Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
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Wir danken Stefanie Schirmeier und Takeshi Iwatsubo für die Bereitstellung von Drosophila-Sorten. Wir danken auch Patricia Jansma für die Unterstützung bei der Bildgebung im Marley Imaging Core an der University of Arizona. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (an DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (an EM) und das Undergraduate Biology Research Program (an HB) finanziert.

Die UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenen Fliegen wurden in Volkenhoff et al.10 berichtet und freundlicherweise von Dr. S. Schirmeier zur Verfügung gestellt. Die transgenen UAS TDP-43G298S Leitungen wurden freundlicherweise von Dr. T. Iwatsubo13zur Verfügung gestellt. Rekombinante Drosophila-Linien, die sowohl UAS FLII12Pglu-700μδ6- als auch UAS TDP-43-Transgene beherbergen, wurden im Zarnescu-Labor unter Verwendung genetischer Standardansätze erzeugt ...

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	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

Die hier im Detail beschriebene Technik kann angewendet werden, um die Glukoseaufnahme in einem bestimmten Zelltyp von Interesse in lebender Drosophila mit FLII12Pglu-700μδ6 zu messen, einem FRET-basierten Sensor, der Änderungen des Glukosespiegels in einem Millimolarbereich10,11,12erkennen kann. Dieser Sensor wurde zuvor in Verbindung mit dem UAS-GAL4-System verwendet, um seine Expression auf bestimmte Zelltypen aus...

Die Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine fortschreitende neurodegenerative Erkrankung, die derzeit unheilbar ist. ALS betrifft obere und untere Motoneuronen, was zu einem Verlust der motorischen Koordination, irreversibler Lähmung, Atemversagen und schließlich zum Tod innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnoseführt 1. ALS ist mit Stoffwechseldefekten wie Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus assoziiert (überprüft in2); Es bleibt jedoch unklar, wie diese Veränderungen im Stoffwechsel mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Ein gemeinsamer Nenner bei ALS und verwandten neurodegenerativen Erkrankungen ist TDP-43, ein Nukleinsäure-bindendes Protein, das an mehreren Schritten der RNA-Verarbeitung beteiligt ist3,4,5. Obwohl Mutationen in TDP-43 nur 3% -5% der Patienten betreffen, wird das Wildtyp-TDP-43-Protein in zytoplasmatischen Aggregaten in >97% der ALS-Fälle (überprüft in6) gefunden. Diese Pathologie wurde in Drosophila durch Überexpression von menschlichem Wildtyp oder mutantem TDP-43 (G298S) in Motoneuronen modelliert, was mehrere Aspekte von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer7,8. Unter Verwendung dieser Modelle wurde kürzlich berichtet, dass die TDP-43-Proteinopathie einen signifikanten Anstieg der Pyruvatspiegel und der Phosphofructokinase (PFK) mRNA, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym der Glykolyse, verursacht9. Ähnliche Erhöhungen der PFK-Transkripte wurden in patienteneigenen Motoneuronen und Rückenmark gefunden, was darauf hindeutet, dass die Glykolyse im Zusammenhang mit der TDP-43-Proteinopathie hochreguliert ist. Interessanterweise milderte ein weiterer Anstieg der Glykolyse durch diätetische und genetische Manipulationen mehrere ALS-Phänotypen wie Lokomotorische Dysfunktion und erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie, die mit einem kompensatorischen, neuroprotektiven Mechanismus in degenerierenden Motoneuronen übereinstimmen.
Um Veränderungen in der Glykolyse weiter zu untersuchen und die Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie zu messen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter FRET-basierter Sensor FLII12Pglu-700μδ610 in Motoneuronen speziell mit dem UAS-GAL4-Expressionssystem exprimiert. Der Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 nutzt den Resonanzenergietransfer zwischen zwei Varianten des grün fluoreszierenden Proteins, cyanfarbene und gelb fluoreszierende Proteine (CFP und YFP), um Glukose auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Es besteht aus einer bakteriellen Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen, das an gegenüberliegenden Enden des Moleküls mit CFP und YFP fusioniert ist. Wenn der Sensor an ein Glukosemolekül gebunden ist, erfährt er eine Konformationsänderung, die CFP und YFP näher zusammenbringt und FRET ermöglicht, die dann zur Quantifizierung der intrazellulären Glukosespiegel verwendet werden kann10,11,12 ( Abbildung1). Hier zeigen wir, wie der FLII12Pglu-700μδ6-Sensor verwendet werden kann, um Veränderungen der Glukoseaufnahme zu bestimmen, die durch TDP-43-Proteinopathie in Motoneuronen verursacht werden. Die hier beschriebenen Experimente zeigen, dass die Überexpression einer ALS-assoziierten Mutante, TDP-43G298S,in Motoneuronen einen signifikanten Anstieg der Glukoseaufnahme im Vergleich zu Kontrollen verursacht. Dieser Ansatz kann in anderen Arten von ALS (z. B. SOD1, C9orf72 usw.) und / oder anderen Zelltypen (z. B. Glia, Muskeln) verwendet werden, um Veränderungen der Glukoseaufnahme im Zusammenhang mit Neurodegeneration zu bestimmen.

