Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
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Questo studio è stato supportato dall'Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund nel 2018 e dall'Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Lo studio è stato approvato dal Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Il consenso informato è stato ottenuto dai partecipanti prima di raccogliere le biopsie endometriali. Fare riferimento alla sezione introduttiva per i criteri di inclusione dei gruppi di controllo e RM.
1. Preparazione del campione
<ol><li>Assicurarsi che tutte le donne in questo studio siano sottoposte a un test giornaliero dell'astina delle urine dal gior...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Passaggi critici all'interno del protocollo È importante notare che la colorazione multiplex richiede un'ottimizzazione diligente. Il recupero dell'antigene, utilizzando il tampone citrato e la tecnologia a microonde, richiede l'ottimizzazione per garantire la completa rimozione degli anticorpi e mantenere la vitalità dei tessuti. Poiché i reagenti TSA si legano covalentemente ai siti che circondano l'antigene, possono potenzialmente inibire il legame di un successivo anticorpo primario attraverso ...

L'aborto spontaneo ricorrente (RM) può essere definito come la perdita di due o più gravidanze prima delle 24 settimane digestazione 1. Questa condizione riproduttiva frequente colpisce fino all'1% delle coppie in tutto il mondo2,3. La fisiopatologia è multifattoriale e può essere suddivisa in cause embriologicamente guidate (principalmente a causa di un cariotipo embrionale anormale) e cause guidate dalla madre che influenzano lo sviluppo dell'endometrio e / o della placenta. Questa manifestazione può derivare da anomalie genetiche parentali, anomalie uterine, condizioni protrombotiche, fattori endocrinologici e disturbi immunologici4.
Negli ultimi anni, la disfunzione delle cellule effettrici immunitarie è stata implicata nella patogenesi della perdita precoce della gravidanza5. Ciò ha ispirato molte indagini per chiarire le popolazioni specifiche di cellule immunitarie nell'endometrio durante il ciclo mestruale, l'impianto e la gravidanza precoce, con ruoli specifici all'inizio della gravidanza. Tra queste cellule immunitarie, le cellule natural killer uterine (uNK) svolgono un ruolo fondamentale durante l'impianto dell'embrione e la gravidanza, in particolare nei processi di invasione trofoblastica e angiogenesi6. Gli studi hanno dimostrato un aumento della densità delle cellule uNK nell'endometrio delle donne con RM7,8, anche se questo risultato non è stato associato ad un aumentato rischio di aborto spontaneo9. Tuttavia, questo ha stimolato la ricerca valutando la densità di altri tipi di cellule immunitarie (come macrofagi, cellule dendritiche uterine) nell'endometrio nelle donne con RM10,11. Tuttavia, rimane incerto se vi sia un'alterazione significativa della densità delle cellule immunitarie nell'endometrio perimpianto nelle donne con RM.
Una possibile spiegazione per l'incertezza è che la valutazione della densità delle cellule immunitarie endometriali potrebbe essere difficile a causa dei rapidi cambiamenti nell'endometrio durante la finestra di impianto. Durante il lasso di tempo di 24 ore, cambiamenti significativi nell'endometrio alterano la densità delle cellule immunitarie e la secrezione di citochine, introducendo una fonte di variazione in questi risultati12. Inoltre, la maggior parte dei rapporti si basa principalmente sull'uso della colorazione a singola cellula (ad esempio, metodi IHC tradizionali) che non potrebbero esaminare più marcatori sulla stessa sezione di tessuto. Sebbene la citometria a flusso possa essere utilizzata per rilevare più popolazioni cellulari in un singolo campione, le grandi quantità di cellule richieste e l'ottimizzazione dispendiosa in termini di tempo ostacolano la popolarità e l'efficienza di questo metodo. Quindi, il recente progresso nella colorazione IHC multiplex potrebbe risolvere questo problema immunocolorando più marcatori sullo stesso vetrino per valutare più parametri, tra cui il lignaggio cellulare e la localizzazione istologica delle singole sottopopolazioni immunitarie. Inoltre, questa tecnologia può massimizzare le informazioni ottenute in caso di limitata disponibilità di tessuti. In definitiva, questa tecnica può aiutare a chiarire le differenze nelle interazioni delle cellule immunitarie nell'endometrio tra donne fertili e donne con RM.
Due gruppi di donne sono stati reclutati dal Prince of Wales Hospital, tra cui donne fertili di controllo (FC) e donne con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile (RM). Il controllo fertile è stato definito come le donne che hanno avuto almeno un parto vivo senza alcuna storia di aborto spontaneo, e le donne RM sono state definite come quelle che hanno avuto una storia di ≥2 aborti consecutivi prima di 20 settimane di gestazione. I soggetti dei due gruppi soddisfacevano i seguenti criteri di inclusione: (a) età compresa tra 20 e 42 anni, (b) non fumatore, (c) ciclo mestruale regolare (25-35 giorni) e struttura uterina normale, (d) nessun uso di alcun regime ormonale per almeno 3 mesi prima della biopsia endometriale, (e) nessun idrosalpinx mediante istero-salpingogramma. Inoltre, tutti i soggetti reclutati avevano cariotipo normale, isterosalpingogramma ecografico a 3 dimensioni normale, ormone follicolo-stimolante del giorno 2 < 10 UI / L, progesterone medio-luteale > 30 nmol / L, normale funzione tiroidea e risultati negativi per gli anticorpi anticoagulante lupus e anticardiolipinA IgG e IgM.
Per comprendere meglio le basi immunologiche della RM, sarebbe più auspicabile quantificare e localizzare contemporaneamente i principali tipi di cellule immunitarie presenti nell'endometrio al momento dell'impianto. Questo articolo descrive l'intero protocollo dalla preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. Inoltre, questo documento descrive come determinare la densità e il raggruppamento dei tipi di cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

