Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

אנו מודים לסטפני שירמאייר וטוקשי איווצובו על שסיפקו זני דרוזופילה. אנו מודים גם לפטרישיה ג'נסמה על הסיוע בהדמיה בליבת ההדמיה של מארלי באוניברסיטת אריזונה. עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות NIH NS091299, NS115514 (ל- DCZ), מלגת HHMI גיליאם (ל- EM) והתוכנית לחקר הביולוגיה לתואר ראשון (ל- HB).

הזבובים הטרנסגניים UAS FLII12Pglu-700μδ6 דווחו בוולקנהוף ואח'10 וסיפקו בחביבות על ידי ד"ר ס. שירמאייר. הקווים הטרנסגניים של UAS TDP-43G298S סופקו בחביבות על ידי ד"ר ט. איווצובו13. קווים Drosophila רקומביננטי מחסה הן UAS FLII12Pglu-700μδ6 ו UAS TDP-43 טרנסגנים נוצרו במעבדת Zarnescu באמצעות גיש?...

<ol>
	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43,+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9.">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li><li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43.">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li><li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain.">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).</li><li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors.">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

הטכניקה המתוארת בפירוט כאן ניתן ליישם כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז בסוג מסוים של עניין Drosophila חי באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, חיישן מבוסס FRET אשר יכול לזהות שינויים ברמות הגלוקוז לטווח מילימולרי10,11,12. חיישן זה שימש בעבר בשילוב עם מערכת UAS-GAL4 כדי ל?...

טרשת אמיוטרופית לרוחב (ALS) היא הפרעה נוירודגנרטיבית מתקדמת כי הוא כרגע חשוכת מרפא. ALS משפיע על נוירונים מוטוריים עליונים ותחתונים המובילים לאובדן קואורדינציה מוטורית, שיתוק בלתי הפיך, כשל נשימתי, ומוות בסופו של דבר בתוך 2-5 שנים שלאבחון 1. ALS קשורה פגמים מטבוליים כגון ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם (נבדק ב2); עם זאת, עדיין לא ברור כיצד שינויים אלה בחילוף החומרים מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. מכנה נפוץ ב- ALS ומחלות ניווניות הקשורות הוא TDP-43, חלבון מחייב חומצת גרעין המעורב במספר שלבים של עיבוד RNA3,4,5. למרות מוטציות ב TDP-43 משפיעות רק על 3%-5% מהחולים, חלבון מסוג TDP-43 מסוג בר נמצא בתוך אגרגטים ציטופלסמיים >97% ממקרי ALS (נבדק ב-6). פתולוגיה זו עוצבה בדרוסופילה על ידי ביטוי יתר של סוג בר אנושי או מוטציה TDP-43 (G298S) בתאי עצב מוטוריים, אשר משחזר היבטים מרובים של ALS, כולל הכללות ציטופלסמיות, תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מופחתת7,8. באמצעות מודלים אלה, דווח לאחרונה כי חלבון TDP-43 גורם לעלייה משמעותית ברמות הפירובאט וה-phosphofructokinase (PFK) mRNA, האנזים המגביל את קצב הגליקוליזיס9. עליות דומות בתמלילים PFK נמצאו נוירונים מוטוריים שמקורם בחולה וחוט השדרה, דבר המצביע על כך גליקוליזה הוא upregulated בהקשר של חלבון TDP-43. מעניין, עלייה נוספת בגליקוליזה באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הקלה על מספר פנוטיפים של ALS כגון תפקוד לקוי של לוקומוטור ותוחלת חיים מוגברת במודלים של פרוטאינופתיה TDP-43, עולה בקנה אחד עם מנגנון מפצה, neuroprotective נוירונים מוטוריים מתנוונים.
כדי לחקור שינויים נוספים בגליקוליזיס ולמדוד את ספיגת הגלוקוז במודלים Drosophila של חלבון TDP-43, חיישן מבוסס FRET שדווח בעבר מקודד גנטית FLII12Pglu-700μδ610 בא לידי ביטוי נוירונים מוטוריים במיוחד באמצעות מערכת הביטוי UAS-GAL4. חיישן הגלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 משתמש בהעברת אנרגיית תהודה בין שתי גרסאות של חלבון פלואורסצנטי ירוק, ציאני וחלבוני פלורסנט צהובים (CFP ו- YFP) כדי לזהות גלוקוז ברמה התאית. הוא מורכב מתחום מחייב גלוקוז חיידקי מהגן E. coli MglB התמזג CFP ו YFP בקצוות מנוגדים של המולקולה. כאשר הוא קשור למולקולת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המקרב את CFP ו- YFP זה לזה ומאפשר ל- FRET להתרחש, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי לכמת את רמות הגלוקוז התאי10,11,12 ( איור1). כאן, אנו מראים כיצד חיישן FLII12Pglu-700μδ6 יכול לשמש כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הנגרמים על ידי חלבון TDP-43 בתאי עצב מוטוריים. הניסויים המתוארים כאן מראים כי ביטוי יתר של מוטציה הקשורה ALS, TDP-43G298S, בתאי עצב מוטוריים גורם לעלייה משמעותית בספיגת הגלוקוז בהשוואה לבקרות. גישה זו יכולה לשמש בסוגים אחרים של ALS (למשל, SOD1, C9orf72 וכו ') ו/או סוגי תאים אחרים (למשל, גליה, שרירים) כדי לקבוע שינויים בספיגת הגלוקוז הקשורים ניוון עצבי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

