Name: multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage
Uploaded: 2021-08-04T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Bu çalışma 2018 yılında Hong Kong Kadın Hastalıkları ve Doğum Güven Fonu ve Hong Kong Sağlık ve Tıbbi Araştırma Fonu (06170186, 07180226) tarafından desteklendi.

Çalışma, Hong Kong Ortak Çin Üniversitesi-Yeni Bölgeler Doğu Kümesi Klinik Araştırma Etik Komitesi tarafından onaylandı. Endometriyal biyopsiler toplanmadan önce katılımcılardan bilgilendirilmiş onam alındı. Denetim ve RM gruplarının dahil edilme ölçütleri için giriş bölümüne bakın.
1. Numune hazırlama
<ol><li>Bu çalışmadaki tüm kadınların yumurtlamayı tespit etmek için luteinize edici hormon (LH) dalgalanmasını tanımlamak için adet döngüsünün 9...

<ol>
	<li>ESHRE Guideline Group on RPL et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESHRE+guideline:+recurrent+pregnancy+loss.">ESHRE guideline: recurrent pregnancy loss.</a> Human Reproduction Open. 2018 (2), 004 (2018).</li><li>Stirrat, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 336 (8716), 673-675 (1990).</li><li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+investigation+and+treatment+of+couples+with+recurrent+first-trimester+and+second-trimester+miscarriage.+Green-top+Guideline+No.+17.">The investigation and treatment of couples with recurrent first-trimester and second-trimester miscarriage. Green-top Guideline No. 17.</a> Royal College of Obstetricians &amp; Gynaecologists. , (2011).</li><li>King, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Uterine+leukocytes+and+decidualization.">Uterine leukocytes and decidualization.</a> Human Reproduction Update. 6 (1), 28-36 (2000).</li><li>Le Bouteiller, P., Piccinni, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+NK+cells+in+pregnant+uterus:+why+there.">Human NK cells in pregnant uterus: why there.</a> American Journal of Reproductive Immunology. 59 (5), 401-406 (2008).</li><li>Lash, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardisation+of+uterine+natural+killer+(uNK)+cell+measurements+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+reproductive+failure.">Standardisation of uterine natural killer (uNK) cell measurements in the endometrium of women with recurrent reproductive failure.</a> Journal of Reproductive Immunology. 116, 50-59 (2016).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HOXA-10+and+E-cadherin+expression+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+implantation+failure+and+recurrent+miscarriage.">HOXA-10 and E-cadherin expression in the endometrium of women with recurrent implantation failure and recurrent miscarriage.</a> Fertility and Sterility. 107 (1), 136-143 (2017).</li><li>Tuckerman, E., Laird, S. M., Prakash, A., Li, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+the+measurement+of+uterine+natural+killer+cells+in+the+endometrium+of+women+with+recurrent+miscarriage.">Prognostic value of the measurement of uterine natural killer cells in the endometrium of women with recurrent miscarriage.</a> Human Reproduction. 22 (8), 2208-2213 (2007).</li><li>Jasper, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage-derived+LIF+and+IL1B+regulate+alpha(1,2)fucosyltransferase+2+(Fut2)+expression+in+mouse+uterine+epithelial+cells+during+early+pregnancy.">Macrophage-derived LIF and IL1B regulate alpha(1,2)fucosyltransferase 2 (Fut2) expression in mouse uterine epithelial cells during early pregnancy.</a> Biology of Reproduction. 84 (1), 179-188 (2011).</li><li>Kopcow, H. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+apoptosis+at+the+maternal-fetal+interface+in+early+human+pregnancy,+involvement+of+galectin-1.">T cell apoptosis at the maternal-fetal interface in early human pregnancy, involvement of galectin-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (47), 18472-18477 (2008).</li><li>Johnson, P. M., Christmas, S. E., Vince, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+aspects+of+implantation+and+implantation+failure.">Immunological aspects of implantation and implantation failure.</a> Human Reproduction. 14, 26-36 (1999).</li><li>Hong, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+fluorescent+immunohistochemical+staining,+imaging,+and+analysis+in+histological+samples+of+lymphoma.">Multiplexed fluorescent immunohistochemical staining, imaging, and analysis in histological samples of lymphoma.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (143), e58711 (2019).</li><li>Carstens, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+computation+of+intratumoral+T+cells+correlates+with+survival+of+patients+with+pancreatic+cancer.">Spatial computation of intratumoral T cells correlates with survival of patients with pancreatic cancer.</a> Nature Communications. 8, 15095 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+multiplex+staining+to+measure+the+density+and+clustering+of+four+endometrial+immune+cells+around+the+implantation+period+in+women+with+recurrent+miscarriage:+comparison+with+fertile+controls.">The use of multiplex staining to measure the density and clustering of four endometrial immune cells around the implantation period in women with recurrent miscarriage: comparison with fertile controls.</a> Journal of Molecular Histology. 51 (5), 593-603 (2020).</li></ol>

