Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
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Nous remercions Stefanie Schirmeier et Takeshi Iwatsubo d’avoir fourni des souches de drosophiles. Nous remercions également Patricia Jansma d’avoir aidé à l’imagerie dans le Marley Imaging Core de l’Université de l’Arizona. Ce travail a été financé par les National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (à DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (à EM) et le undergraduate Biology Research Program (à HB).

Les mouches transgéniques UAS FLII12Pglu-700μδ6 ont été signalées dans Volkenhoff et al.10 et aimablement fournies par le Dr S. Schirmeier. Les lignées transgéniques UAS TDP-43G298S ont été aimablement fournies par le Dr T. Iwatsubo13. Des lignées recombinantes de drosophiles abritant à la fois des transgènes UAS FLII12Pglu-700μδ6 et UAS TDP-43 ont été générées dans le laboratoire Zarnescu en utilisant des approches génétiques stand...

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	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

La technique décrite en détail ici peut être appliquée pour mesurer l’absorption du glucose dans un type cellulaire spécifique d’intérêt chez la drosophile vivante en utilisant FLII12Pglu-700μδ6, un capteur basé sur FRET qui peut détecter les changements dans les niveaux de glucose à une gamme millimolaire10,11,12. Ce capteur a déjà été utilisé en conjonction avec le système UAS-GAL4 pour cibler so...

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative progressive qui est actuellement incurable. La SLA affecte les motoneurones supérieurs et inférieurs entraînant une perte de coordination motrice, une paralysie irréversible, une insuffisance respiratoire et la mort éventuelle dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic1. La SLA est associée à des défauts métaboliques tels que la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme (examinés en2); cependant, on ne sait toujours pas comment ces altérations du métabolisme sont liées à la dégénérescence des motoneurones. Un dénominateur commun dans la SLA et les maladies neurodégénératives connexes est le TDP-43, une protéine de liaison aux acides nucléiques impliquée dans plusieurs étapes du traitement de l’ARN3,4,5. Bien que les mutations du TDP-43 n’affectent que 3% à 5% des patients, la protéine TDP-43 de type sauvage se trouve dans les agrégats cytoplasmiques dans >97% des cas de SLA (examinés dans6). Cette pathologie a été modélisée chez la drosophile par surexpression de type sauvage humain ou de TDP-43 mutant (G298S) dans les motoneurones, qui récapitule de multiples aspects de la SLA, notamment les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite7,8. En utilisant ces modèles, il a été récemment rapporté que la protéinopathie TDP-43 provoque une augmentation significative des niveaux de pyruvate et d’ARNm phosphofructokinase (PFK), l’enzyme limitant le taux de glycolyse9. Des augmentations similaires des transcriptions de PFK ont été trouvées dans les motoneurones et la moelle épinière dérivés du patient, suggérant que la glycolyse est régulée à la hausse dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Fait intéressant, une augmentation supplémentaire de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques a atténué plusieurs phénotypes de la SLA tels que le dysfonctionnement locomoteur et l’augmentation de la durée de vie dans les modèles de mouche de la protéinopathie TDP-43, compatible avec un mécanisme neuroprotecteur compensatoire dans les motoneurones en dégénérescence.
Pour sonder davantage les changements dans la glycolyse et mesurer l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéinopathie TDP-43, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment FLII12Pglu-700μδ610 a été exprimé dans les motoneurones spécifiquement en utilisant le système d’expression UAS-GAL4. Le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 utilise le transfert d’énergie par résonance entre deux variantes de protéines fluorescentes vertes, les protéines fluorescentes cyan et jaunes (CFP et YFP) pour détecter le glucose au niveau cellulaire. Il s’agit d’un domaine de liaison au glucose bactérien du gène E. coli MglB fusionné à CFP et YFP aux extrémités opposées de la molécule. Lorsqu’il est lié à une molécule de glucose, le capteur subit un changement conformationnel rapprochant CFP et YFP et permettant à FRET de se produire, qui peut ensuite être utilisé pour quantifier les niveaux de glucose intracellulaire10,11,12 ( Figure1). Ici, nous montrons comment le capteur FLII12Pglu-700μδ6 peut être utilisé pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose causés par la protéinopathie TDP-43 dans les motoneurones. Les expériences décrites ici montrent que la surexpression d’un mutant associé à la SLA, TDP-43G298S,dans les motoneurones provoque une augmentation significative de l’absorption de glucose par rapport aux témoins. Cette approche peut être utilisée dans d’autres types de SLA (p. ex. SOD1, C9orf72, etc.) et/ou d’autres types de cellules (p. ex. glie, muscles) pour déterminer les changements dans l’absorption du glucose associés à la neurodégénérescence.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

