Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

نشكر ستيفاني شيرماير و تاكيشي إيواتسوبو على توفير سلالات دروسوفيلا. كما نشكر باتريشيا جانسما على مساعدتها في التصوير في مارلي إيماج كور في جامعة أريزونا. تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة NIH NS091299، NS115514 (إلى DCZ)، زمالة HHMI جيليام (إلى EM) وبرنامج أبحاث البيولوجيا الجامعية (إلى HB).

وأبلغ عن الذباب المعدل وراثيا من نوع UAS FLII12Pglu-700μδ6 في فولكنهوف وآخرون10، وكرم الدكتور س. شيرماير بتقديمه. تم توفير خطوط UAS TDP-43G298S المعدلة وراثيا من قبل الدكتور ت. إيواتسوبو13. تم إنشاء خطوط Drosophila المؤتلفة التي تؤوي كلا من UAS FLII12Pglu-700μδ6 وUAS TDP-43 transgenes في مختبر ...

<ol>
	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43,+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9.">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li><li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43.">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li><li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain.">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).</li><li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors.">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

ويمكن تطبيق هذه التقنية الموضحة بالتفصيل هنا لقياس امتصاص الجلوكوز في نوع معين من الخلايا من الاهتمام في Drosophila الحية باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، وهو جهاز استشعار FRET القائم الذي يمكن الكشف عن التغيرات في مستويات الجلوكوز إلى نطاق ميليمولار10،11،<sup class="xre...

التصلب الجانبي الضموري (ALS) هو اضطراب تنكسي عصبي تدريجي غير قابل للشفاء حاليا. ALS يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية مما يؤدي إلى فقدان التنسيق الحركي, الشلل الذي لا رجعة فيه, فشل الجهاز التنفسي, والموت في نهاية المطاف في غضون 2-5 سنوات من التشخيص1. ويرتبط ALS مع العيوب الأيضية مثل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض (استعرضت في2); ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه التعديلات في التمثيل الغذائي إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. القاسم المشترك في ALS والأمراض العصبية التنكسية ذات الصلة هو TDP-43 ، وهو بروتين ملزم حمض النوى تشارك في عدة خطوات من تجهيز الحمض النووي الريبي3،4،5. على الرغم من أن الطفرات في TDP-43 تؤثر فقط على 3٪ -5٪ من المرضى، تم العثور على بروتين TDP-43 البري من النوع داخل المجاميع السيتوبلازمية في >97٪ من حالات ALS (تمت مراجعتها في6). وقد تم تصميم هذا المرض في Drosophila عن طريق الإفراط في التعبير عن النمط البري البشري أو TDP-43 المتحولة (G298S) في الخلايا العصبية الحركية ، والتي تلخص جوانب متعددة من ALS ، بما في ذلك التضمين السيتوبلازمي ، والخلل الحركي وانخفاض عمر7،8. باستخدام هذه النماذج, أفيد مؤخرا أن اعتلال البروتين TDP-43 يسبب زيادة كبيرة في مستويات بيروفات وفوسففروكوكيناز (PFK) مرنا, معدل الحد من انزيم تحلل9. تم العثور على زيادات مماثلة في نصوص PFK في الخلايا العصبية الحركية المشتقة من المريض والحبل الشوكي ، مما يشير إلى أن انحلال الجليكوليسيس يتم تنظيمه في سياق اعتلال البروتين TDP-43. ومن المثير للاهتمام أن زيادة أخرى في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعبات الغذائية والجينية خففت من العديد من الأنماط الظاهرية ل ALS مثل الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43 ، بما يتفق مع آلية تعويضية واعصاب في تتدهور الخلايا العصبية الحركية.
لمزيد من التغييرات التحقيق في انحلال الجليكوليسيس وقياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43، تم التعبير عن جهاز استشعار مشفرة وراثيا سابقا FRET المستندة FLII12Pglu-700μδ610 في الخلايا العصبية الحركية على وجه التحديد باستخدام نظام التعبير UAS-GAL4. يستخدم مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 نقل الطاقة بالرنين بين متغيرين من البروتين الفلوري الأخضر، بروتينات الفلورسنت السماوي والأصفر (CFP و YFP) للكشف عن الجلوكوز على المستوى الخلوي. وهو يتألف من مجال ملزم الجلوكوز البكتيرية من الجين E. coli MglB تنصهر على CFP وYFP على طرفي نقيض من الجزيء. عندما ملزمة جزيء الجلوكوز، وأجهزة الاستشعار يخضع لتغيير تشكيلي جلب CFP وYFP أقرب معا والسماح FRET أن يحدث، والتي يمكن استخدامها بعد ذلك لتحديد مستويات الجلوكوز داخل الخلايا10،11،12 ( الشكل1). هنا، نعرض كيف يمكن استخدام مستشعر FLII12Pglu-700μδ6 لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز الناجمة عن اعتلال البروتين TDP-43 في الخلايا العصبية الحركية. التجارب الموصوفة هنا تبين أن الإفراط في التعبير عن متحولة المرتبطة ALS, TDP-43G298S, في الخلايا العصبية الحركية يسبب زيادة كبيرة في امتصاص الجلوكوز بالمقارنة مع الضوابط. ويمكن استخدام هذا النهج في أنواع أخرى من ALS (مثل، SOD1، C9orf72، الخ) و / أو أنواع الخلايا الأخرى (مثل غليا، العضلات) لتحديد التغيرات في امتصاص الجلوكوز المرتبطة بالتنكس العصبي.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