טרשת אמיוטרופית לרוחב היא הפרעה ניווניות הגורמת לחולשת שרירים מתקדמת ומוות בתוך 2-5 שנים לאחר האבחון. ביטויים קליניים כוללים ירידה במשקל, דיסליפידמיה, היפרמטבוליזם; עם זאת, עדיין לא ברור כיצד אלה מתייחסים ניוון נוירון מוטורי. באמצעות מודל Drosophila של חלבון TDP-43 כי recapitulates מספר תכונות של ALS כולל תכלילים ציטופלסמיים, תפקוד לקוי locomotor, ותוחלת חיים מופחתת, לאחרונה זיהינו ליקויים מטבוליים רחבים. בין אלה, גליקוליזה נמצאה upregulated וניסויי אינטראקציה גנטית סיפקו ראיות למנגנון neuroprotective מפצה. ואכן, למרות upregulation של phosphofructokinase, קצב הגבלת האנזים בגליקוליזיס, עלייה בגליקוליזיס באמצעות מניפולציות תזונתיות וגנטיות הוכח כדי להקל על תפקוד לקוי locomotor ותוחלת חיים מוגברת במודלים זבובים של חלבון TDP-43. כדי לחקור עוד יותר את ההשפעה על חלבון TDP-43 על שטף גליקוליטי בתאי עצב מוטוריים, דווח בעבר מקודד גנטית, חיישן מבוסס FRET, FLII12Pglu-700μδ6, שימש. חיישן זה מורכב מתחום חישת גלוקוז חיידקי וחלבונים פלואורסצנטיים ציאן וצהוב כצמד FRET. לאחר כריכת גלוקוז, החיישן עובר שינוי קונפורמציה המאפשר FRET להתרחש. באמצעות FLII12Pglu-700μδ6, ספיגת גלוקוז נמצאה עלייה משמעותית נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43G298S, גרסה הגורמת ALS. כאן, אנו מראים כיצד למדוד ספיגת גלוקוז, ex vivo, בתכשירי כבל עצב גחון זחל מבטא את חיישן גלוקוז FLII12Pglu-700μδ6 בהקשר של חלבון TDP-43. גישה זו יכולה לשמש כדי למדוד את ספיגת הגלוקוז ולהעריך שטף גליקוליטי בסוגי תאים שונים או בהקשר של מוטציות שונות הגורמות ALS והפרעות ניווניות הקשורות.

