Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Denna studie stöddes av Hong Kong Obstetrical and Gynecological Trust Fund 2018 och Hong Kong Health and Medical Research Fund (06170186, 07180226).

Studien godkändes av Joint Chinese University of Hong Kong-New Territories East Cluster Clinical Research Ethics Committee. Informerat samtycke erhölls från deltagarna innan de samlade in endometriebiopsierna. Se introduktionsavsnittet för inkluderingskriterier för kontroll- och RM-grupperna.
1. Provberedning
<ol><li>Se till att alla kvinnor i denna studie genomgår ett dagligt urinstickstest från dag 9 av menstruationscykeln och framåt för att identifiera det luteiniserande hormonet...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Kritiska steg i protokollet Det är viktigt att notera att multiplexfärgning kräver noggrann optimering. Antigenhämtning, med hjälp av citratbuffert och mikrovågsteknik, kräver optimering för att säkerställa fullständig antikroppsborttagning och upprätthålla vävnadens livskraft. Eftersom TSA-reagenser kovalent binder till platser som omger antigenet kan de potentiellt hämma bindningen av en efterföljande primär antikropp genom steriskt hinder (även känt som "paraplyeffekten"). Detta ...

Återkommande missfall (RM) kan definieras som förlust av två eller flera graviditeter före 24 veckors graviditet1. Detta frekventa reproduktiva tillstånd påverkar upp till 1% av par över hela världen2,3. Patofysiologi är multifaktoriell och kan delas in i embryologiskt drivna orsaker (främst på grund av en onormal embryonal karyotyp) och moderns drivna orsaker som påverkar livmoderslemhinnan och/eller placental utveckling. Denna manifestation kan bero på föräldrarnas genetiska avvikelser, livmoderavvikelser, protrobotiska tillstånd, endokrinologiska faktorer och immunologiska störningar4.
Under de senaste åren har immuneffektorcelldysfunktion varit inblandad i patogenesen vid tidig graviditetsförlust5. Detta har inspirerat många undersökningar för att klargöra de specifika populationerna av immunceller i livmoderslemhinnan under menstruationscykeln, implantation och tidig graviditet, med specifika roller i tidig graviditet. Bland dessa immunceller spelar livmoderns naturliga mördarceller (uNK) en kritisk roll under embryoimplantation och graviditet, särskilt i processerna för trofolastisk invasion och angiogenes6. Studier har visat en ökad uNK celltäthet i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM7,8, även om detta fynd inte var förknippat med en ökad risk för missfall9. Detta stimulerade dock forskning som utvärderade densiteten hos andra immuncelltyper (såsom makrofager, livmoder dendritiska celler) i livmoderslemhinnan hos kvinnor med RM10,11. Det är dock fortfarande osäkert om det finns en betydande förändring i immuncellens densitet i peri-implantation endometrium hos kvinnor med RM.
En möjlig förklaring till osäkerheten är att utvärdering av endometrie immuncell densitet kan vara svårt på grund av de snabba förändringarna i livmoderslemhinnan under fönstret av implantation. Under tidsramen på 24 timmar förändrar signifikanta förändringar i endometrium immuncellens densitet och cytokinsekreation, vilket introducerar en källa till variation i dessa resultat12. Dessutom är de flesta rapporter huvudsakligen beroende av användning av encellsfärgning (t.ex. traditionella IHC-metoder) som inte kunde undersöka flera markörer på samma vävnadssektion. Även om flödescytometri kan användas för att upptäcka flera cellpopulationer i ett enda prov, hindrar de stora mängder celler som krävs och den tidskrävande optimeringen populariteten och effektiviteten hos denna metod. Därför kan den senaste utvecklingen i multiplex IHC färgning lösa detta problem genom att immunstaining flera markörer på samma bild för att utvärdera flera parametrar, inklusive cell härstamning och histologiska lokalisering av enskilda immun subpopulationer. Vidare kan denna teknik maximera den information som erhålls vid begränsad vävnad tillgänglighet. I slutändan kan denna teknik hjälpa till att klargöra skillnaderna i immuncellinteraktioner i livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med RM.
Två grupper av kvinnor rekryterades från Prince of Wales Hospital, inklusive fertila kontroll kvinnor (FC) och kvinnor med oförklarliga återkommande missfall (RM). Fertil kontroll definierades som kvinnor som hade minst en levande födsel utan någon historia av spontana missfall, och RM kvinnor definierades som de som hade en historia av ≥2 på varandra följande missfall före 20 veckor dräktighet. Försökspersonerna från de två grupperna uppfyllde följande inklusionskriterier: a) ålder mellan 20 och 42 år, b) icke-rökare, c) regelbunden menstruationscykel (25-35 dagar) och normal livmoderstruktur, d) ingen användning av någon hormonell regim under minst 3 månader före endometriebiopsi, e) ingen hydrosalpinx med hystero-salpingogram. Dessutom hade alla ämnen som rekryterats normala karyotypning, normala 3-dimensionella ultrasonography hysterosalpingogram, dag 2 follikelstimulerande hormon < 10 IE/L, mid-luteal progesteron > 30 nmol/L, normala sköldkörteln funktion och testat negativt för lupus antikoagulantia och antikardiolipin IgG och IgM antikroppar.
För att bättre förstå den immunologiska grunden för RM, skulle det vara mest önskvärt att samtidigt kvantifiera och lokalisera de stora immuncelltyperna som finns i livmoderslemhinnan vid implantationstillfället. Detta dokument beskriver hela protokollet från provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller. Dessutom beskriver detta dokument hur man bestämmer densiteten och klustring av immuncelltyperna samtidigt i livmoderslemhinnan.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