التصلب الجانبي الضموري هو اضطراب تنكسي عصبي يسبب ضعف العضلات التدريجي والموت في غضون 2-5 سنوات بعد التشخيص. المظاهر السريرية تشمل فقدان الوزن, ديسليبيديميا, وفرط الأيض; ومع ذلك، فإنه لا يزال من غير الواضح كيف ترتبط هذه إلى انحطاط الخلايا العصبية الحركية. باستخدام نموذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43 الذي يلخص العديد من ميزات ALS بما في ذلك إدراج السيتوبلازمي ، والخلل الحركي ، وانخفاض العمر ، حددنا مؤخرا عجزا استقلابيا واسع النطاق. ومن بين هذه العوامل، تبين أن التحليل الجليكولي منظم وأن تجارب التفاعل الجيني قدمت أدلة على وجود آلية تعويضية لاعصاب. في الواقع ، على الرغم من تنظيم فوسبهوفروكتوكيناز ، وهو معدل يحد من الإنزيم في انحلال الجليكوليسيس ، فقد ثبت أن زيادة في تحليل الجليكوليسيس باستخدام التلاعب الغذائي والجيني تخفف من الخلل الحركي وزيادة العمر الافتراضي في نماذج ذبابة اعتلال البروتين TDP-43. لمزيد من التحقيق في تأثير على اعتلال البروتين TDP-43 على تدفق الجليكوليك في الخلايا العصبية الحركية، تم استخدام جهاز استشعار مشفر وراثيا، FRET المستندة إلى، FLII12Pglu-700μδ6. يتكون هذا المستشعر من مجال استشعار الجلوكوز البكتيري والبروتينات الفلورية السماوي والأصفر كزوج FRET. عند ربط الجلوكوز ، يخضع المستشعر لتغيير تشكيلي يسمح بحدوث FRET. باستخدام FLII12Pglu-700μδ6، تم العثور على امتصاص الجلوكوز أن تكون زيادة كبيرة في الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43G298S،وهو البديل المسببة ALS. هنا، نعرض كيفية قياس امتصاص الجلوكوز، ex vivo، في مستحضرات الحبل العصبي البطني اليرقات التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز FLII12Pglu-700μδ6 في سياق اعتلال البروتين TDP-43. يمكن استخدام هذا النهج لقياس امتصاص الجلوكوز وتقييم التدفق الجليكوليكي في أنواع مختلفة من الخلايا أو في سياق الطفرات المختلفة التي تسبب المرض والاضطرابات العصبية التنكسية ذات الصلة.

الحصول على صورة من جهاز استشعار الجلوكوز في الحبل العصبي البطني (VNC)، ex vivo لتحديد الاختلافات في امتصاص الجلوكوز في نموذج Drosophila من ALS على أساس TDP-43 ، تم استخدام مستشعر الجلوكوز المشفر وراثيا القائم على FRET. يتألف جهاز الاستشعار CFP وYFP تنصهر في مجال ربط الجلوكوز من ...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

يتم زيادة امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية Drosophila المتضررة من بروتين تار ملزمة الحمض النووي (TDP-43) اعتلال البروتين، كما هو مبين من قبل FRET القائم، ومستشعر الجلوكوز المشفرة وراثيا.