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	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

Amyotrophe Lateralsklerose ist eine neurodegenerative Erkrankung, die innerhalb von 2-5 Jahren nach der Diagnose zu fortschreitender Muskelschwäche und Tod führt. Klinische Manifestationen umfassen Gewichtsverlust, Dyslipidämie und Hypermetabolismus; Es bleibt jedoch unklar, wie diese mit der Degeneration von Motoneuronen zusammenhängen. Unter Verwendung eines Drosophila-Modells der TDP-43-Proteinopathie, das mehrere Merkmale von ALS rekapituliert, einschließlich zytoplasmatischer Einschlüsse, lokomotorischer Dysfunktion und reduzierter Lebensdauer, haben wir kürzlich weitreichende Stoffwechseldefizite identifiziert. Unter diesen wurde festgestellt, dass die Glykolyse hochreguliert ist, und genetische Interaktionsexperimente lieferten Hinweise auf einen kompensatorischen neuroprotektiven Mechanismus. Trotz der Hochregulierung der Phosphofructokinase, dem geschwindigkeitsbegrenzenden Enzym in der Glykolyse, wurde gezeigt, dass eine Zunahme der Glykolyse unter Verwendung diätetischer und genetischer Manipulationen die Funktionsstörung des Lokomotors und die erhöhte Lebensdauer in Fliegenmodellen der TDP-43-Proteinopathie abschwächt. Um die Wirkung der TDP-43-Proteinopathie auf den glykolytischen Fluss in Motoneuronen weiter zu untersuchen, wurde ein zuvor berichteter genetisch kodierter, FRET-basierter Sensor, FLII12Pglu-700μδ6, verwendet. Dieser Sensor besteht aus einer bakteriellen Glukosesensordomäne und cyan- und gelb fluoreszierenden Proteinen als FRET-Paar. Bei der Glukosebindung erfährt der Sensor eine Konformationsänderung, die FRET ermöglicht. Unter Verwendung von FLII12Pglu-700μδ6 wurde festgestellt, dass die Glukoseaufnahme in Motoneuronen, die TDP-43G298Sexprimieren, signifikant erhöht ist, eine ALS-verursachende Variante. Hier zeigen wir, wie die Glukoseaufnahme ex vivoin larvalen ventralen Nervenstrangpräparaten gemessen werden kann, die den Glukosesensor FLII12Pglu-700μδ6 im Rahmen der TDP-43-Proteinopathie exprimieren. Dieser Ansatz kann verwendet werden, um die Glukoseaufnahme zu messen und den glykolytischen Fluss in verschiedenen Zelltypen oder im Zusammenhang mit verschiedenen Mutationen, die ALS und verwandte neurodegenerative Erkrankungen verursachen, zu bewerten.

Bildaufnahme des Glukosesensors im ventralen Nervenstrang (VNC), ex vivo Um Unterschiede in der Glukoseaufnahme in einem Drosophila-Modell von ALS basierend auf TDP-43 zu bestimmen, wurde ein genetisch kodierter FRET-basierter Glukosesensor verwendet. Der Sensor bestand aus CFP und YFP, die mit der Glukosebindungsdomäne aus dem E. coli MglB-Gen fusionierten. Die Glucosebindung löst eine Konformationsänderung aus, die durch Fluoreszenzresonanz-Energietra...

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Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Die Glukoseaufnahme ist in Drosophila-Motoneuronen erhöht, die von der TAR-DNA-bindenden Protein (TDP-43) -Proteinopathie betroffen sind, wie durch einen FRET-basierten, genetisch kodierten Glukosesensor angezeigt.