Immunohistokemi är den vanligaste metoden för identifiering och visualisering av vävnadsantigener inom biologisk forskning och klinisk diagnostik. Det kan användas för att karakterisera olika biologiska processer eller patologier, såsom sårläkning, immunsvar, vävnadsavstötning och vävnad-biomaterial interaktioner. Visualisering och kvantifiering av flera antigener (särskilt för immunceller) i en enda vävnad avsnitt med konventionella immunohistochemical (IHC) färgning är dock fortfarande otillfredsställande. Därför introducerades multiplexerad teknik under de senaste åren för att identifiera flera biologiska markörer i ett enda vävnadsprov eller en ensemble av olika vävnadsprover. 
Dessa tekniker kan vara särskilt användbara för att skilja förändringarna i immun cell-till-cell interaktioner inom livmoderslemhinnan mellan fertila kvinnor och kvinnor med återkommande missfall under implantation. Detta dokument beskriver ett detaljerat protokoll för multiplexed fluorescence IHC färgning att undersöka densitet och kluster av fyra stora immun celltyper samtidigt i exakt tidsbestämma endometrie exemplar under embryo implantation. Metoden inkluderar provberedning, multiplexoptimering med markörer för immuncellsundertyper och skanning av bilderna, följt av dataanalys, med specifik hänvisning till att upptäcka endometrie immunceller. 
Med denna metod kan densiteten och klustring av fyra stora immuncelltyper i livmoderslemhinnan samtidigt analyseras i en enda vävnadssektion. Dessutom kommer detta dokument att diskutera de kritiska faktorerna och felsökningen för att övervinna eventuella fluoroforstörningar mellan de fluorescerande sonder som appliceras. Viktigt är att resultaten från denna multiplexfärgningsteknik kan bidra till att ge en djupgående förståelse för den immunologiska interaktionen och regleringen under embryoimplantation.

Den övergripande schematiska processen att utföra en 4-färgs multiplexanalys för detektion av 4 endometrie immuncelltyper visas i figur 1. I korthet krävde protokollet för denna multiplex immunofluorescensfärgning 8 viktiga steg: 1. Glidberedning, 2. Epitope retrieval, 3. Blockering, 4. Primär antikroppsapplikation, 5. Sekundär antikroppsapplikation, 6. Signalförstärkning, 7. Avlägsnande av antikroppar och 8. Mottain och montering. Bildåtergivning och analys utfördes sedan med ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Trots framstegen inom multiplex immunohistochemistry och multispektral imaging, känneteckna densitet och kluster av stora immunceller samtidigt i livmoderslemhinnan är fortfarande en utmaning. Detta dokument beskriver en detaljerad multiplex färgning protokoll och imaging för samtidig lokalisering av fyra immun cell typer i livmoderslemhinnan.

Multiplexerad fluorescerande immunohistokemisk färgning av fyra endometrie immuncelltyper vid återkommande missfall