قياس امتصاص الجلوكوز في نماذج Drosophila من اعتلال البروتين TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

هذه التقنية مهمة لأنها يمكن أن تقيس امتصاص الجلوكوز في خلايا محددة في أنسجة دروسوفيلا الحية. يوفر المستشعر القائم على FRET مقياسا مباشرا للتغيرات في مستويات الجلوكوز داخل الخلايا. تسمح هذه التقنية للباحثين بتقييم التغيرات في مستويات الجلوكوز في الوقت الحقيقي، داخل الخلايا العصبية الحركية الحية من نماذج ALS مقابل عناصر التحكم.جانب التحدي هو تصوير نفس المجموعة من الخلايا العصبية بعد تغيير المخزن المؤقت. ترك العينة على المجهر يساعد على ضمان أن VMC يتحرك أقل قدر ممكن. قبل البدء في تشريح بدوره على المجهر التصوير وأشعة الليزر.ثم جمع تجول اليرقة نجمة الثالثة، شطفه بالماء المقطر مزدوجة ووضعها في قطرة من العازلة HL3 على طبق اصطف الاستومر المعدة سابقا. بعد ذلك تحت مجهر تشريح ، استخدم زوجا من ملقط لتثبيت النهايات الأمامية والخلفية لليرقة ، الجانب الظهري لأعلى ، عن طريق تمديد طول اليرقة بعناية مع دبابيس الحشرات. باستخدام زوج من مقص إيريس الزاوية، وجعل شق فقط فوق دبوس الخلفي.ثم جعل قطع عمودي من شق نحو الطرف الأمامي من اليرقة. بعد إضافة بضع قطرات من العازلة HL3 إذا لزم الأمر، وإزالة القصبة الهوائية وبقية الأعضاء العائمة دون إزعاج الجهاز العصبي المركزي. ثم دبوس اللوحات، وتمتد جدار الجسم لفضح الجهاز العصبي المركزي مع الحفاظ على الجهاز العصبي العضلي سليمة.للحصول على الصورة، استخدم المجهر البؤري المستقيم مع عدسة غمر الماء 40 مرة. ثم حدد ليزر نانومتر 405 لإثارة CFP. بعد ذلك، قم بتحسين معلمات الامتلاك مثل سرعة المسح الضوئي، والمتوسط، والهدف، وحجم الثقب التكبير، والدقة المكانية.ضبط كسب بحيث تكون الإشارة في النطاق الديناميكي الأمثل واستخدام نفس المعلمات لجميع الأنماط الجينية. لتصوير الخلايا العصبية الحركية داخل سلك العصب البطني، ضع طبق السيليكون مع العينة المتشرحية تحت العدسة وخفض العدسة بحيث يأتي في اتصال مع العازلة HL3 السكروز trehalose. تأكد من أن العدسة مغمورة بالكامل في المخزن المؤقت وإضافة المزيد من المخزن المؤقت إذا لزم الأمر. مقبل.باستخدام قنوات CFP و FRET ، حدد يدويا اختيارا بصريا يتكون من ست خلايا عصبية محركية على الأقل في التركيز تقع على طول خط منتصف سلك العصب البطني. ثم الحصول على الصور كل 10 ثانية لمدة 10 دقائق. تمثل هذه الصور خط الأساس.لتحفيز الجلوكوز، قم بإزالة السكروز تريهالوز التي تحتوي على العازلة HL3 باستخدام ماصة باستور وإضافة خمسة جلوكوز ملليمولار تكمل HL3 العازلة دون تحريك الحبل العصبي البطني. ثم الحصول على الصور كل 10 ثوان لمدة 10 دقائق أخرى. تمثل هذه الصور مرحلة التحفيز.حفظ الصور كملفات CZI أو أي نوع ملف مدعوم من قبل برنامج التصوير مع اسم ملف بما في ذلك التاريخ والخلفية الوراثية والحالة التجريبية والقنوات المستخدمة. إعادة استخدام المعلمات لتصوير كافة الأنماط الجينية. لمعالجة الصور فتح برنامج التصوير فيجي-ImageJ، ثم فتح الملفات CZI، واختيار عرض المكدس مع كومة فرط ووضع اللون لتعيين مقياس رمادي وحدد تقسيم القنوات إلى نوافذ منفصلة. مقبل.معالجة الصور باستخدام الانجراف تصحيح المكونات الإضافية، توربو ريج وريج المكدس. يتم تصحيح كل قناة بشكل منفصل عن طريق تحديد رص الرص تحت المكونات الإضافية ثم اختيار التحويل إلى الترجمة. اختر يدويا المناطق ذات الاهتمام أو ROIs عن طريق تتبع جميع الخلايا العصبية الحركية التي لا تزال في التركيز على مدى سلسلة زمنية كاملة.ثم استخدم مدير عائد الاستثمار لحفظ كل مخطط الخلايا العصبية الحركية. استخدم دالة القياس المتعدد لقياس متوسط القيمة الرمادية في كل عائد استثمار في كل نقطة زمنية. ثم نسخ ROIs تتبع من القناة الأولى إلى القناة الثانية لصورة التحفيز المسبق.