Protokol içinde kritik adımlar Multipleks boyamanın gayretli optimizasyon gerektirdiğini belirtmek önemlidir. Sitrat tampon ve mikrodalga teknolojisini kullanan antijen alımı, tam antikor sıyırmasını sağlamak ve doku canlılığını korumak için optimizasyon gerektirir. TSA reaktifleri antijeni çevreleyen bölgelere kovalent olarak bağladıklarından, sterik engel ("şemsiye etkisi" olarak da bilinir) yoluyla sonraki primer antikorun bağlanmasını potansiyel olarak engelleyebilirler....

Tekrarlayan düşük (RM), 24 haftalık gebelik1'denönce iki veya daha fazla gebenin kaybı olarak tanımlanabilir. Bu sık üreme durumu dünya çapında çiftlerin% 1'ini etkiler2,3. Patofizyoloji multifaktöriyeldir ve embriyolojik olarak yönlendirilen nedenlere (esas olarak anormal embriyonik karyotip nedeniyle) ve endometrium ve/veya plasenta gelişimini etkileyen doğum odaklı nedenlere ayrılabilir. Bu tezahür ebeveyn genetik anormallikleri, rahim anomalileri, protropombotik durumlar, endokrinoloji faktörleri ve immünolojik bozukluklardan kaynaklanabilir4.
Son yıllarda, immün efektör hücre disfonksiyonu erken gebelik kaybının patogenezine bulaşmıştır5. Bu, adet döngüsü, implantasyon ve erken gebelik sırasında endometriyumdaki spesifik bağışıklık hücrelerinin popülasyonlarını, erken gebelikte belirli rollerle aydınlatıcı birçok araştırmaya ilham vermiştir. Bu bağışıklık hücreleri arasında, uterus doğal öldürücü (uNK) hücreler embriyo implantasyonu ve gebelik sırasında, özellikle trofoblastik invazyon ve anjiogenez süreçlerinde kritik bir rol oynar6. Çalışmalar RM7,8ile kadınların endometriumunda artan bir uNK hücre yoğunluğu göstermiştir , ancak bu bulgu düşük riskinin artmasıyla ilişkili değildi9. Bununla birlikte, bu RM10,11olan kadınlarda endometriyumdaki diğer bağışıklık hücresi türlerinin (makrofajlar, uterus dendritik hücreler gibi) yoğunluğunu değerlendiren araştırmayı teşvik etti. Bununla birlikte, RM'li kadınlarda peri implantasyon endometriyumunda bağışıklık hücre yoğunluğunda önemli bir değişiklik olup olmadığı belirsizliğini korumaktadır.
Belirsizliğin olası bir açıklaması, implantasyon penceresi sırasında endometriyumdaki hızlı değişiklikler nedeniyle endometriyal immün hücre yoğunluğunun değerlendirilmesinin zor olabileceğidir. 24 saat boyunca, endometriyumdaki önemli değişiklikler bağışıklık hücre yoğunluğunu ve sitokin salgısını değiştirir ve bu sonuçlarda bir varyasyon kaynağı12. Buna ek olarak, çoğu rapor esas olarak aynı doku bölümündeki birden fazla belirteci inceleyemeyen tek hücreli boyamanın (örneğin geleneksel IHC yöntemleri) kullanımına dayanır. Akış sitometrisi tek bir örnekte birden fazla hücre popülasyonunu tespit etmek için kullanılabilse de, gerekli olan büyük miktarda hücre ve zaman alıcı optimizasyon bu yöntemin popülaritesini ve verimliliğini engeller. Bu nedenle, multipleks IHC boyamadaki son gelişme, hücre soyu ve bireysel immün subpopulasyonların histolojik lokalizasyonu da dahil olmak üzere birden fazla parametreyi değerlendirmek için aynı slayttaki birden fazla belirteci immünostaining yaparak bu sorunu çözebilir. Ayrıca, bu teknoloji sınırlı doku kullanılabilirliği durumunda elde edilen bilgileri en üst düzeye çıkarabilir. Sonuçta, bu teknik, doğurgan kadınlar ve RM'li kadınlar arasındaki endometriyumdaki bağışıklık hücresi etkileşimlerindeki farklılıkların aydınlatıcı olmasına yardımcı olabilir.
Prince of Wales Hastanesi'nden doğurgan kontrol kadınları (FC) ve açıklanamayan tekrarlayan düşük (RM) olan kadınlar da dahil olmak üzere iki grup kadın işe alındı. Doğurganlık kontrolü, spontan düşük öyküsü olmadan en az bir canlı doğum yapan kadınlar, RM kadınları ise 20 haftalık gebelikten önce art arda ≥2 düşük öyküsü olanlar olarak tanımlandı. İki gruptan denekler aşağıdaki dahil etme kriterlerini karşılar: (a) 20 ila 42 yaş arası yaş, (b) sigara içmeyen, (c) düzenli adet döngüsü (25-35 gün) ve normal rahim yapısı, (d) Endometriyal biyopsiden önce en az 3 ay hormonal rejim kullanılmaması, (e) histerik-salpingogram ile hidrosalpinks kullanılmaması. Buna ek olarak, işe alınan tüm deneklerde normal karyotiping, normal 3 boyutlu ultrasonografi histerikalpingogram, 2. gün folikül uyarıcı hormon < 10 IU/L, orta luteal progesteron > 30 nmol/L, normal tiroid fonksiyonu vardı ve lupus antikoagülan ve antikardiyolinilin IgG ve IgM antikorları için negatif test edildi.
