Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

We bedanken Stefanie Schirmeier en Takeshi Iwatsubo voor het leveren van Drosophila-soorten. We bedanken ook Patricia Jansma voor het assisteren bij beeldvorming in de Marley Imaging Core aan de Universiteit van Arizona. Dit werk werd gefinancierd door National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (naar DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (naar EM) en het Undergraduate Biology Research Program (naar HB).

De UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgene vliegen werden gemeld in Volkenhoff et al.10 en vriendelijk verstrekt door Dr. S. Schirmeier. De UAS TDP-43G298S transgene lijnen werden vriendelijk geleverd door Dr. T. Iwatsubo13. Recombinante Drosophila-lijnen met zowel UAS FLII12Pglu-700μδ6- als UAS TDP-43-transgenen werden gegenereerd in het Zarnescu-laboratorium met behulp van standaard genetische benaderingen en gerapporteerd in Manzo et al....

<ol>
	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43,+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9.">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li><li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43.">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li><li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain.">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).</li><li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors.">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

De hier in detail beschreven techniek kan worden toegepast om de glucoseopname te meten in een specifiek celtype van belang in levende Drosophila met behulp van FLII12Pglu-700μδ6, een fret-gebaseerde sensor die veranderingen in glucosespiegels kan detecteren tot een millimolair bereik10,11,12. Deze sensor is eerder gebruikt in combinatie met het UAS-GAL4-systeem om de expressie ervan te richten op specifieke celtypen,...

Amyotrofische Laterale Sclerose (ALS) is een progressieve neurodegeneratieve aandoening die momenteel ongeneeslijk is. ALS beïnvloedt de bovenste en onderste motorneuronen, wat leidt tot verlies van motorische coördinatie, onomkeerbare verlamming, ademhalingsfalen en uiteindelijke dood binnen 2-5 jaar na diagnose1. ALS wordt geassocieerd met metabole defecten zoals gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme (beoordeeld in2); het blijft echter onduidelijk hoe deze veranderingen in het metabolisme zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Een gemene deler bij ALS en gerelateerde neurodegeneratieve ziekten is TDP-43, een nucleïnezuurbindend eiwit dat betrokken is bij verschillende stappen van RNA-verwerking3,4,5. Hoewel mutaties in TDP-43 slechts 3%-5% van de patiënten treffen, wordt wild-type TDP-43-eiwit gevonden in cytoplasmatische aggregaten in >97% van de ALS-gevallen (beoordeeld in6). Deze pathologie werd gemodelleerd in Drosophila door overexpressie van het menselijke wildtype of mutant TDP-43 (G298S) in motorneuronen, die meerdere aspecten van ALS samenvatten, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur7,8. Met behulp van deze modellen werd onlangs gemeld dat TDP-43 proteïnopathie een significante toename van pyruvaatspiegels en fosfoructokinase (PFK) mRNA veroorzaakt, het snelheidsbeperkende enzym glycolyse9. Vergelijkbare toenames in PFK-transcripten werden gevonden in patiënt-afgeleide motorneuronen en ruggenmerg, wat suggereert dat glycolyse upregulated is in de context van TDP-43 proteïnopathie. Interessant is dat een verdere toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties verschillende ALS-fenotypen zoals locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43-proteïnopathie verminderde, consistent met een compenserend, neuroprotectief mechanisme in degenererende motorneuronen.
Om veranderingen in glycolyse verder te onderzoeken en de glucoseopname in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie te meten, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde sensor FLII12Pglu-700μδ610 uitgedrukt in motorneuronen specifiek met behulp van het UAS-GAL4-expressiesysteem. De FLII12Pglu-700μδ6 glucosesensor maakt gebruik van resonantie-energieoverdracht tussen twee varianten van groen fluorescerend eiwit, cyaan en gele fluorescerende eiwitten (CFP en YFP) om glucose op cellulair niveau te detecteren. Het bestaat uit een bacterieel glucosebindend domein van het E. coli MglB-gen gefuseerd met CFP en YFP aan tegenovergestelde uiteinden van het molecuul. Wanneer de sensor aan een glucosemolecuul wordt gebonden, ondergaat deze een conformatieverandering die CFP en YFP dichter bij elkaar brengt en FRET mogelijk maakt, die vervolgens kan worden gebruikt om intracellulaire glucosespiegels10,11,12 te kwantificeren(figuur 1). Hier laten we zien hoe de FLII12Pglu-700μδ6-sensor kan worden gebruikt om veranderingen in glucoseopname veroorzaakt door TDP-43-proteïnopathie in motorneuronen te bepalen. De hier beschreven experimenten tonen aan dat overexpressie van een ALS-geassocieerde mutant, TDP-43G298S, in motorneuronen een significante toename van de glucoseopname veroorzaakt in vergelijking met controles. Deze aanpak kan worden gebruikt in andere soorten ALS (bijv. SOD1, C9orf72, enz.) en/of andere celtypen (bijv. glia, spieren) om veranderingen in glucoseopname geassocieerd met neurodegeneratie te bepalen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