L'immunoistochimica è il metodo più comunemente usato per l'identificazione e la visualizzazione degli antigeni tissutali nella ricerca biologica e nella diagnostica clinica. Può essere utilizzato per caratterizzare vari processi biologici o patologie, come la guarigione delle ferite, la risposta immunitaria, il rigetto dei tessuti e le interazioni tessuto-biomateriale. Tuttavia, la visualizzazione e la quantificazione di più antigeni (specialmente per le cellule immunitarie) in una singola sezione di tessuto utilizzando la colorazione immunoistochimica convenzionale (IHC) rimane insoddisfacente. Pertanto, negli ultimi anni sono state introdotte tecnologie multiplexed per identificare più marcatori biologici in un singolo campione di tessuto o in un insieme di diversi campioni di tessuto. 
Queste tecnologie possono essere particolarmente utili per differenziare i cambiamenti nelle interazioni immuno cellula-cellula all'interno dell'endometrio tra donne fertili e donne con aborti ricorrenti durante l'impianto. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la colorazione IHC a fluorescenza multiplexata per studiare la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie contemporaneamente in campioni endometriali temporizzati con precisione durante l'impianto dell'embrione. Il metodo prevede la preparazione del campione, l'ottimizzazione multiplex con marcatori per i sottotipi di cellule immunitarie e la scansione dei vetrini, seguita dall'analisi dei dati, con specifico riferimento alla rilevazione delle cellule immunitarie endometriali. 
Utilizzando questo metodo, la densità e il raggruppamento di quattro principali tipi di cellule immunitarie nell'endometrio possono essere analizzati simultaneamente in una singola sezione di tessuto. Inoltre, questo documento discuterà i fattori critici e la risoluzione dei problemi per superare possibili interferenze fluoroforiche tra le sonde fluorescenti applicate. È importante sottolineare che i risultati di questa tecnica di colorazione multiplex possono aiutare a fornire una comprensione approfondita dell'interazione immunologica e della regolazione durante l'impianto dell'embrione.

Il processo schematico complessivo di esecuzione di un test multiplex a 4 colori per il rilevamento di 4 tipi di cellule immunitarie endometriali è mostrato nella Figura 1. In breve, il protocollo per questa colorazione di immunofluorescenza multiplex ha richiesto 8 passaggi chiave: 1. Preparazione del vetrino, 2. Recupero dell'epitopo, 3. Blocco, 4. Applicazione dell'anticorpo primario, 5. Applicazione dell'anticorpo secondario, 6. Amplificazione del segnale, 7. Rimozione dell'anticorpo e ...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Nonostante i progressi nell'immunoistochimica multiplex e nell'imaging multispettrale, caratterizzare la densità e il raggruppamento delle principali cellule immunitarie contemporaneamente nell'endometrio rimane una sfida. Questo documento descrive un protocollo dettagliato di colorazione multiplex e l'imaging per la localizzazione simultanea di quattro tipi di cellule immunitarie nell'endometrio.