RM'nin immünolojik temelini daha iyi anlamak için, implantasyon sırasında endometriyumda bulunan başlıca immün hücre tiplerinin aynı anda ölçülmesi ve lokalize edilmesi en çok arzu edilir. Bu makalede, numune hazırlamadan tüm protokol, bağışıklık hücresi alt tipleri için belirteçlerle çoklama optimizasyonu ve slaytların taranmasının ardından endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespitine özel referanslı veri analizi açıklanmaktadır. Ayrıca, bu makalede endometriyumda aynı anda bağışıklık hücre tiplerinin yoğunluğunun ve kümelenmesi nasıl belirlenecektir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Amplification Diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1498</td>
			<td>Fluorophore diluent buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody diluent</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARD1001EA</td>
			<td>Diluting the antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M3072</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>CM004B</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD56</td>
			<td>Leica</td>
			<td>NCL-CD56-504</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD68</td>
			<td>Spring Bioscience</td>
			<td>M5510</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citrate Buffer Solution, pH 6.0 (10x)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB64214</td>
			<td>Antigen retrieval solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMSURE Xylene (isomeric mixture)</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108297</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol absolute</td>
			<td>Merck</td>
			<td>107017</td>
			<td>Ethyl alcohol for rehydration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoCore BIOCUT Manual Rotary Leica Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>RM2125RTS</td>
			<td>Sectioning of paraffin-embedded tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inForm Advanced Image Analysis Software</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>inForm&#174; Tissue Finder Software 2.2.1 (version 14.0)</td>
			<td>Data Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mantra&#174; Workstation</td>
			<td>Akoya Biosciences</td>
			<td>CLS140089</td>
			<td>Spectral imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>Inverter</td>
			<td>Microwave stripping</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1487A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 620</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1495A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 650</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1496A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1497A</td>
			<td>Appropriate tyramide based fluorescent reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>U10</td>
			<td>Dewaxing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peroxidase Blocking Solution</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>S2023</td>
			<td>Removal of tissue peroxidase activities</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine coated slide</td>
			<td>FISHER SCIENTIFIC</td>
			<td>120-550-15</td>
			<td>Slide for routine histological use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PolyHRP Broad Spectrum</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>ARH1001EA</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong&#8482; Gold Antifade Mountant</td>
			<td>ThemoFisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>Mounting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatstat</td>
			<td>/</td>
			<td>Version 2.1-0</td>
			<td>Spatial point pattern analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spectral DAPI</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>FP1490A</td>
			<td>Nucleic acid staining</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Processor</td>
			<td>Thermo Fischer</td>
			<td>Excelsior ES</td>
			<td>Tissue processing for dehydration and paraffination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Buffer Saline (TBS), 10x</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>12498S</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1370-1L</td>
			<td>Nonionic detergent</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