Amyotrofische laterale sclerose is een neurodegeneratieve aandoening die progressieve spierzwakte en de dood veroorzaakt binnen 2-5 jaar na de diagnose. Klinische manifestaties omvatten gewichtsverlies, dyslipidemie en hypermetabolisme; het blijft echter onduidelijk hoe deze zich verhouden tot degeneratie van motorneuronen. Met behulp van een Drosophila-model van TDP-43-proteïnopathie dat verschillende kenmerken van ALS samenvat, waaronder cytoplasmatische insluitsels, locomotorische disfunctie en verminderde levensduur, hebben we onlangs brede metabole tekorten geïdentificeerd. Onder deze bleek glycolyse upregulated te zijn en genetische interactie-experimenten leverden bewijs voor een compenserend neuroprotectief mechanisme. Inderdaad, ondanks upregulatie van fosfoofructokinase, het snelheidsbeperkende enzym in glycolyse, werd aangetoond dat een toename van glycolyse met behulp van voedings- en genetische manipulaties locomotorische disfunctie en verhoogde levensduur in vliegmodellen van TDP-43 proteïnopathie. Om het effect op TDP-43 proteïnopathie op glycolytische flux in motorneuronen verder te onderzoeken, werd een eerder gerapporteerde genetisch gecodeerde, OP FRET gebaseerde sensor, FLII12Pglu-700μδ6, gebruikt. Deze sensor bestaat uit een bacterieel glucose-sensing domein en cyaan en gele fluorescerende eiwitten als het FRET-paar. Bij glucosebinding ondergaat de sensor een conformatieverandering waardoor FRET kan optreden. Met behulp van FLII12Pglu-700μδ6 bleek de glucoseopname significant verhoogd te zijn in motorneuronen die TDP-43G298Stot expressie brengen, een ALS-veroorzakende variant. Hier laten we zien hoe de glucoseopname ex vivokan worden gemeten in larvale ventrale zenuwstrengpreparaten die de glucosesensor FLII12Pglu-700μδ6 tot expressie brengen in de context van TDP-43-proteïnopathie. Deze benadering kan worden gebruikt om de glucoseopname te meten en de glycolytische flux te beoordelen in verschillende celtypen of in de context van verschillende mutaties die ALS en gerelateerde neurodegeneratieve aandoeningen veroorzaken.

Beeldacquisitie van de glucosesensor in het ventrale zenuwkoord (VNC), ex vivo Om verschillen in glucoseopname te bepalen in een Drosophila-model van ALS op basis van TDP-43, werd een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde glucosesensor gebruikt. De sensor bestond uit CFP en YFP gefuseerd met het glucosebindende domein van het E. coli MglB-gen. Glucosebinding veroorzaakt een conformatieverandering, die kan worden gedetecteerd door fluorescentieresonantie-ene...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Glucoseopname is verhoogd in Drosophila motorneuronen die worden beïnvloed door TAR DNA-bindend eiwit (TDP-43) proteïnopathie, zoals aangegeven door een FRET-gebaseerde, genetisch gecodeerde glucosesensor.