Messung der Glukoseaufnahme in Drosophila-Modellen der TDP-43-Proteinopathie

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Diese Technik ist von Bedeutung, da sie die Glukoseaufnahme in bestimmten Zellen in lebenden Drosophila-Geweben messen kann. Der FRET-basierte Sensor liefert ein direktes Maß für Veränderungen des intrazellulären Glukosespiegels. Diese Technik ermöglicht es Forschern, Veränderungen des Glukosespiegels in Echtzeit in lebenden Motoneuronen aus ALS-Modellen im Vergleich zu Kontrollen zu bewerten.Ein herausfordernder Aspekt ist die Abbildung des gleichen Satzes von Neuronen nach dem Ändern des Puffers. Wenn Sie die Probe auf dem Mikroskop belassen, wird sichergestellt, dass sich der VMC so wenig wie möglich bewegt. Bevor Sie mit den Dissektionen beginnen, schalten Sie das bildgebende Mikroskop und die Laser ein.Sammeln Sie dann eine wandernde Larve im dritten Stadium, spülen Sie sie mit doppelt destilliertem Wasser ab und legen Sie sie in einen Tropfen HL3-Puffer auf eine zuvor vorbereitete, mit Elastomer ausgekleidete Schale. Als nächstes verwenden Sie unter einem Seziermikroskop eine Pinzette, um das vordere und hintere Ende der Larve mit der dorsalen Seite nach oben zu fixieren, indem Sie die Larve vorsichtig der Länge nach mit Insektenstiften dehnen. Machen Sie mit einer abgewinkelten Iris-Schere einen Schnitt direkt über dem hinteren Stift.Dann machen Sie einen vertikalen Schnitt von der Inzision in Richtung des vorderen Endes der Larve. Nachdem Sie bei Bedarf ein paar Tropfen HL3-Puffer hinzugefügt haben, entfernen Sie die Luftröhre und den Rest der schwimmenden Organe, ohne das zentrale Nervensystem zu stören. Dann stecken Sie die Klappen fest und dehnen Sie die Körperwand, um das zentrale Nervensystem freizulegen, während das neuromuskuläre System intakt bleibt.Verwenden Sie für die Bildaufnahme ein aufrechtes konfokales Mikroskop mit einer 40-fachen Wasserimmersionslinse. Wählen Sie dann den 405-Nanometer-Laser aus, um das CFK anzuregen. Optimieren Sie als Nächstes die Erfassungsparameter wie Scangeschwindigkeit, Durchschnitt, Objektiv, Zoom-Lochgröße und räumliche Auflösung.Passen Sie die Verstärkung so an, dass das Signal im optimalen Dynamikbereich liegt, und verwenden Sie die gleichen Parameter für alle Genotypen. Um Motoneuronen innerhalb des ventralen Nervenstrangs abzubilden, legen Sie die Silikonschale mit der sezierten Probe unter die Linse und senken Sie die Linse ab, so dass sie mit dem Trehalose-Saccharose-HL3-Puffer in Kontakt kommt. Stellen Sie sicher, dass das Objektiv vollständig in den Puffer eingetaucht ist, und fügen Sie bei Bedarf weitere Puffer hinzu. Nächster.Wählen Sie mithilfe der CFP- und FRET-Kanäle manuell eine optische Auswahl aus, die aus mindestens sechs fokussierten Motoneuronen besteht, die sich entlang der Mittellinie des ventralen Nervenstrangs befinden. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden Bilder für 10 Minuten auf. Diese Bilder stellen die Grundlinie dar.Zur Glukosestimulation entfernen Sie die Trehalose-Saccharose, die HL3-Puffer enthält, mit einer Pasteur-Pipette und fügen Sie fünf millimolaren Glukose-ergänzten HL3-Puffer hinzu, ohne den ventralen Nervenstrang zu bewegen. Nehmen Sie dann alle 10 Sekunden Bilder für weitere 10 Minuten auf. Diese Bilder stellen die Stimulationsphase dar.Speichern Sie die Bilder als CZI-Dateien oder einen anderen von der Imaging-Software unterstützten Dateityp mit einem Dateinamen einschließlich Datum, genetischem Hintergrund, experimentellem Zustand und verwendeten Kanälen. Verwenden Sie die Parameter wieder, um alle Genotypen abzubilden. Öffnen Sie für die Bildverarbeitung die Imaging-Software Fiji-ImageJ, öffnen Sie dann die CZI-Dateien, wählen Sie View Stack mit Hyper-Stack und stellen Sie den Farbmodus auf Graustufen ein und wählen Sie split channels in separate Fenster. Nächster.Verarbeiten Sie die Bilder mitHilfe von Driftkorrektur-Plug-Ins, Turbo Reg und Stack Reg. Jeder Kanal wird separat korrigiert, indem Sie unter Plug-Ins Stack Reg auswählen und dann Transformation in Translation auswählen. Wählen Sie manuell die interessierenden Regionen oder ROIs aus, indem Sie alle Motoneuronen