La sclérose latérale amyotrophique est une maladie neurodégénérative provoquant une faiblesse musculaire progressive et la mort dans les 2 à 5 ans suivant le diagnostic. Les manifestations cliniques comprennent la perte de poids, la dyslipidémie et l’hypermétabolisme; cependant, on ne sait toujours pas comment ceux-ci sont liés à la dégénérescence des motoneurones. En utilisant un modèle de drosophile de la protéopathie TDP-43 qui récapitule plusieurs caractéristiques de la SLA, y compris les inclusions cytoplasmiques, le dysfonctionnement locomoteur et la durée de vie réduite, nous avons récemment identifié de vastes déficits métaboliques. Parmi ceux-ci, la glycolyse s’est avérée être régulée à la hausse et les expériences d’interaction génétique ont fourni des preuves d’un mécanisme neuroprotecteur compensatoire. En effet, malgré la régulation à la hausse de la phosphofructokinase, l’enzyme limitant le taux dans la glycolyse, il a été démontré qu’une augmentation de la glycolyse à l’aide de manipulations alimentaires et génétiques atténuait le dysfonctionnement locomoteur et augmentait la durée de vie dans les modèles de mouches de la protéinopathie TDP-43. Pour étudier plus avant l’effet de la protéinopathie TDP-43 sur le flux glycolytique dans les motoneurones, un capteur à base de FRET génétiquement codé précédemment, FLII12Pglu-700μδ6, a été utilisé. Ce capteur est composé d’un domaine de détection du glucose bactérien et de protéines fluorescentes cyan et jaunes comme la paire FRET. Lors de la liaison au glucose, le capteur subit un changement conformationnel permettant à FRET de se produire. En utilisant FLII12Pglu-700μδ6, l’absorption de glucose s’est avérée significativement augmentée dans les motoneurones exprimant TDP-43G298S, une variante causant la SLA. Ici, nous montrons comment mesurer l’absorption de glucose, ex vivo,dans les préparations larvaires du cordon nerveux ventral exprimant le capteur de glucose FLII12Pglu-700μδ6 dans le contexte de la protéinopathie TDP-43. Cette approche peut être utilisée pour mesurer l’absorption du glucose et évaluer le flux glycolytique dans différents types de cellules ou dans le contexte de diverses mutations causant la SLA et les troubles neurodégénératifs connexes.

Acquisition d’images du capteur de glucose dans le cordon nerveux ventral (VNC), ex vivo Pour déterminer les différences dans l’absorption du glucose dans un modèle de drosophile de la SLA basé sur le TDP-43, un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé. Le capteur comprenait CFP et YFP fusionnés au domaine de liaison au glucose à partir du gène E. coli MglB. La liaison au glucose provoque un changement conformati...

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Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

L’absorption du glucose est augmentée dans les motoneurones de la drosophile affectés par la protéinopathie de la protéine de liaison à l’ADN TAR (TDP-43), comme l’indique un capteur de glucose génétiquement codé à base de FRET.

