Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
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Este estudio fue apoyado por el Fondo Fiduciario Obstétrico y Ginecológico de Hong Kong en 2018 y el Fondo de Salud e Investigación Médica de Hong Kong (06170186, 07180226).

El estudio fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Clínica conjunta de la Universidad China de Hong Kong-Nuevos Territorios del Clúster Este. Se obtuvo el consentimiento informado de los participantes antes de recoger las biopsias endometriales. Consulte la sección de introducción para conocer los criterios de inclusión de los grupos de control y RM.
1. Preparación de la muestra
<ol><li>Asegúrese de que todas las mujeres en este estudio se sometan a una prueba diaria d...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. 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Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Pasos críticos dentro del protocolo Es importante tener en cuenta que la tinción multiplex requiere una optimización diligente. La recuperación de antígenos, utilizando tampón de citrato y tecnología de microondas, requiere optimización para garantizar la extracción completa de anticuerpos y mantener la viabilidad del tejido. A medida que los reactivos TSA se unen covalentemente a los sitios que rodean el antígeno, pueden inhibir potencialmente la unión de un anticuerpo primario posterior a...

El aborto espontáneo recurrente (RM) se puede definir como la pérdida de dos o más embarazos antes de las 24 semanas de gestación1. Esta condición reproductiva frecuente afecta hasta al 1% de las parejas en todo el mundo2,3. La fisiopatología es multifactorial y se puede dividir en causas impulsadas embriológicamente (principalmente debido a un cariotipo embrionario anormal) y causas impulsadas por la madre que afectan el endometrio y / o el desarrollo placentario. Esta manifestación puede ser el resultado de anomalías genéticas parentales, anomalías uterinas, afecciones protrombóticas, factores de endocrinología y trastornos inmunológicos4.
En los últimos años, la disfunción de las células inmunofectoras se ha implicado en la patogénesis de la pérdida temprana del embarazo5. Esto ha inspirado muchas investigaciones para dilucidar las poblaciones específicas de células inmunes en el endometrio durante el ciclo menstrual, la implantación y el embarazo temprano, con funciones específicas en el embarazo temprano. Entre estas células inmunes, las células asesinas naturales uterinas (uNK) juegan un papel crítico durante la implantación embrionaria y el embarazo, particularmente en los procesos de invasión trofoblástica y angiogénesis6. Los estudios han demostrado un aumento de la densidad celular uNK en el endometrio de mujeres con RM7,8,aunque este hallazgo no se asoció con un mayor riesgo de aborto espontáneo9. Sin embargo, esto estimuló la investigación que evalúa la densidad de otros tipos de células inmunes (como macrófagos, células dendríticas uterinas) en el endometrio en mujeres con RM10,11. Sin embargo, sigue siendo incierto si existe una alteración significativa en la densidad de células inmunes en el endometrio periimplantacional en mujeres con RM.
Una posible explicación para la incertidumbre es que la evaluación de la densidad de células inmunes endometriales podría ser difícil debido a los rápidos cambios en el endometrio durante la ventana de implantación. Durante el período de 24 h, cambios significativos en el endometrio alteran la densidad celular inmune y la secreción de citoquinas, introduciendo una fuente de variación en estos resultados12. Además, la mayoría de los informes se basan principalmente en el uso de tinción unicelular (por ejemplo, métodos tradicionales de IHC) que no pudieron examinar múltiples marcadores en la misma sección de tejido. Aunque la citometría de flujo se puede utilizar para detectar múltiples poblaciones celulares en una sola muestra, las grandes cantidades de células requeridas y la optimización que consume mucho tiempo dificultan la popularidad y la eficiencia de este método. Por lo tanto, el reciente avance en la tinción multiplex IHC podría resolver este problema mediante la inmunotinción de múltiples marcadores en la misma diapositiva para evaluar múltiples parámetros, incluido el linaje celular y la localización histológica de subpoblaciones inmunes individuales. Además, esta tecnología puede maximizar la información obtenida en caso de disponibilidad limitada de tejido. En última instancia, esta técnica puede ayudar a dilucidar las diferencias en las interacciones de las células inmunes en el endometrio entre las mujeres fértiles y las mujeres con RM.
Dos grupos de mujeres fueron reclutadas del Hospital Príncipe de Gales, incluidas las mujeres de control fértil (FC) y las mujeres con aborto espontáneo recurrente inexplicable (RM). El control fértil se definió como las mujeres que tuvieron al menos un nacimiento vivo sin antecedentes de aborto espontáneo, y las mujeres RM se definieron como aquellas que tenían antecedentes de abortos espontáneos consecutivos ≥2 antes de las 20 semanas de gestación. Los sujetos de los dos grupos cumplieron con los siguientes criterios de inclusión: (a) edad entre 20 y 42 años, (b) no fumador, (c) ciclo menstrual regular (25-35 días) y estructura uterina normal, (d) no uso de ningún régimen hormonal durante al menos 3 meses antes de la biopsia endometrial, (e) no hidrosalpinx por histero-salpingograma. Además, todos los sujetos reclutados tenían cariotipo normal, histerosalpingografía tridimensional normal, hormona estimulante del folículo día 2 < 10 UI / L, progesterona lútea media > 30 nmol / L, función tiroidea normal y dieron negativo para anticoagulante lúpico y anticuerpos IgG e IgM anticardiolipina.
Para comprender mejor la base inmunológica de la RM, sería más deseable cuantificar y localizar simultáneamente los principales tipos de células inmunes presentes en el endometrio en el momento de la implantación. Este artículo describe todo el protocolo desde la preparación de la muestra, la optimización multiplex con marcadores para los subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de un análisis de datos con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales. Además, este artículo describe cómo determinar la densidad y la agrupación de los tipos de células inmunes simultáneamente en el endometrio.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