verfolgen, die über die gesamte Zeitreihe im Fokus bleiben.Verwenden Sie dann den ROI-Manager, um jede Motoneuron-Gliederung zu speichern. Verwenden Sie die Multi-Measure-Funktion, um den grauen Mittelwert in jedem ROI zu jedem Zeitpunkt zu messen. Kopieren Sie dann die ROIs, die vom ersten Kanal in den zweiten Kanal für das Pre-Stimulation-Bild verfolgt wurden.Berechnen Sie für die Datenanalyse das Verhältnis FRET nach CFP anhand der grauen Mittelwerte für die FRET- und CFP-Kanäle. Änderungen der FRET-by-CFP-Verhältnisse spiegeln Veränderungen der intrazellulären Glukosekonzentration wider. Zeichnen Sie dann FRET nach CFP-Verhältnissen für jeden ROI und Zeitpunkt im Vergleich zur Zeit auf.Ein genetisch kodierter FRET-basierter Glukosesensor wurde verwendet, um die Glukoseaufnahme in Motoneuronen zu messen. Wenn Glukose nicht an den Sensor gebunden ist, verursacht die CFP-Anregung nur eine CFP-Emission. Und wenn Glukose bindet, kann das YFP-Signal aufgrund von FRET zwischen CFP und YFP erkannt werden.Hier sind Bilder von FRET- und CFP-Signalen in Glukosesensorsteuerungen in TDP-43-mutierten Neuronen unter Baseline- und Stimulationsbedingungen gezeigt. Ein repräsentatives Motoneuron wird in jedem Bild als Beispiel für den ROI dargestellt. Bei Glukosestimulation zeigen Kontrollmotorneuronen, die Glukosesensoren exprimieren, einen kleinen Anstieg der Glukoseaufnahme, während Neuronen, die TDP-43 exprimieren, eine signifikant höhere Glukoseaufnahme zeigten.Weitere FRET by CFP-Verhältnisse von TDP-43-mutierten Motoneuronen wurden zu jedem Zeitpunkt auf Glukosesensorkontrollen normalisiert. Unter Ausgangsbedingungen gab es keinen Unterschied zwischen den Genotypen. Bei Glukosestimulation wurde jedoch ein schneller und signifikanter Anstieg der Glukoseaufnahme bei TDP-43-Mutanten im Vergleich zur Kontrolle beobachtet.In einer Balkendiagrammdarstellung zeigte die Glukosestimulation in Neuronen, die den Glukosesensor exprimieren, einen kleinen, aber signifikanten Anstieg des FRET-by-CFP-Verhältnisses im Vergleich zur Baseline. Im Gegensatz dazu zeigten Neuronen, die TDP-43 exprimierten, einen signifikanten Anstieg des Verhältnisses bei Stimulation im Vergleich zum Ausgangswert. Der Nettounterschied in den FRET-by-CFP-Verhältnissen zwischen Motoneuronen, die TDP-43 exprimieren, und Glukosesensor beträgt etwa 10,9%Das Zeitmanagement ist für dieses Verfahren entscheidend, damit die Neuronen im Laufe der Bildgebung nicht absterben.Es ist wichtig, sich unmittelbar nach den Sezierungen ein Bild zu machen, um dies zu vermeiden. Diese Technik hat die Bedeutung des Glukosestoffwechsels in Neuronen hervorgehoben und unsere Gruppe dazu veranlasst, die Rolle der Glykolyse bei der Regeneration von Motoneuronen weiter zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Bewegungsapparat, Lernen und Gedächtnis Defizite in Drosophila Modelle von Neurodegeneration

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Forschung

Neurowissenschaften

Measuring Motor Coordination in Mice

Mess-motorische Koordination in Mäuse

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualisierung von Propriozeptoren in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larven und Puppen

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Eine preiswerte, skalierbare Behavioral Assay zur Messung von Ethanol Sedierung Empfindlichkeit und Rapid Toleranz in<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Messen und Ändern von Mating Antrieb in Male<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Messung der synaptischen Vesikel Endozytose in kultivierten Hippocampal Neuronen

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Zellbiologie der Neurodegeneration in Drosophila durch unvoreingenommene Analyse der Gewebekulturen Tagged Proteine mit ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Alternatives Eintauchen in Glukose, um eine verlängerte Hyperglykämie bei Zebrafischen zu erzeugen

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Semi-quantitative Bestimmung der dopaminergen Neuronendichte in der Substantia Nigra von Nagetiermodellen mittels automatisierter Bildanalyse

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...