لتحليل البيانات، حساب FRET بواسطة CFP نسبة باستخدام القيم الرمادية المتوسطة لقنوات FRET وCFP. تعكس التغيرات في نسب FRET بواسطة CFP التعديلات في تركيز الجلوكوز داخل الخلايا. ثم رسم FRET بنسب CFP لكل عائد الاستثمار ونقطة زمنية مقابل الوقت.تم استخدام مستشعر الجلوكوز المشفر وراثيا FRET لقياس امتصاص الجلوكوز في الخلايا العصبية الحركية. عندما الجلوكوز غير ملزمة للاستشعار، يسبب الإثارة CFP انبعاثات CFP فقط. وعندما يرتبط الجلوكوز، يمكن الكشف عن إشارة YFP بسبب FRET التي تحدث بين CFP و YFP.تظهر هنا صور إشارات FRET و CFP في عناصر التحكم في مستشعر الجلوكوز في الخلايا العصبية المتحولة TDP-43 في ظل ظروف خط الأساس والتحفيز. ويرد بيان الخلايا العصبية الحركية ممثل في كل صورة كمثال على العائد على الاستثمار. عند تحفيز الجلوكوز، والسيطرة على الخلايا العصبية الحركية التعبير عن أجهزة استشعار الجلوكوز، وتظهر زيادة طفيفة في امتصاص الجلوكوز في حين أظهرت الخلايا العصبية التي تعبر عن TDP-43 امتصاص الجلوكوز أعلى بكثير.تم تطبيع مزيد من FRET من نسب CFP من الخلايا العصبية الحركية المتحولة TDP-43 إلى ضوابط استشعار الجلوكوز في كل نقطة زمنية. وفي ظل ظروف خط الأساس، لم يكن هناك فرق بين الأنماط الجينية. ومع ذلك ، عند تحفيز الجلوكوز ، لوحظت زيادة سريعة وكبيرة في امتصاص الجلوكوز في المسوخ TDP-43 مقارنة بالتحكم.في تمثيل الرسم البياني الشريطي ، أظهر تحفيز الجلوكوز في الخلايا العصبية التي تعبر عن مستشعر الجلوكوز زيادة صغيرة ولكنها كبيرة في FRET بنسبة CFP مقارنة بخط الأساس. في المقابل أظهرت الخلايا العصبية التي تعبر عن TDP-43 زيادة كبيرة في النسبة عند التحفيز مقارنة بخط الأساس. الفرق الصافي في FRET بنسب CFP بين الخلايا العصبية الحركية التي تعبر عن TDP-43 ومستشعر الجلوكوز حوالي 10.9٪ إدارة الوقت أمر بالغ الأهمية لهذا الإجراء بحيث لا تموت الخلايا العصبية على مدار التصوير.من المهم تصوير التشريح مباشرة لتجنب ذلك. سلطت هذه التقنية الضوء على أهمية استقلاب الجلوكوز في الخلايا العصبية وقادت مجموعتنا إلى مزيد من التحقيق في دور انحلال الجليكوليسيس في تجديد الخلايا العصبية الحركية.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

يعاير الحركي ، والتعلم ، والذاكرة في العجز ذبابة الفاكهة نماذج من تنكس عصبي

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Measuring Motor Coordination in Mice

قياس التناسق الحركي في الفئران

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

تصور في Proprioceptors<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات وشرانق

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

و، الفحص السلوكية قابلة غير مكلفة لقياس الإيثانول التخدير الحساسية والتسامح السريع في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

قياس وتغيير التزاوج محرك في ذكر<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

قياس الالتقام حويصلة متشابك في الخلايا العصبية هيبوكامبال مثقف

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

تقييم التوازن تتميز في الفئران باستخدام التحليل اللوني السائل عالي الأداء وامتصاص الدوبامين سينابتوسومال

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

بيولوجيا الخلية كمية من نيوروديجينيريشن في المورفولوجية من خلال تحليل غير منحازة للبروتينات فلوريسسينتلي المعلمة باستخدام إيماجيج

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

الغمر البديل في الجلوكوز لإنتاج فرط السكر في الدم لفترات طويلة في زيبرافيش

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

تحديد شبه كمي لكثافة الخلايا العصبية الدوبامين في Substantia Nigra من نماذج القوارض باستخدام تحليل الصورة الآلي

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...