Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
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Este estudo foi apoiado pelo Fundo Fiduciário Obstetra e Ginecológico de Hong Kong em 2018 e pelo Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Clínica da Universidade Conjunta Chinesa de Hong Kong-Novos Territórios do Leste. O consentimento informado foi obtido dos participantes antes da coleta das biópsias endometrial. Consulte a seção de introdução para critérios de inclusão dos grupos de controle e RM.
1. Preparação da amostra
<ol><li>Certifique-se de que todas as mulheres deste estudo se submetam a um teste diário de vareta de urina a partir do dia 9 do ciclo ...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Passos críticos dentro do protocolo É importante notar que a coloração multiplex requer otimização diligente. A recuperação de antígenos, usando a tecnologia de tampão citrato e micro-ondas, requer otimização para garantir a remoção completa de anticorpos e manter a viabilidade do tecido. Como os reagentes da TSA se ligam covalentemente aos locais ao redor do antígeno, eles podem potencialmente inibir a ligação de um anticorpo primário subsequente através de obstáculos estéricos (...

Aborto recorrente (RM) pode ser definido como a perda de duas ou mais gestações antes das 24 semanas de gestação1. Esta condição reprodutiva frequente afeta até 1% dos casais em todo o mundo2,3. A fisiopatologia é multifatorial e pode ser dividida em causas embriológicas (principalmente devido a um karyótipo embrionário anormal) e causas maternamente orientadas que afetam o desenvolvimento endométrio e/ou placentário. Essa manifestação pode resultar de anormalidades genéticas parentais, anomalias uterinas, condições protombolíticas, fatores de endocrinologia e distúrbios imunológicos4.
Nos últimos anos, a disfunção celular com efeito imunológico tem sido implicada na patogênese da perda precoce da gravidez5. Isso inspirou muitas investigações sobre a elucidação das populações específicas de células imunes no endométrio durante o ciclo menstrual, implantação e gravidez precoce, com papéis específicos no início da gravidez. Entre essas células imunes, as células assassinas naturais uterinas (uNK) desempenham um papel crítico durante a implantação e gravidez de embriões, particularmente nos processos de invasão trofoblástica e angiogênese6. Estudos têm mostrado um aumento da densidade celular uNK no endométrio de mulheres com RM7,8, embora este achado não tenha sido associado a um risco aumentado de aborto9. No entanto, isso estimulou pesquisas avaliando a densidade de outros tipos de células imunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) no endométrio em mulheres com RM10,11. No entanto, permanece incerto se há uma alteração significativa na densidade das células imunes no endométrio de peri-implantação em mulheres com RM.
Uma possível explicação para a incerteza é que a avaliação da densidade das células imunes endometrial pode ser difícil devido às rápidas mudanças no endométrio durante a janela de implantação. Durante o período de 24 horas, mudanças significativas no endométrio alteram a densidade das células imunes e a secreção de citocinas, introduzindo uma fonte de variação nesses resultados12. Além disso, a maioria dos relatórios depende principalmente do uso de coloração unicelular (por exemplo, métodos tradicionais de IHC) que não puderam examinar vários marcadores na mesma seção tecidual. Embora a citometria de fluxo possa ser usada para detectar múltiplas populações celulares em uma única amostra, as grandes quantidades de células necessárias e a otimização demorada dificultam a popularidade e eficiência deste método. Assim, o recente avanço na coloração multiplex IHC poderia resolver esse problema imunossumando múltiplos marcadores no mesmo slide para avaliar vários parâmetros, incluindo linhagem celular e localização histológica de subpopulações imunomunes individuais. Além disso, essa tecnologia pode maximizar as informações obtidas em caso de disponibilidade limitada de tecidos. Em última análise, essa técnica pode ajudar a elucidar as diferenças nas interações de células imunes no endométrio entre mulheres férteis e mulheres com RM.
Dois grupos de mulheres foram recrutados do Hospital Prince of Wales, incluindo mulheres de controle fértil (FC) e mulheres com aborto recorrente inexplicável (RM). O controle fértil foi definido como mulheres que tiveram pelo menos um parto vivo sem histórico de aborto espontâneo, e as mulheres RM foram definidas como aquelas que tiveram um histórico de abortos consecutivos ≥2 antes das 20 semanas de gestação. Os sujeitos dos dois grupos atenderam aos seguintes critérios de inclusão: (a) idade entre 20 e 42 anos, (b) não fumante, (c) ciclo menstrual regular (25-35 dias) e estrutura uterina normal, (d) não utilização de qualquer regime hormonal por pelo menos 3 meses antes da biópsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por hytero-salpingograma. Além disso, todos os sujeitos recrutados tinham kariotipagem normal, ultrassonografia 3-dimensional normal histerosalpingograma, hormônio estimulante do folículo dia 2 < 10 UI/L, progesterona mid-luteal > 30 nmol/L, função tireoide normal, e testado negativo para lúpus anticoagulante e anticardolipina IgG e IgMbodies.
Para entender melhor a base imunológica da RM, seria mais desejável quantificar e localizar simultaneamente os principais tipos de células imunes presentes no endométrio no momento da implantação. Este artigo descreve todo o protocolo desde a preparação da amostra, a otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados com referência específica à detecção de células imunes endometrial. Além disso, este artigo descreve como determinar a densidade e o agrupamento dos tipos de células imunes simultaneamente no endométrio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