multiplexed fluorescent immunohistochemical staining of four endometrial immune cell types in recurrent miscarriage

İmmünohistokimizma, biyolojik araştırma ve klinik tanılarda doku antijenlerinin tanımlanması ve görselleştirilmesinde en sık kullanılan yöntemdir. Yara iyileşmesi, immün yanıt, doku reddi ve doku-biyomalzeme etkileşimleri gibi çeşitli biyolojik süreçleri veya patolojileri karakterize etmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, konvansiyonel immünohistokimyasal (IHC) boyama kullanılarak tek bir doku bölümünde birden fazla antijenin (özellikle bağışıklık hücreleri için) görselleştirilmesi ve nicelemesi tatmin edici değildir. Bu nedenle, son yıllarda tek bir doku örneğinde veya farklı doku örneklerinden oluşan bir toplulukta birden fazla biyolojik belirteci tanımlamak için çoklayıcı teknolojiler tanıtıldı. 
Bu teknolojiler özellikle implantasyon sırasında tekrarlayan düşükleri olan doğurgan kadınlar ve kadınlar arasında endometriyum içindeki bağışıklık hücresi-hücre etkileşimlerindeki değişiklikleri ayırt etmede yararlı olabilir. Bu makalede, embriyo implantasyonu sırasında tam olarak zamanlanmış endometriyal örneklerde aynı anda dört ana immün hücre tipinin yoğunluğunu ve kümelenmeyi araştırmak için çok faktörlü floresan IHC boyama için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır. Yöntem, örnek hazırlama, immün hücre alt tipleri için belirteçlerle multipleks optimizasyonu ve endometriyal bağışıklık hücrelerinin tespit edilmesine özel referansla slaytların taranmasını ve ardından veri analizini içerir. 
Bu yöntem kullanılarak, endometriyumdaki dört ana immün hücre tipinin yoğunluğu ve kümelenmesi aynı anda tek bir doku bölümünde analiz edilebilir. Buna ek olarak, bu makalede, uygulanan floresan problar arasındaki olası florofor parazitinin üstesinden gelmek için kritik faktörler ve sorun giderme tartışılacaktır. Daha da önemlisi, bu multipleks boyama tekniğinden elde edilen sonuçlar, embriyo implantasyonu sırasında immünolojik etkileşimin ve regülasyonun derinlemesine anlaşılmasına yardımcı olabilir.

4 endometriyal immün hücre tipinin tespiti için 4 renkli multipleks test gerçekleştirmenin genel şematik süreci Şekil 1'de gösterilmiştir. Kısacası, bu multipleks immünofluoresans boyama protokolü 8 temel adım gerektiriyordu: 1. Slayt hazırlama, 2. Epitope alma, 3. Engelleme, 4. Birincil antikor uygulaması, 5. İkincil antikor uygulaması, 6. Sinyal amplifikasyonu, 7. Antikorun çıkarılması ve 8. Karşıtlık ve montaj. Görüntü işleme ve analiz daha sonra endometrium ...