Mesure de l’absorption du glucose dans les modèles de drosophile de la protéopathie TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Cette technique est importante car elle peut mesurer l’absorption du glucose dans des cellules spécifiques dans les tissus vivants de la drosophile. Le capteur basé sur FRET fournit une mesure directe des changements dans les niveaux de glucose intracellulaire. Cette technique permet aux chercheurs d’évaluer les changements dans les niveaux de glucose en temps réel, dans les motoneurones vivants à partir de modèles de SLA par rapport à des témoins.Un aspect difficile est l’imagerie du même ensemble de neurones après avoir changé le tampon. Laisser l’échantillon sur le microscope permet de s’assurer que le VMC bouge le moins possible. Avant de commencer les dissections, allumez le microscope d’imagerie et les lasers.Ensuite, recueillez une larve errante du troisième stade, rincez-la à l’eau distillée double et placez-la dans une goutte de tampon HL3 sur un plat tapissé d’élastomère préalablement préparé. Ensuite, sous un microscope à dissection, utilisez une paire de pinces pour épingler les extrémités antérieure et postérieure de la larve, côté dorsal vers le haut, en étirant soigneusement la larve dans le sens de la longueur avec des épingles à insectes. À l’aide d’une paire de ciseaux Iris inclinés, faites une incision juste au-dessus de l’épingle postérieure.Ensuite, faites une coupe verticale de l’incision vers l’extrémité antérieure de la larve. Après avoir ajouté quelques gouttes de tampon HL3 si nécessaire, retirez la trachée et le reste des organes flottants sans perturber le système nerveux central. Ensuite, épinglez les volets, étirant la paroi du corps pour exposer le système nerveux central tout en gardant le système neuromusculaire intact.Pour l’acquisition d’images, utilisez un microscope confocal vertical avec une lentille à immersion dans l’eau 40 fois. Sélectionnez ensuite le laser de 405 nanomètres pour exciter le CFP. Ensuite, optimisez les paramètres d’acquisition tels que la vitesse de numérisation, la moyenne, l’objectif, la taille du sténopé du zoom et la résolution spatiale.Ajustez le gain de manière à ce que le signal soit dans la plage dynamique optimale et utilisez les mêmes paramètres pour tous les génotypes. Pour imager les motoneurones dans le cordon nerveux ventral, placez le plat en silicone avec l’échantillon disséqué sous la lentille et abaissez la lentille de sorte qu’elle entre en contact avec le tampon HL3 de saccharose tréhalose. Assurez-vous que l’objectif est complètement immergé dans le tampon et ajoutez plus de tampon si nécessaire. Prochain.À l’aide des canaux CFP et FRET, sélectionnez manuellement une sélection optique composée d’au moins six motoneurones au foyer situés le long de la ligne médiane du cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes pendant 10 minutes. Ces images représentent la ligne de base.Pour la stimulation du glucose, retirez le saccharose tréhalose contenant un tampon HL3 à l’aide d’une pipette Pasteur et ajoutez cinq millimolaires de glucose supplémenté HL3 sans déplacer le cordon nerveux ventral. Ensuite, acquérez des images toutes les 10 secondes pendant 10 minutes supplémentaires. Ces images représentent la phase de stimulation.Enregistrez les images en tant que fichiers CZI ou tout type de fichier pris en charge par le logiciel d’imagerie avec un nom de fichier comprenant la date, le fond génétique, la condition expérimentale et les canaux utilisés. Réutilisez les paramètres pour imager tous les génotypes. Pour le traitement de l’image, ouvrez le logiciel d’imagerie Fiji-ImageJ, puis ouvrez les fichiers CZI, choisissez la pile de vues avec hyper pile et définissez le mode couleur sur l’échelle de gris et sélectionnez diviser les couches en fenêtres séparées. Prochain.Traitez les images à l’aide de plug-ins de correction de dérive, turbo reg et stack reg. Chaque canal est corrigé séparément en sélectionnant stack reg sous les plug-ins, puis en choisissant la transformation en traduction. Choisissez manuellement les régions d’intérêt ou les ROI en traçant tous les motoneurones qui restent au centre de l’attention sur l’ensemble de la série chronologique.Ensuite, utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour enregistrer chaque contour de motoneurone. Utilisez la fonction multi-mesure pour mesurer la valeur grise moyenne dans chaque retour sur investissement à chaque point temporel. Copiez ensuite les retours sur investissement tracés du premier canal vers le deuxième canal pour l’image de pré-stimulation.Pour l’analyse des données, calculez le rapport FRET par CFP en utilisant les valeurs grises moyennes pour les canaux FRET et CFP. Les changements dans les rapports FRET par CFP reflètent des altérations de la concentration intracellulaire de glucose. Ensuite, tracez les ratios FRET par CFP pour chaque retour sur investissement et point de temps par rapport au temps.Un capteur de glucose à base de FRET génétiquement codé a été utilisé pour mesurer l’absorption du glucose dans les motoneurones. Lorsque le glucose n’est pas lié au capteur, l’excitation CFP provoque uniquement l’émission de CFP. Et lorsque le glucose se lie, le signal YFP peut être détecté en raison de FRET se produisant entre CFP et YFP.Voici des images de signaux FRET et CFP dans les contrôles des capteurs de glucose dans les neurones mutants TDP-43 dans des conditions de base et de stimulation. Un motoneurone représentatif est décrit dans chaque image comme un exemple de retour sur investissement. Lors de la stimulation du glucose, les motoneurones de contrôle exprimant des capteurs de glucose présentent une légère augmentation de l’absorption du glucose, tandis que les neurones exprimant le TDP-43 ont montré une absorption significativement plus élevée du glucose.D’autres rapports FRET par CFP des motoneurones mutants TDP-43 ont été normalisés aux contrôles des capteurs de glucose à chaque point temporel. Dans les conditions initiales, il n’y avait aucune différence entre les génotypes. Cependant, lors de la stimulation du glucose, une augmentation rapide et significative de l’absorption du glucose a été observée chez les mutants TDP-43 par rapport au témoin.Dans une représentation graphique à barres, la stimulation du glucose dans les neurones exprimant le capteur de glucose a démontré une augmentation faible mais significative du rapport FRET par CFP par rapport à la ligne de base. En revanche, les neurones exprimant TDP-43 ont montré une augmentation significative du rapport lors de la stimulation par rapport à la ligne de base. La différence nette dans les rapports FRET par CFP entre les motoneurones exprimant le TDP-43 et le capteur de glucose est d’environ 10,9%La gestion du temps est essentielle pour cette procédure afin que les neurones ne meurent pas au cours de l’imagerie.Il est important d’imager immédiatement après les dissections pour éviter cela. Cette technique a mis en évidence l’importance du métabolisme du glucose dans les neurones et a conduit notre groupe à étudier plus avant le rôle de la glycolyse dans la régénération des motoneurones.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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