La inmunohistoquímica es el método más utilizado para la identificación y visualización de antígenos tisulares en la investigación biológica y el diagnóstico clínico. Se puede utilizar para caracterizar diversos procesos biológicos o patologías, como la cicatrización de heridas, la respuesta inmune, el rechazo de tejidos y las interacciones tejido-biomaterial. Sin embargo, la visualización y cuantificación de múltiples antígenos (especialmente para las células inmunes) en una sola sección de tejido utilizando tinción inmunohistoquímica convencional (IHC) sigue siendo insatisfactoria. Por lo tanto, las tecnologías multiplexadas se introdujeron en los últimos años para identificar múltiples marcadores biológicos en una sola muestra de tejido o un conjunto de diferentes muestras de tejido. 
Estas tecnologías pueden ser especialmente útiles para diferenciar los cambios en las interacciones inmunes de célula a célula dentro del endometrio entre mujeres fértiles y mujeres con abortos espontáneos recurrentes durante la implantación. Este artículo describe un protocolo detallado para la tinción de fluorescencia multiplexada IHC para investigar la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes simultáneamente en muestras endometriales cronometradas con precisión durante la implantación embrionaria. El método incluye la preparación de muestras, la optimización multiplex con marcadores para subtipos de células inmunes y el escaneo de las diapositivas, seguido de análisis de datos, con referencia específica a la detección de células inmunes endometriales. 
Usando este método, la densidad y la agrupación de cuatro tipos principales de células inmunes en el endometrio se pueden analizar simultáneamente en una sola sección de tejido. Además, este documento discutirá los factores críticos y la solución de problemas para superar la posible interferencia de fluoróforos entre las sondas fluorescentes que se aplican. Es importante destacar que los resultados de esta técnica de tinción multiplex pueden ayudar a proporcionar una comprensión profunda de la interacción inmunológica y la regulación durante la implantación del embrión.

El proceso esquemático general de realizar un ensayo multiplex de 4 colores para la detección de 4 tipos de células inmunes endometriales se muestra en la Figura 1. En resumen, el protocolo para esta tinción de inmunofluorescencia multiplex requirió 8 pasos clave: 1. Preparación de diapositivas, 2. Recuperación de epítopos, 3. Bloqueo, 4. Aplicación de anticuerpos primarios, 5. Aplicación secundaria de anticuerpos, 6. Amplificación de señales, 7. Eliminación de anticuerpos y 8. ...

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Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

A pesar de los avances en inmunohistoquímica multiplex e imágenes multiespectrales, la caracterización de la densidad y la agrupación de las principales células inmunes simultáneamente en el endometrio sigue siendo un desafío. Este artículo describe un protocolo detallado de tinción multiplex e imágenes para la localización simultánea de cuatro tipos de células inmunes en el endometrio.