רכישת תמונה של חיישן הגלוקוז במתג העצב הגחון (VNC), ex vivo כדי לקבוע הבדלים בספיגת הגלוקוז במודל Drosophila של ALS המבוסס על TDP-43, נעשה שימוש בחיישן גלוקוז מבוסס FRET מקודד גנטית. החיישן כלל CFP ו- YFP התמזגו לתחום כריכת הגלוקוז מהגן E. coli MglB. כריכת גלוקוז מעוררת שינוי קונפ?...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

ספיגת הגלוקוז מוגברת בתאי העצב המוטוריים של Drosophila המושפעים מחלבון מחייב DNA TAR (TDP-43), כפי שצוין על ידי חיישן גלוקוז מבוסס FRET, מקודד גנטית.

מדידת ספיגת גלוקוז במודלים של דרוסופילה של פרוטאינופתיה TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

טכניקה זו היא משמעותית כי זה יכול למדוד ספיגת גלוקוז בתאים ספציפיים ברקמות Drosophila חי. החיישן מבוסס FRET מספק מידה ישירה של שינויים ברמות הגלוקוז התאיות. טכניקה זו מאפשרת לחוקרים להעריך שינויים ברמות הגלוקוז בזמן אמת, בתוך נוירונים מוטוריים חיים ממודלים של ALS לעומת פקדים.היבט מאתגר הוא הדמיית אותו סט של נוירונים לאחר שינוי המאגר. השארת המדגם על המיקרוסקופ מסייעת להבטיח כי VMC נע מעט ככל האפשר. לפני תחילת הניתוחים להפעיל את מיקרוסקופ הדמיה ולייזרים.לאחר מכן לאסוף זחל instar שלישי נודד, לשטוף אותו עם מים מזוקקים כפולים ומניחים אותו טיפה של חוצץ HL3 על צלחת מרופד אלסטומר שהוכן בעבר. לאחר מכן תחת מיקרוסקופ ניתוח, השתמש בזוג מלקחיים כדי להצמיד את הקצוות הקדמיים והאחוריים של הזחל, צד גבי למעלה, על ידי מתיחת הזחל בזהירות אורך חכם עם סיכות חרקים. באמצעות זוג מספריים זוויתיים של איריס, לעשות תקע ממש מעל הסיכה האחורית.ואז לעשות חתך אנכי מן החתך לכיוון הקצה החלקה הסופית של הזחל. לאחר הוספת כמה טיפות של חוצץ HL3 במידת הצורך, להסיר את קנה הנשימה ואת שאר האיברים הצפים מבלי להפריע למערכת העצבים המרכזית. לאחר מכן להצמיד את המדפים, מותח את דופן הגוף כדי לחשוף את מערכת העצבים המרכזית תוך שמירה על המערכת neuromuscular שלם.לרכישת תמונה, השתמש במיקרוסקופ קונפוקל זקוף עם עדשת טבילת מים פי 40. לאחר מכן בחר את לייזר 405 ננומטר כדי לרגש את CFP. לאחר מכן, מטב את פרמטרי הרכישה כגון מהירות סריקה, ממוצע, מטרה, גודל חור זום ורזולוציה מרחבית.התאם את הרווח כך שהאות נמצא בטווח הדינמי האופטימלי והשתמש באותם פרמטרים עבור כל הגנוטיפים. כדי לדמיין נוירונים מוטוריים בתוך כבל העצבים הגחון, מניחים את צלחת הסיליקון עם המדגם המנותח מתחת לעדשה ומנמיכים את העדשה כך שהיא באה במגע עם חיץ סוכרוז HL3. ודא שהעדשה שקועה לחלוטין במאגר והוסף מאגר נוסף במידת הצורך. הבא.באמצעות ערוצי CFP ו- FRET, בחר באופן ידני מבחר אופטי המורכב משישה נוירונים מוטוריים לפחות בפוקוס הממוקמים לאורך קו האמצע של כבל העצב הגחון. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 10 שניות במשך 10 דקות. תמונות אלה מייצגות את קו הבסיס.