Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Denne studien ble støttet av Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund i 2018 og Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Studien ble godkjent av Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Informert samtykke ble innhentet fra deltakerne før de samlet inn endometriebiopsier. Se introduksjonsdelen for inklusjonskriterier for kontroll- og RM-gruppene.
1. Prøvepreparering
<ol><li>Forsikre deg om at alle kvinnene i denne studien gjennomgår en daglig urinstikstest fra dag 9 av menstruasjonssyklusen og fremover for å identifisere luteiniserende hormon (LH...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Kritiske trinn i protokollen Det er viktig å merke seg at multipleksfarging krever flittig optimalisering. Antigenuthenting, ved hjelp av sitratbuffer og mikrobølgeteknologi, krever optimalisering for å sikre fullstendig antistoffstriping og opprettholde vevs levedyktighet. Som TSA reagenser kovalent binder seg til steder rundt antigenet, kan de potensielt hemme bindingen av et påfølgende primært antistoff gjennom sterisk hindring (også kjent som "paraplyeffekten"). Dette har en tendens til å ...

Tilbakevendende abort (RM) kan defineres som tap av to eller flere svangerskap før 24 ukers svangerskap1. Denne hyppige reproduktive tilstanden påvirker opptil 1% av par over hele verden2,3. Patofysiologien er multifaktoriell og kan deles inn i embryologisk drevne årsaker (hovedsakelig på grunn av en unormal embryonal karyotype) og maternalt drevne årsaker som påvirker endometrium og / eller placental utvikling. Denne manifestasjonen kan skyldes foreldregenetiske abnormiteter, livmoravvik, protrombotiske forhold, endokrinologifaktorer og immunologiske lidelser4.
I de senere år har immuneffektorcelledysfunksjon blitt involvert i patogenesen av tidlig graviditetstap5. Dette har inspirert mange undersøkelser om å belyse de spesifikke populasjonene av immunceller i endometrium under menstruasjonssyklusen, implantasjon og tidlig graviditet, med spesifikke roller i tidlig graviditet. Blant disse immuncellene spiller livmor naturlige morderceller (uNK) en kritisk rolle under embryoimplantasjon og graviditet, spesielt i prosessene for trofoblastisk invasjon og angiogenese6. Studier har vist en økt uNK celletetthet i endometrium av kvinner med RM7,8, selv om dette funnet ikke var forbundet med økt risiko for abort9. Dette stimulerte imidlertid forskning som evaluerte tettheten av andre immuncelletyper (som makrofager, livmor dendritiske celler) i endometrium hos kvinner med RM10,11. Likevel er det fortsatt usikkert om det er en betydelig endring i immuncelletettheten i peri-implantasjon endometrium hos kvinner med RM.
En mulig forklaring på usikkerheten er at evaluering av endometrial immuncelletetthet kan være vanskelig på grunn av de raske endringene i endometrium under implantasjonsvinduet. I løpet av 24 h tidsrammen, betydelige endringer i endometrium endre immuncelle tetthet og cytokin sekresjon, introdusere en kilde til variasjon i disse resultatene12. I tillegg er de fleste rapporter hovedsakelig avhengige av bruk av encellede farging (f.eks. tradisjonelle IHC-metoder) som ikke kunne undersøke flere markører på samme vevsseksjon. Selv om strømningscytometri kan brukes til å oppdage flere cellepopulasjoner i et enkelt utvalg, hindrer de store mengdene celler som kreves og den tidkrevende optimaliseringen populariteten og effektiviteten til denne metoden. Derfor kan det nylige fremskrittet i multiplex IHC-farging løse dette problemet ved å immunisere flere markører på samme lysbilde for å evaluere flere parametere, inkludert cellelinje og histologisk lokalisering av individuelle immununderbefolkninger. Videre kan denne teknologien maksimere informasjonen som er oppnådd i tilfelle begrenset vevstilgjengelighet. Til syvende og sist kan denne teknikken bidra til å belyse forskjellene i immuncelleinteraksjoner i endometriumet mellom fruktbare kvinner og kvinner med RM.
To grupper kvinner ble rekruttert fra Prince of Wales Hospital, inkludert fruktbare kontrollkvinner (FC) og kvinner med uforklarlig tilbakevendende abort (RM). Fruktbar kontroll ble definert som kvinner som hadde minst en levende fødsel uten noen historie med spontan abort, og RM-kvinner ble definert som de som hadde en historie med ≥2 påfølgende spontanaborter før 20 ukers svangerskap. Fagene fra de to gruppene oppfylte følgende inklusjonskriterier: (a) alder mellom 20 og 42 år, (b) ikke-røyker, (c) vanlig menstruasjonssyklus (25-35 dager) og normal livmorstruktur, (d) ingen bruk av hormonell regime i minst 3 måneder før endometrialbiopsi, (e) ingen hydrosalpinx ved hystero-salpingogram. I tillegg hadde alle de rekrutterte forsøkspersonene normalt karyotyping, normal 3-dimensjonal ultrasonografi hysterosalpingogram, dag 2 follikkelstimulerende hormon < 10 IE/L, mid-luteal progesteron > 30 nmol/l, normal skjoldbruskfunksjon og testet negativt for lupus antikoagulant og antikardiolipin IgG- og IgM-antikoagulant.
For bedre å forstå det immunologiske grunnlaget for RM, ville det være mest ønskelig å samtidig kvantifisere og lokalisere de store immuncelletypene som er tilstede i endometriumet på implantasjonstidspunktet. Dette dokumentet beskriver hele protokollen fra prøvepreparering, multipleksoptimalisering med markører for immuncelleundertyper og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse med spesifikk referanse til å oppdage endometrie immunceller. Videre beskriver dette papiret hvordan du bestemmer tettheten og klyngen av immuncelletypene samtidig i endometriumet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