Tinción inmunohistoquímica fluorescente multiplexada de cuatro tipos de células inmunes endometriales en aborto espontáneo recurrente

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

La tecnología actual permite el uso de anticuerpos criados en la misma especie para detectar hasta siete marcadores. La demostración del procedimiento estará a cargo de Loucia Chan, técnica del laboratorio. Comience preparando los portaobjetos de vidrio incrustados de parafina fija de formalina montados con la muestra de tejido, colocando los portaobjetos planos en un horno, para hornear a 60 grados centígrados con el tejido hacia arriba.Después de una hora, descere y rehidrate las diapositivas cada 10 minutos cada una con la serie de productos químicos, como se describe en el manuscrito. Sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con tris, y luego en una caja de diapositivas de plástico llena de una mezcla de formaldehído diluido en metanol, para fijar las muestras. A continuación, lave los toboganes dos veces en agua desionizada durante dos minutos.Proceda a la recuperación del epítopo, colocando el bastidor de portaobjetos en una caja de resistencia al calor llena de tampón de ácido cítrico a pH 6.0. Y luego colocar la caja en el microondas, para calentar las diapositivas primero al 100% de potencia durante 50 segundos, seguido de 20 minutos al 20% de potencia, para mantener la misma temperatura. Después de enjuagar los portaobjetos en agua destilada y lavarlos con TBST, sumerja el portaobjetos en un frasco que contenga una solución de bloqueo de peroxidación durante 10 minutos.Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en agua destilada y lávese con TBST, luego use una pluma de barrera hidrofóbica para marcar un límite alrededor de la sección de tejido en el portaobjetos. Luego enjuague el portaobjetos en TBST, cubra las secciones de tejido con el tampón de bloqueo e incube los portaobjetos en una cámara humidificada durante 15 minutos. Para eliminar los reactivos de bloqueo, primero incube los portaobjetos con el anticuerpo primario de interés y luego elimine el anticuerpo primario lavando los portaobjetos tres veces con TBST, antes de incubarlos con el polímero de rábano picante peroxidasa marcado, anticuerpo secundario.Después de la incubación, lave las diapositivas antes de aplicar la flora opal para la solución de trabajo TSA y luego enjuague la diapositiva con el tampón de recuperación de antígenos. Realice el desmontaje basado en microondas calentando las diapositivas en el búfer de recuperación de antígenos en un microondas al 100% de potencia, durante 50 segundos, seguido de un 20% de potencia durante 20 minutos en los contenedores seguros para microondas. Después de enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 15 minutos, enjuague los portaobjetos en agua destilada y TBST y luego incube con una solución dappy durante cinco minutos.A continuación, seque al aire la corredera antes de montarla con el medio de montaje adecuado. Antes de obtener imágenes de las diapositivas, preestablezca los filtros apropiados en la estación de trabajo. Capture un mínimo de 10 campos para su análisis con un aumento de 200 veces.Para contar las celdas, haga clic en el botón contar objetos en la barra de pasos, para mostrar el panel de configuración de conteo de objetos. Si el tejido se ha segmentado, seleccione la categoría de tejido en la que se encuentran los objetos. A continuación, seleccione la escala de señal deseada de escala automática o escala fija.Para la segmentación de objetos, seleccione el componente principal en la lista desplegable. Para detectar objetos que tocan otros objetos como objetos individuales y no combinados, marque la casilla tamaño máximo y píxeles y luego opte por la división refinada. A continuación, cuente todas las células estromales en las células inmunes por separado, para expresar los datos como los porcentajes de las células inmunes en relación con el número total de células estromales para cada imagen capturada.Más tarde, informe el recuento final de celdas como un promedio de todos los campos. Con el editor de vistas, examine las tablas de datos resultantes después del procesamiento y, a continuación, exporte la tabla de datos de recuento. En el análisis representativo, se diferencian cuatro tipos de células inmunes en la muestra de endometrio.La imagen procesada muestra la segmentación tisular como compartimentos epiteliales y estromales. La inmunotinción multiplex se realizó en las biopsias endometriales de una mujer control fértil y una mujer con aborto espontáneo recurrente inexplicable, se reveló un solo piso para nosotros que representa CD3, CD56, CD68 y CD20 en la inmunotinción. Una vez que se ha identificado el sonido inmunológico, una mayor tinción debajo de la citoquina puede ayudar a abordar su interacción y mecanismo para el éxito de la implantación.

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