Glucoseopname meten in Drosophila-modellen van TDP-43-proteïnopathie

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Deze techniek is belangrijk omdat het de glucoseopname in specifieke cellen in levende Drosophila-weefsels kan meten. De FRET-gebaseerde sensor biedt een directe meting van veranderingen in intracellulaire glucosespiegels. Deze techniek stelt onderzoekers in staat om veranderingen in glucosespiegels in realtime te evalueren, binnen levende motorneuronen van ALS-modellen versus controles.Een uitdagend aspect is het in beeld brengen van dezelfde set neuronen na het veranderen van de buffer. Het achterlaten van het monster op de microscoop helpt ervoor te zorgen dat de VMC zo min mogelijk beweegt. Voordat u begint, schakelt u de beeldvormingsmicroscoop en lasers in.Verzamel vervolgens een zwervende derde instar-larve, spoel deze af met dubbel gedestilleerd water en plaats deze in een druppel HL3-buffer op een eerder bereide met elastomeer beklede schaal. Gebruik vervolgens onder een ontleedmicroscoop een tang om de voorste en achterste uiteinden van de larve vast te pinnen, dorsale zijde naar boven, door de larve voorzichtig in de lengte uit te rekken met insectenpennen. Maak met een schuine Irisschaar een incisie net boven de achterste speld.Maak vervolgens een verticale snede van de incisie naar het voorste uiteinde van de larve. Na het toevoegen van een paar druppels HL3-buffer indien nodig, verwijdert u de luchtpijp en de rest van de zwevende organen zonder het centrale zenuwstelsel te verstoren. Pin vervolgens de flappen vast en strek de lichaamswand uit om het centrale zenuwstelsel bloot te leggen terwijl het neuromusculaire systeem intact blijft.Gebruik voor beeldacquisitie een rechtopstaande confocale microscoop met een 40 keer wateronderdompelingslens. Selecteer vervolgens de 405 nanometer laser om het GVB te prikkelen. Optimaliseer vervolgens de acquisitieparameters zoals scansnelheid, gemiddelde, objectief, zoom pinhole-grootte en ruimtelijke resolutie.Pas de versterking zodanig aan dat het signaal zich in het optimale dynamische bereik bevindt en gebruik dezelfde parameters voor alle genotypen. Om motorneuronen in beeld te brengen in het ventrale zenuwkoord, plaatst u de siliconenschaal met het ontleedde monster onder de lens en laat u de lens zakken zodat deze in contact komt met de trehalose sucrose HL3-buffer. Zorg ervoor dat de lens volledig ondergedompeld is in de buffer en voeg indien nodig meer buffer toe. Volgend.Selecteer met behulp van de CFP- en FRET-kanalen handmatig een optische selectie bestaande uit ten minste zes motorneuronen in focus langs de middellijn van de ventrale zenuwstreng. Verkrijg vervolgens elke 10 seconden gedurende 10 minuten afbeeldingen. Deze afbeeldingen vertegenwoordigen de basislijn.Verwijder voor glucosestimulatie de trehalose sucrose die HL3-buffer bevat met behulp van een Pasteur-pipet en voeg vijf millimolaire glucose aangevulde HL3-buffer toe zonder de ventrale zenuwstreng te verplaatsen. Verkrijg vervolgens elke 10 seconden afbeeldingen gedurende nog eens 10 minuten. Deze beelden vertegenwoordigen de stimulatiefase.Sla de afbeeldingen op als CZI-bestanden of elk bestandstype dat wordt ondersteund door de beeldvormingssoftware met een bestandsnaam inclusief datum, genetische achtergrond, experimentele toestand en gebruikte kanalen. Hergebruik de parameters om alle genotypen in beeld te brengen. Voor beeldverwerking opent u de Fiji-ImageJ-beeldvormingssoftware, opent u vervolgens de CZI-bestanden, kiest u weergavestack met hyperstack en stelt u de kleurmodus in op grijsschaal en selecteert u gesplitste kanalen in afzonderlijke vensters. Volgend.Verwerk de beelden met behulp van driftcorrectie plug-ins, turbo reg en stack reg. Elk kanaal wordt afzonderlijk gecorrigeerd door stack reg te selecteren onder plug-ins en vervolgens transformatie naar vertaling te kiezen. Kies handmatig de interessante regio's of ROI's door alle motorneuronen te traceren die gedurende de hele tijdreeks scherp blijven.Gebruik vervolgens de ROI-manager om elk motorneuronoverzicht op te slaan. Gebruik de multifunctionele