Watch this Scientific Journal Video about Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage at JoVE.com

Multiplexed Fluorescent Immunohistochemical Staining of Four Endometrial Immune Cell Types in Recurrent Miscarriage

Multipleks immünhistokimya ve multispektral görüntülemedeki gelişmelere rağmen, endometriyumda aynı anda majör immün hücrelerin yoğunluğunu ve kümelenişini karakterize etmek bir zorluk olmaya devam etmektedir. Bu makalede, endometriyumdaki dört immün hücre tipinin eşzamanlı lokalizasyonu için ayrıntılı bir multipleks boyama protokolü ve görüntüleme açıklanmaktadır.

Tekrarlayan Düşükte Dört Endometriyal İmmün Hücre Tipinin Çok Yönlü Floresan İmmünohistokimyasal Boyanması

Immunohistochemistry is the most commonly used method for the identification and visualization of tissue antigens in biological research and clinical ...

Mevcut teknoloji, yedi işaretleyiciye kadar tespit etmek için aynı türlerde yetiştirilen antikorların kullanılmasına izin verir. Prosedürü gösteren loucia Chan, laboratuvardan bir teknisyen. Doku örneğine monte edilmiş formalin sabit parafin gömülü cam slaytları hazırlayarak, slaytları bir fırına düz bir şekilde yerleştirerek, doku yukarı bakacak şekilde 60 santigrat derecede pişirmek için başlayın.Bir saat sonra, el yazmasında açıklandığı gibi, her biri 10 dakikada bir kimyasallar dizisiyle slaytları cilalayın ve yeniden sulayın. Slaytları tris tamponlu salinlere batırın ve ardından numuneleri düzeltmek için metanol ile seyreltilmiş formaldehit karışımı ile dolu plastik bir slayt kutusuna koyun. Ardından, slaytları iki dakika boyunca deiyonize suda iki kez yıkayın.Slayt rafını pH 6.0'da sitrik asit tamponu ile dolu bir ısı direnci kutusuna yerleştirerek epitope alımına devam edin. Ve sonra kutuyu mikrodalga fırına yerleştirin, slaytları ilk önce 50 saniye boyunca% 100 güçte ısıtmak için, ardından aynı sıcaklığı korumak için% 20 güçte 20 dakika. Slaytları damıtılmış suda duruladıktan ve TBST ile yıkadıktan sonra, slaytı 10 dakika boyunca peroksidasyon engelleme çözeltisi içeren bir kavanoza daldırin.Kuluçkadan sonra, slaytları damıtılmış suda durulayın ve TBST ile yıkayın, ardından slayttaki doku bölümünün etrafındaki bir sınırı işaretlemek için hidrofobik bir bariyer kalemi kullanın. Daha sonra slaydı TBST'de durulayın, doku bölümlerini blokaj tamponu ile örtün ve slaytları nemlendirilmiş bir odada 15 dakika boyunca kuluçkaya bırakın. Bloklama reaktiflerini çıkarmak için, önce slaytları birincil ilgi antikoru ile kuluçkaya yatırın ve daha sonra ikincil antikor etiketli polimer yaban turpu peroksidaz etiketli inkübasyondan önce slaytları TBST ile üç kez yıkayarak birincil antikoru çıkarın.Kuluçkadan sonra, TSA çalışma çözeltisi için Opal florasını uygulamadan önce slaytları yıkayın ve ardından slaydı antijen alma tamponu ile durulayın. Mikrodalga tabanlı sıyırma, mikrodalgada antijen alma tamponundaki slaytları mikrodalgada % 100 güçte, 50 saniye boyunca ısıtarak ve ardından mikrodalga güvenli kaplarda 20 dakika boyunca% 20 güçte ısıtarak mikrodalga bazlı sıyırma gerçekleştirin. Numuneleri oda sıcaklığında 15 dakika soğutun, slaytları damıtılmış suda ve TBST'de durulayın ve daha sonra dappy çözeltisi ile beş dakika kuluçkaya yatırın.Daha sonra uygun montaj ortamı ile monte etmeden önce kaydırağı havayla kurulayın. Slaytların görüntülenmesinden önce, iş istasyonundaki uygun filtreleri önceden ayarlar. 200 kat büyütme altında analiz için en az 10 alan yakalayın.Hücreleri saymak için, nesne sayma ayarları panelini görüntülemek üzere adım çubuğundaki nesneleri say düğmesini tıklatın. Doku parçalanmışsa, nesnelerin bulunacağı doku kategorisini seçin. Ardından otomatik ölçekleme veya sabit ölçekten istediğiniz sinyal ölçeklendirmesini seçin.Nesne segmentasyonu için, açılan listeden birincil bileşeni seçin. Diğer nesnelere dokunan nesneleri tek tek ve birleşik olmayan nesneler olarak algılamak için, en büyük boyut ve piksel kutusunu işaretleyin ve ardından rafine bölmeyi seçin. Daha sonra, verileri yakalanan her görüntü için toplam stromal hücre sayısına göre bağışıklık hücrelerinin yüzdeleri olarak ifade etmek için bağışıklık hücrelerindeki tüm stromal hücreleri ayrı ayrı sayın.Daha sonra, son hücre sayısını tüm alanların ortalaması olarak bildirin. Görünüm düzenleyicisini kullanarak, işlem sonrası elde edilen veri tablolarını inceleyin ve sonra sayım veri tablosunu dışarı verin. Temsili analizde, endometrium örneğinde dört bağışıklık hücresi tipi farklılaştırıldı.İşlenen görüntü doku segmentasyonunu epitel ve stromal bölmeler olarak gösterir. Multiplks immünostaining, doğurgan bir kontrol kadınından endometriyal biyopsiler üzerinde yapıldı ve açıklanamayan tekrarlayan düşük yapan bir kadın, bizim için CD3, CD56, CD68 ve CD20'yi temsil eden tek kat immünostainingde ortaya çıktı. Bağışıklık sesi belirlendikten sonra, sitokin altında daha fazla lekelenme, implantasyon başarısı için etkileşimlerini ve mekanizmalarını ele almaya yardımcı olabilir.