Immunhiistokjemi er den mest brukte metoden for identifisering og visualisering av vevsantigener i biologisk forskning og klinisk diagnostikk. Den kan brukes til å karakterisere ulike biologiske prosesser eller patologier, for eksempel sårheling, immunrespons, vevsavvisning og vev-biomaterialer. Visualisering og kvantifisering av flere antigener (spesielt for immunceller) i en enkelt vevsseksjon ved hjelp av konvensjonell immunhiistokjemisk (IHC) farging forblir imidlertid utilfredsstillende. Derfor ble multipleksede teknologier introdusert de siste årene for å identifisere flere biologiske markører i en enkelt vevsprøve eller et ensemble av forskjellige vevsprøver. 
Disse teknologiene kan være spesielt nyttige for å differensiere endringene i immuncelle-til-celle interaksjoner i endometrium mellom fruktbare kvinner og kvinner med tilbakevendende miscarriages under implantasjon. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for multiplekset fluorescens IHC-farging for å undersøke tettheten og klyngen av fire store immuncelletyper samtidig i nøyaktig tidsbestemte endometrieprøver under embryoimplantasjon. Metoden inkluderer prøvepreparering, multipleksoptimalisering med markører for immuncelleundertyper, og skanning av lysbildene, etterfulgt av dataanalyse, med spesifikk referanse til å oppdage endometriale immunceller. 
Ved hjelp av denne metoden kan tettheten og klyngen av fire store immuncelletyper i endometriumet analyseres samtidig i en enkelt vevsseksjon. I tillegg vil dette dokumentet diskutere de kritiske faktorene og feilsøkingen for å overvinne mulig fluoroforurensing mellom fluorescerende sonder som påføres. Det er viktig at resultatene fra denne multipleksfargingsteknikken kan bidra til å gi en grundig forståelse av immunologisk interaksjon og regulering under embryoimplantasjon.

Den generelle skjematiske prosessen med å utføre en 4-fargers multipleksanalyse for påvisning av 4 endometriale immuncelletyper er vist i figur 1. Kort sagt, protokollen for denne multiplex immunfluorescence farging nødvendig 8 viktige trinn: 1. Slide forberedelse, 2. Epitope gjenfinning, 3. Blokkering, 4. Primær antistoff søknad, 5. Sekundær antistoff søknad, 6. Signalforsterkning, 7. Fjerning av antistoff, og 8. Mottrekk og montering. Bildegjengivelse og analyse ble deretter utfør...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Til tross for fremskrittene i multiplex immunhiistokjemi og multispektral avbildning, karakteriserer tettheten og klyngen av store immunceller samtidig i endometrium fortsatt en utfordring. Dette dokumentet beskriver en detaljert multipleksfargingsprotokoll og bildebehandling for samtidig lokalisering av fire immuncelletyper i endometriumet.