Colorazione immunoistochimica fluorescente multiplexata di quattro tipi di cellule immunitarie endometriali in aborto spontaneo ricorrente

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

L'attuale tecnologia consente l'uso di anticorpi allevati nella stessa specie per rilevare fino a sette marcatori. A dimostrare la procedura sarà Loucia Chan, un tecnico del laboratorio. Iniziare preparando i vetrini di vetro incorporati in paraffina fissata alla formalina montati con il campione di tessuto, posizionando i vetrini piatti in un forno, per cuocere a 60 gradi Celsius con il tessuto rivolto verso l'alto.Dopo un'ora, scerare e reidratare i vetrini per 10 minuti ciascuno con la serie di sostanze chimiche, come descritto nel manoscritto. Immergere i vetrini in soluzione salina tris-buffered, e poi in una scatola di plastica riempita con una miscela di formaldeide diluita in metanolo, per fissare i campioni. Quindi, lavare le diapositive due volte in acqua deionizzata per due minuti.Procedere al recupero dell'epitopo, posizionando il rack di vetrini in una scatola di resistenza al calore riempita con tampone di acido citrico a pH 6,0. E poi posizionando la scatola nel microonde, per riscaldare prima i vetrini al 100% di potenza per 50 secondi, seguiti da 20 minuti al 20% di potenza, per mantenere la stessa temperatura. Dopo aver risciacquato i vetrini in acqua distillata e lavato con TBST, immergere il vetrino in un barattolo contenente una soluzione che blocca la perossidazione per 10 minuti.Dopo l'incubazione, sciacquare i vetrini in acqua distillata e lavare con TBST, quindi utilizzare una penna barriera idrofoba per segnare un confine attorno alla sezione del tessuto sul vetrino. Quindi risciacquare il vetrino in TBST, coprire le sezioni di tessuto con il tampone bloccante e incubare i vetrini in una camera umidificata per 15 minuti. Per rimuovere i reagenti bloccanti, prima incubare i vetrini con l'anticorpo primario di interesse, quindi rimuovere l'anticorpo primario lavando i vetrini tre volte con TBST, prima dell'incubazione con il polimero perossidasi di rafano etichettato, anticorpo secondario.Dopo l'incubazione, lavare i vetrini prima di applicare la flora opalina per la soluzione di lavoro TSA, quindi risciacquare il vetrino con il tampone di recupero dell'antigene. Eseguire lo stripping a base di microonde riscaldando i vetrini nel tampone di recupero dell'antigene in un forno a microonde con una potenza del 100%, per 50 secondi, seguita da una potenza del 20% per 20 minuti nei contenitori sicuri per microonde. Dopo aver raffreddato i campioni a temperatura ambiente per 15 minuti, sciacquare i vetrini in acqua distillata e TBST e successivamente incubare con soluzione dappy per cinque minuti.Quindi asciugare all'aria la slitta prima del montaggio con il mezzo di montaggio appropriato. Prima dell'imaging delle diapositive preimpostare gli appositi filtri nella postazione di lavoro. Cattura un minimo di 10 campi per l'analisi con un ingrandimento inferiore a 200 volte.Per contare le celle, fare clic sul pulsante Conta oggetti nella barra dei passaggi, per visualizzare il pannello delle impostazioni di conteggio degli oggetti. Se il tessuto è stato segmentato, selezionare la categoria di tessuto in cui si trovano gli oggetti. Quindi selezionare il ridimensionamento del segnale desiderato dalla scala automatica o dalla scala fissa.Per la segmentazione degli oggetti, selezionare il componente principale dall'elenco a discesa. Per rilevare oggetti che toccano altri oggetti come oggetti singoli e non combinati, selezionare la casella dimensioni massime e pixel e quindi optare per la divisione raffinata. Quindi, contare tutte le cellule stromali nelle cellule immunitarie separatamente, per esprimere i dati come percentuali delle cellule immunitarie rispetto al numero totale di cellule stromali per ogni immagine catturata.Successivamente, riportare il conteggio finale delle celle come media di tutti i campi. Utilizzando l'editor di viste, esaminare le tabelle di dati risultanti dopo l'elaborazione e quindi esportare la tabella dei dati di conteggio. Nell'analisi rappresentativa, quattro tipi di cellule immunitarie nel campione di endometrio siamo differenziati.L'immagine elaborata mostra la segmentazione dei tessuti come compartimenti epiteliali e stromali. L'immunocolorazione multiplex è stata eseguita sulle biopsie endometriali da una donna di controllo fertile e una donna con aborto spontaneo ricorrente inspiegabile, piano singolo per noi che rappresenta CD3, CD56, CD68 e CD20 sono stati rivelati nell'immunocolorazione. Una volta identificato il suono immunitario, un'ulteriore colorazione sotto la citochina può aiutare ad affrontare la loro interazione e il meccanismo per il successo dell'impianto.

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