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Den nuvarande tekniken gör det möjligt att använda antikroppar som odlas i samma art för att upptäcka upp till sju markörer. Loucia Chan, en tekniker från laboratoriet, demonstrerar proceduren. Börja med att förbereda formalin fast paraffin inbäddade glasglasglas som är monterade med vävnadsprovet, genom att placera bilderna platt i en ugn, för att baka vid 60 grader celsius med vävnaden vänd uppåt.Efter en timme avvaxar och återfuktar du rutschkanorna per 10 minuter vardera med kemikalieserien, som beskrivs i manuskriptet. Dränka bilderna i trisbuffrad saltlösning, och sedan i en plastrutschbana fylld med en blandning av formaldehyd utspädd i metanol, för att fixa proverna. Tvätta sedan rutschkanorna två gånger i avjoniserat vatten i två minuter.Fortsätt med epitophämtning genom att placera gallret med diabilder i en värmebeständighetslåda fylld med citronsyrabuffert vid pH 6.0. Och sedan placera lådan i mikrovågsugnen, för att värma rutschkanorna först vid 100% effekt i 50 sekunder, följt av 20 minuter vid 20% effekt, för att bibehålla samma temperatur. Efter sköljning av rutschkanorna i destillerat vatten och tvättat med TBST, sänk ned bilden i en burk som innehåller en peroxideringsblockeringslösning i 10 minuter.Efter inkubationen sköljer du rutschkanorna i destillerat vatten och tvättar med TBST och använd sedan en hydrofobisk barriärpenna för att markera en gräns runt vävnadssektionen på glidbanan. Skölj sedan bilden i TBST, täck vävnadssektionerna med blockeringsbufferten och inkubera bilderna i en fuktad kammare i 15 minuter. För att avlägsna de blockerande reagenserna, inkubera först bilderna med den primära antikroppen av intresse och ta sedan bort den primära antikroppen genom att tvätta bilderna tre gånger med TBST, före inkubation med polymerradishperoxidas märkt, sekundär antikropp.Efter inkubationen, tvätta bilderna innan du applicerar Opal flora för TSA arbetslösning och skölj sedan bilden med antigenhämtningsbufferten. Utför den mikrovågsbaserade strippningen genom att värma rutschkanorna i antigenhämtningsbuffert i en mikrovågsugn med 100 % effekt, i 50 sekunder, följt av 20 % effekt i 20 minuter i mikrovågssäkra behållare. Efter kylning av proverna i rumstemperatur i 15 minuter, skölj rutschkanorna i destillerat vatten och TBST och inkubera senare med dappylösning i fem minuter.Lufttorka sedan glidbanan innan den monteras med lämpligt monteringsmedium. Innan bilderna avbildningen förinställs lämpliga filter på arbetsstationen. Fånga minst 10 fält för analys under 200 gånger förstoring.Om du vill räkna cellerna klickar du på knappen Räkna objekt i stegfältet för att visa panelen inställningar för objekträkning. Om vävnaden har segmenterats väljer du den vävnadskategori där objekten ska hittas. Välj sedan önskad signalskalning från automatisk skalning eller fast skala.För objektsegmentering väljer du den primära komponenten i listrutan. Om du vill upptäcka objekt som rör andra objekt som enskilda och inte kombinerade objekt markerar du rutan maximal storlek och pixlar och väljer sedan den raffinerade delningen. Räkna sedan alla stromala celler i immuncellerna separat för att uttrycka data som procentandelar av immuncellerna i förhållande till det totala antalet stromalceller för varje fångad bild.Rapportera senare det slutliga cellantalet som ett genomsnitt av alla fält. Använd visningsredigeraren och undersök de resulterande datatabellerna efter bearbetningen och exporterar sedan datatabellen antal. I den representativa analysen, fyra immuncellstyper i livmoderslemhinnan är vi differentierade.Den bearbetade bilden visar vävnadssegmentering som epitelial och stromala fack. Multiplex immunostaining utfördes på endometriebiopsier från en bördig kontroll kvinna och en kvinna med oförklarliga återkommande missfall, enda våningen för oss som representerar CD3, CD56, CD68 och CD20 avslöjades i immunostaining. När immunljudet har identifierats kan ytterligare färgning under cytokinen hjälpa till att hantera deras interaktion och mekanism för implantation framgång.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

Beredning av 2-dGuo-behandlade Thymus Organ kulturer

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Levande cell imaging av F-aktin Dynamics via Fluorescent Speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Hela montering Immunhistokemisk Analys för Embryonala Limb Skin kärlsystemet: ett modellsystem för studier Vascular Avgrening morfogenes i Embryo

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Analys av encelliga gentranskription av RNA-lysrör<em&gt; In Situ</em&gt; Hybridisering (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Separation av spermatogenesisk celltyper med STA-PUT Velocity Sedimente

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Genetisk Barcoding med fluorescerande proteiner för Multiplexade Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Kvantifiering av proteinuttryck och samlokalisering Använda Multiplex Immuno-histokemisk färgning och multispektrala

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Utveckling av en in Co-kultur system av två Cellular typer i frånvaro av cell-cellkontakt

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Isolering och transkriptomanalys av växtcelltyper

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

Karakterisering av zinktransportörer hos däggdjur med hjälp av en in vitro zinktransportanalys

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...