Multiplekset fluorescerende immunhiistokjemisk farging av fire endometrie immuncelletyper i tilbakevendende abort

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Den nåværende teknologien tillater bruk av antistoff oppvokst i samme art for å oppdage opptil syv markører. Å demonstrere prosedyren vil være Loucia Chan, en tekniker fra laboratoriet. Begynn med å forberede formalin fast paraffin innebygd glass lysbilder montert med vev prøven, ved å plassere lysbildene flatt i en ovn, å bake på 60 grader celsius med vevet vendt oppover.Etter en time, de-voks og rehydrere lysbildene per 10 minutter hver med serien av kjemikalier, som beskrevet i manuskriptet. Senk lysbildene ned i tris-bufret saltvann, og deretter i en plastsklieboks fylt med en blanding av formaldehyd fortynnet i metanol, for å fikse prøvene. Deretter vasker du lysbildene to ganger i deionisert vann i to minutter.Fortsett til epitoputhenting, ved å plassere stativet med lysbilder i en varmebestandighetsboks fylt med sitronsyrebuffer ved pH 6.0. Og deretter plassere boksen i mikrobølgeovnen, for å varme lysbildene først ved 100% strøm i 50 sekunder, etterfulgt av 20 minutter ved 20% strøm, for å opprettholde samme temperatur. Etter skylling av lysbildene i destillert vann og vasking med TBST, senk gliden ned i en krukke som inneholder en peroksidasjonsblokkeringsløsning i 10 minutter.Etter inkubasjonen, skyll lysbildene i destillert vann og vask med TBST, og bruk deretter en hydrofob barrierepenn for å markere en grense rundt vevsdelen på lysbildet. Skyll deretter lysbildet i TBST, dekk vevsdelene med blokkeringsbufferen og inkuber lysbildene i et fuktet kammer i 15 minutter. For å fjerne de blokkerende reagensene, inkuber først lysbildene med det primære antistoffet av interesse, og fjern deretter det primære antistoffet ved å vaske lysbildene tre ganger med TBST, før inkubasjon med polymer pepperrotperoksidase merket, sekundært antistoff.Etter inkubasjonen, vask lysbildene før du bruker Opal flora for TSA arbeidsløsning, og skyll deretter lysbildet med antigengjenvinningsbufferen. Utfør mikrobølgebasert stripping ved å varme opp lysbildene i antigengjenvinningsbuffer i en mikrobølgeovn med 100% strøm, i 50 sekunder, etterfulgt av 20% strøm i 20 minutter i mikrobølgesikre beholdere. Etter å ha avkjølt prøvene ved romtemperatur i 15 minutter, skyll lysbildene i destillert vann og TBST og inkuber senere med dappy løsning i fem minutter.Tørk deretter skredet før montering med riktig monteringsmedium. Før bildebehandling av lysbildene forhåndsinnstilles de aktuelle filtrene i arbeidsstasjonen. Registrer minst 10 felt for analyse under 200 ganger forstørrelse.Hvis du vil telle cellene, klikker du telleobjektknappen på trinnlinjen for å vise panelet for innstillinger for objekttelling. Hvis vevet er segmentert, velger du vevskategorien der objektene skal bli funnet. Velg deretter ønsket signalskalering fra automatisk skalering eller fast skala.For objektsegmentering velger du hovedkomponenten fra rullegardinlisten. Hvis du vil oppdage objekter som berører andre objekter som individuelle og ikke kombinerte objekter, merker du av for maksimal størrelse og piksler , og deretter velger du den raffinerte delingen. Deretter teller du alle stromale celler i immuncellene separat, for å uttrykke dataene som prosentandelen av immuncellene i forhold til det totale antallet stromale celler for hvert tatt bilde.Senere rapporterer du det endelige celleantallet som et gjennomsnitt av alle feltene. Bruk redigeringsprogrammet for visning til å undersøke etterbehandlingen av resultatdatatabellene og deretter eksportere datatabellen for antall. I den representative analysen er fire immuncelletyper i endometrium-prøven vi er differensiert.Det bearbeidede bildet viser vevssegmentering som epitel og stromale rom. Multipleksimmuniseringen ble utført på endometriale biopsier fra en fruktbar kontrollkvinne og en kvinne med uforklarlig tilbakevendende abort, en etasje for oss som representerer CD3, CD56, CD68 og CD20 ble avslørt i immuniseringen. Når immunlyden er identifisert, kan ytterligere farging under cytokin bidra til å adressere deres interaksjon og mekanisme for implantasjonssuksess.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analyse av encellede gentranskripsjon av RNA Fluorescent<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Separasjon av spermatogenic celletyper Bruke STA-PUT Velocity Sedimente

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk strekkoding med Fluorescent Proteiner for multiplekset Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantifisering av protein uttrykk og samlokalisering Bruke multiplekset Immuno-histokjemisk Farging og multispektrale bildebehandling

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utvikling av et innlegg Co-kultur System of Two Cellular Typer i fravær av Cell-Cell Kontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering og transkriptomanalyse av plantecelletyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering av pattedyrsinktransportører ved bruk av en in vitro sinktransportanalyse

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...