A imunohistoquímica é o método mais utilizado para identificação e visualização de antígenos teciduais em pesquisas biológicas e diagnósticos clínicos. Pode ser usado para caracterizar vários processos biológicos ou patologias, como cicatrização de feridas, resposta imune, rejeição tecidual e interações tecido-biomateriais. No entanto, a visualização e quantificação de múltiplos antígenos (especialmente para células imunes) em uma única seção tecidual usando a coloração imunohistoquímica convencional (IHC) permanece insatisfatória. Assim, tecnologias multiplexadas foram introduzidas nos últimos anos para identificar múltiplos marcadores biológicos em uma única amostra de tecido ou um conjunto de diferentes amostras de tecido. 
Essas tecnologias podem ser especialmente úteis para diferenciar as mudanças nas interações célula-imune dentro do endométrio entre mulheres férteis e mulheres com abortos recorrentes durante a implantação. Este artigo descreve um protocolo detalhado para coloração de fluorescência multiplexada do IHC para investigar a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes simultaneamente em amostras endometrial precisamente cronometradas durante a implantação de embriões. O método inclui preparação amostral, otimização multiplex com marcadores para subtipos de células imunes e a varredura dos slides, seguido pela análise de dados, com referência específica à detecção de células imunes endometrial. 
Usando este método, a densidade e o agrupamento de quatro tipos principais de células imunes no endométrio podem ser analisados simultaneamente em uma única seção tecidual. Além disso, este artigo discutirá os fatores críticos e a solução de problemas para superar possíveis interferências fluorforais entre as sondas fluorescentes que estão sendo aplicadas. É importante ressaltar que os resultados desta técnica de coloração multiplex podem ajudar a fornecer uma compreensão aprofundada da interação e regulação imunológica durante a implantação de embriões.

O processo esquemático global de realização de um ensaio multiplex de 4 cores para a detecção de 4 tipos de células imunes endometrial é mostrado na Figura 1. Resumindo, o protocolo para esta coloração de imunofluorescência multiplex exigiu 8 passos-chave: 1. Preparação de slides, 2. Recuperação de epitope, 3. Bloqueio, aplicação de anticorpos primários, 5. aplicação de anticorpos secundários, 6. Amplificação de sinal, 7. Remoção de anticorpos e 8. Contrastain e monta...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Apesar dos avanços na imunohistoquímica multiplex e na imagem multiespectral, caracterizar a densidade e o agrupamento das principais células imunes simultaneamente no endométrio continua sendo um desafio. Este artigo descreve um protocolo detalhado de coloração multiplex e imagens para a localização simultânea de quatro tipos de células imunes no endométrio.

