzewiderstandsbox legen, die mit Zitronensäurepuffer bei pH 6,0 gefüllt ist. Und dann legen Sie die Box in die Mikrowelle, um die Folien zuerst mit 100% Leistung für 50 Sekunden zu erhitzen, gefolgt von 20 Minuten bei 20% Leistung, um die gleiche Temperatur zu halten. Nachdem Sie die Objektträger in destilliertem Wasser gespült und mit TBST gewaschen haben, tauchen Sie den Objektträger 10 Minuten lang in ein Glas mit einer Peroxidationsblockierungslösung.Nach der Inkubation spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser ab und waschen Sie sie mit TBST, dann verwenden Sie einen hydrophoben Barrierestift, um eine Grenze um den Gewebeabschnitt auf dem Objektträger zu markieren. Spülen Sie dann den Objektträger in TBST, bedecken Sie die Gewebeabschnitte mit dem Blockierenpuffer und inkubieren Sie die Objektträger in einer befeuchteten Kammer für 15 Minuten. Um die blockierenden Reagenzien zu entfernen, inkubieren Sie zuerst die Objektträger mit dem primären Antikörper von Interesse und entfernen Sie dann den primären Antikörper, indem Sie die Objektträger dreimal mit TBST waschen, bevor Sie mit der Polymer-Meerrettichperoxidase markierten sekundären Antikörper inkubieren.Waschen Sie nach der Inkubation die Objektträger, bevor Sie die Opalflora für die TSA-Arbeitslösung auftragen, und spülen Sie den Objektträger dann mit dem Antigen-Retrieval-Puffer ab. Führen Sie das mikrowellenbasierte Stripping durch, indem Sie die Objektträger in einem Antigen-Retrieval-Puffer in einer Mikrowelle bei 100% Leistung für 50 Sekunden erhitzen, gefolgt von 20% Leistung für 20 Minuten in den mikrowellensicheren Behältern. Nachdem die Proben 15 Minuten bei Raumtemperatur abgekühlt sind, spülen Sie die Objektträger in destilliertem Wasser und TBST ab und inkubieren Sie sie später fünf Minuten lang mit Dappy-Lösung.Anschließend trocknen Sie den Schlitten vor der Montage mit dem entsprechenden Montagemedium an der Luft. Vor der Bebilderung der Dias werden die entsprechenden Filter in der Workstation voreingestellt. Erfassen Sie mindestens 10 Felder für die Analyse unter 200-facher Vergrößerung.Um die Zellen zu zählen, klicken Sie auf die Schaltfläche Objekte zählen in der Schrittleiste, um das Einstellungsfenster für die Objektzählung anzuzeigen. Wenn das Gewebe segmentiert wurde, wählen Sie die Gewebekategorie aus, in der die Objekte zu finden sind. Wählen Sie dann die gewünschte Signalskalierung aus automatischer Skalierung oder fester Skalierung aus.Wählen Sie für die Objektsegmentierung die Hauptkomponente aus der Dropdown-Liste aus. Um Objekte zu erkennen, die andere Objekte berühren, als einzelne und nicht kombinierte Objekte, aktivieren Sie das Kontrollkästchen maximale Größe und Pixel und entscheiden Sie sich dann für die verfeinerte Aufteilung. Als nächstes zählen Sie alle Stromazellen in den Immunzellen separat, um die Daten als Prozentsatz der Immunzellen relativ zur Gesamtzahl der Stromazellen für jedes aufgenommene Bild auszudrücken.Geben Sie später die endgültige Zellanzahl als Durchschnitt aller Felder an. Untersuchen Sie mit dem Ansichtseditor die resultierenden Datentabellen nach der Verarbeitung und exportieren Sie dann die Zähldatentabelle. In der repräsentativen Analyse werden wir vier Immunzelltypen in der Endometriumprobe differenziert.Das bearbeitete Bild zeigt die Gewebesegmentierung als Epithel- und Stromakompartimente. Das Multiplex-Immunostaining wurde an den Endometriumbiopsien einer fruchtbaren Kontrollfrau und einer Frau mit unerklärlichen rezidivierenden Fehlgeburten durchgeführt, wobei ein einziger Boden für uns, der CD3, CD56, CD68 und CD20 darstellt, in der Immunfärbung aufgedeckt wurde. Sobald der Immunschall identifiziert wurde, kann eine weitere Färbung unter dem Zytokin helfen, ihre Interaktion und ihren Mechanismus für den Implantationserfolg zu adressieren.

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