functie om de gemiddelde grijswaarde in elke ROI op elk tijdstip te meten. Kopieer vervolgens de ROI's die van het eerste kanaal naar het tweede kanaal zijn getraceerd voor het prestimulatiebeeld.Bereken voor gegevensanalyse de FRET per CFP-verhouding met behulp van de gemiddelde grijswaarden voor de FRET- en CFP-kanalen. Veranderingen in de FRET per CFP-verhouding weerspiegelen veranderingen in de intracellulaire glucoseconcentratie. Plot vervolgens FRET op CFP-ratio's voor elke ROI en elk tijdspunt versus tijd.Een genetisch gecodeerde FRET-gebaseerde glucosesensor werd gebruikt om de glucoseopname in motorneuronen te meten. Wanneer glucose niet aan de sensor is gebonden, veroorzaakt CFP-excitatie alleen CFP-emissie. En wanneer glucose bindt, kan het YFP-signaal worden gedetecteerd als gevolg van FRET tussen CFP en YFP.Hier zijn beelden te zien van FRET- en CFP-signalen in glucosesensorcontroles in TDP-43-mutante neuronen onder baseline- en stimulatieomstandigheden. Een representatief motorneuron wordt in elke afbeelding geschetst als een voorbeeld van ROI. Bij glucosestimulatie vertonen controlemotorneuronen die glucosesensoren tot expressie brengen een kleine toename van de glucoseopname, terwijl neuronen die TDP-43 tot expressie brengen een significant hogere glucoseopname vertoonden.Verdere FRET by CFP-verhoudingen van TDP-43 gemuteerde motorneuronen werden genormaliseerd tot glucosesensorcontroles op elk tijdstip. Onder baseline omstandigheden was er geen verschil tussen de genotypen. Bij glucosestimulatie werd echter een snelle en significante toename van de glucoseopname waargenomen bij TDP-43-mutanten in vergelijking met de controle.In een staafdiagramweergave toonde glucosestimulatie in neuronen die de glucosesensor tot expressie brachten een kleine maar significante toename van FRET per CFP-verhouding in vergelijking met de basislijn. Neuronen die TDP-43 tot expressie brachten, vertoonden daarentegen een significante toename van de verhouding bij stimulatie in vergelijking met de uitgangswaarde. Het netto verschil in FRET by CFP-verhoudingen tussen motorneuronen die TDP-43 en glucosesensor tot expressie brengen, is ongeveer 10,9% Tijdmanagement is van cruciaal belang voor deze procedure, zodat de neuronen niet sterven in de loop van de beeldvorming.Het is belangrijk om onmiddellijk na dissecties een afbeelding op te stellen om dit te voorkomen. Deze techniek benadrukte het belang van glucosemetabolisme in neuronen en heeft onze groep ertoe gebracht de rol van glycolyse in motorneuronregeneratie verder te onderzoeken.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Het testen van Beweegwijzer, leren en geheugen Tekortkomingen in Drosophila Modellen van Neurodegeneratie

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Meten Coördinatie Motor in Muizen

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisatie van proprioceptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven en poppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Een goedkope, Scalable Behavioral Test voor het meten Ethanol Sedatie Gevoeligheid en Rapid Tolerantie in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Het meten en de wijziging van Mating Drive in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Meten van Synaptic vesikel endocytose in gekweekte Hippocampal neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Beoordeling van Dopaminerge homeostase in muizen door gebruik van High-performance Liquid Chromatography analyse en Synaptosomal Dopamine opname

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Kwantitatieve celbiologie van neurodegeneratie in Drosophila door onbevooroordeelde analyse van Fluorescently Tagged eiwitten met behulp van ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Alternatieve onderdompeling in glucose om langdurige hyperglykemie bij zebravissen te produceren

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Semi-kwantitatieve bepaling van dopaminerge neurondichtheid in de substantia Nigra van knaagdiermodellen met behulp van geautomatiseerde beeldanalyse

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...