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Biology

Unit 1

The Endocrine System

SCIENTISTS IN ACTION

Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures

2-dGuo Boyalı Thymus Organ Kültürleri hazırlanması

In the thymus, interactions between developing T-cell precursors and stromal cells that include cortical and medullary epithelial cells are known to play ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Floresan üzerinden F-aktin Dynamics Canlı Hücre Görüntüleme speckle Mikroskopi (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Whole-mount Immunohistochemical Analysis for Embryonic Limb Skin Vasculature: a Model System to Study Vascular Branching Morphogenesis in Embryo

Embriyonik Ekstremite Cilt damarları Tüm montaj İmmünohistokimyasal Analizi: Embriyo vasküler dallanma Morphogenesis Eğitim Model Sistemi

Whole-mount immunohistochemical analysis for imaging the entire vasculature is pivotal for understanding the cellular mechanisms of branching ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

STA-PUT Hız Sedimentasyon kullanma spermatogenic Hücre Tiplerinin Ayrılması

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Multiplexed Uygulamaları için Floresan Proteinleri ile Genetik Barkodlama

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development of an Insert Co-culture System of Two Cellular Types in the Absence of Cell-Cell Contact

Hücre-Hücre İletişim Yokluğunda iki Hücresel Türleri Ekleme Co-kültür Sisteminin Geliştirilmesi

The role of secreted soluble factors in the modification of cellular responses is a recurrent theme in the study of all tissues and systems. In an attempt ...

Isolation and Transcriptome Analysis of Plant Cell Types

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

In multicellular organisms, developmental programming and environmental responses can be highly divergent in different cell types or even within cells, ...

Investigating Zinc Transport Mechanism in Mammalian Cells with FluoZin-3 Assay

Characterizing Mammalian Zinc Transporters Using an In Vitro Zinc Transport Assay

Exploring Cellular Zinc Regulation Through ZnT1 Functionality (Video) | JoVE

İn Vitro Çinko Taşıma Testi Kullanılarak Memeli Çinko Taşıyıcılarının Karakterize Edilmesi

Transition metals such as Zn2+ ions must be tightly regulated due to their cellular toxicity. Previously, the activity of Zn2+ transporters was measured ...