Coloração imunohistoquímica fluorescente multiplexada de quatro tipos de células imunes endometrial em aborto recorrente

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

A tecnologia atual permite o uso de anticorpos criados na mesma espécie para detectar até sete marcadores. Demonstrando o procedimento estará Loucia Chan, uma técnica do laboratório. Comece preparando as lâminas de vidro embutidas de parafina fixas formalina montadas com a amostra de tecido, colocando os slides planas em um forno, para assar a 60 graus celsius com o tecido voltado para cima.Após uma hora, depila e reidratar os slides por 10 minutos cada um com a série de produtos químicos, como descrito no manuscrito. Submergir os slides em soro fisiológico tris-tampão, e depois em uma caixa de slides de plástico preenchido com uma mistura de formaldeído diluído em metanol, para corrigir as amostras. Em seguida, lave os slides duas vezes em água desionizada por dois minutos.Prossiga para a recuperação de epítope, colocando o rack de slides em uma caixa de resistência ao calor preenchida com tampão de ácido cítrico no pH 6.0. E, em seguida, colocar a caixa no micro-ondas, para aquecer os slides primeiro em 100% de potência por 50 segundos, seguido por 20 minutos com 20% de potência, para manter a mesma temperatura. Depois de enxaguar os slides em água destilada e lavar com TBST, mergulhe o slide em um frasco contendo uma solução de bloqueio de peroxidação por 10 minutos.Após a incubação, enxágue os slides em água destilada e lave com TBST, em seguida, use uma caneta de barreira hidrofóbica para marcar um limite em torno da seção tecidual na lâmina. Em seguida, enxágue o slide em TBST, cubra as seções teciduais com o tampão de bloqueio e incuba as lâminas em uma câmara umidificada por 15 minutos. Para remover os reagentes de bloqueio, primeiro incubar os slides com o anticorpo primário de interesse e, em seguida, remover o anticorpo primário lavando os slides três vezes com TBST, antes da incubação com o polímero rabanete peroxidase rotulado, anticorpo secundário.Após a incubação, lave os slides antes de aplicar a flora opala para a solução de trabalho TSA e enxágue o slide com o tampão de recuperação de antígeno. Realize a desmontagem à base de micro-ondas aquecendo os slides em tampão de recuperação de antígeno em um micro-ondas a 100% de potência, por 50 segundos, seguido por 20% de potência por 20 minutos nos recipientes seguros de micro-ondas. Depois de resfriar as amostras em temperatura ambiente por 15 minutos, enxágue os slides em água destilada e TBST e depois incubar com solução dappy por cinco minutos.Em seguida, seque o slide antes de montar com o meio de montagem apropriado. Antes de a imagem dos slides predefinir os filtros apropriados na estação de trabalho. Capture um mínimo de 10 campos para análise sob 200 vezes a ampliação.Para contar as células, clique no botão objetos de contagem na barra de passo, para exibir o painel de configurações de contagem de objetos. Se o tecido tiver sido segmentado, selecione a categoria de tecido em que os objetos devem ser encontrados. Em seguida, selecione o dimensionamento de sinal desejado a partir de escala automática ou escala fixa.Para segmentação de objetos, selecione o componente principal da lista de retirada. Para detectar objetos tocando outros objetos como objetos individuais e não combinados, verifique o tamanho máximo e a caixa de pixels e, em seguida, opte pela divisão refinada. Em seguida, conte todas as células estromas nas células imunes separadamente, para expressar os dados como as porcentagens das células imunes em relação ao número total de células estromas para cada imagem capturada.Mais tarde, informe a contagem final de células como uma média de todos os campos. Usando o editor de exibição, examine as tabelas de dados resultantes após o processamento e exporte a tabela de dados da contagem. Na análise representativa, quatro tipos de células imunes na amostra de endométrio somos diferenciados.A imagem processada mostra a segmentação tecidual como epitelial e compartimentos estrogonais. A imunosstaining multiplex foi realizada nas biópsias endometrial de uma mulher de controle fértil e uma mulher com aborto recorrente inexplicável, piso único para nós representando CD3, CD56, CD68 e CD20 foram revelados na imunostaining. Uma vez identificado o som imunológico, novas manchas sob a citocina podem ajudar a lidar com sua interação e mecanismo para o sucesso da implantação.

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