לגירוי גלוקוז, הסירו את סוכרוז הטרהלוז המכיל חיץ HL3 באמצעות פיפטה פסטר והוסיפו חמישה מילימול גלוקוז בתוספת חיץ HL3 מבלי להזיז את חוט העצבים הגחון. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 10 שניות במשך 10 דקות נוספות. תמונות אלה מייצגות את שלב הגירוי.שמור את התמונות כקבצי CZI או כל סוג קובץ הנתמך על-ידי תוכנת ההדמיה עם שם קובץ הכולל תאריך, רקע גנטי, מצב ניסיוני וערוצים בהם נעשה שימוש. שימוש חוזר בפרמטרים כדי לדמות את כל הגנוטיפים. לעיבוד תמונה פתחו את תוכנת ההדמיה Fiji-ImageJ ולאחר מכן פתחו את קבצי CZI, בחרו 'תצוגת מחסנית' עם הערימה והגדירו מצב צבע לקנה מידה אפור ובחרו ערוצים מפוצלים לחלונות נפרדים. הבא.לעבד את התמונות באמצעות תוספים תיקון נסחף, reg טורבו ו reg מחסנית. כל ערוץ מתוקן בנפרד על-ידי בחירת reg מחסנית תחת תוספים ולאחר מכן בחירת טרנספורמציה לתרגום. בחר באופן ידני את אזורי העניין או ההון על-ידי מעקב אחר כל הנוירונים המוטוריים שנותרו בפוקוס לאורך כל סדרת הזמן.לאחר מכן השתמש במנהל ה- ROI כדי לשמור כל קו מתאר של נוירון מוטורי. השתמש בפונקציית ריבוי המידה כדי למדוד את הערך האפור הממוצע בכל עלה על תנאי בכל נקודת זמן. לאחר מכן העתק את ההעלות על תנאי שאותרו מהערוץ הראשון לערוץ השני עבור תמונת קדם הגירוי.עבור ניתוח נתונים, חשב את יחס FRET על-ידי CFP באמצעות הערכים האפורים הממוצעים עבור ערוצי FRET ו- CFP. שינויים ביחסי FRET על ידי CFP משקפים שינויים בריכוז הגלוקוז התאי. לאחר מכן התווה FRET לפי יחסי CFP עבור כל נקודת ROI ונקודת זמן לעומת זמן.חיישן גלוקוז מבוסס FRET מקודד גנטית שימש למדידת ספיגת גלוקוז בתאי עצב מוטוריים. כאשר גלוקוז אינו מאוגד לחיישן, עירור CFP גורם לפליטת CFP בלבד. וכאשר גלוקוז נקשר, האות YFP ניתן לזהות עקב FRET המתרחשת בין CFP ו YFP.מוצגות כאן תמונות של אותות FRET ו- CFP בבקרות חיישן גלוקוז בתאי עצב מוטנטיים TDP-43 בתנאי בסיס וגירוי. נוירון מוטורי מייצג מתואר בכל תמונה כדוגמה של ROI. עם גירוי גלוקוז, נוירונים מוטוריים שליטה המביעים חיישני גלוקוז, להפגין עלייה קטנה בספיגת גלוקוז בעוד נוירונים המבטאים TDP-43 הראו ספיגת גלוקוז גבוהה משמעותית.FRET נוסף על ידי יחסי CFP של נוירונים מוטוריים מוטנטיים TDP-43 היו מנורמלים לבקרות חיישן גלוקוז בכל נקודת זמן. בתנאים בסיסיים, לא היה הבדל בין הגנוטיפים. עם זאת, עם גירוי גלוקוז, עלייה מהירה ומשמעותית בספיגת הגלוקוז נצפתה במוטנטים TDP-43 בהשוואה לשליטה.בייצוג גרף עמודות, גירוי גלוקוז בנוירונים המבטאים את חיישן הגלוקוז הדגים עלייה קטנה אך משמעותית ב- FRET על ידי יחס CFP בהשוואה לקו הבסיס. לעומת זאת, נוירונים המבטאים TDP-43 הראו עלייה משמעותית ביחס עם גירוי בהשוואה לקו הבסיס. ההבדל נטו FRET על ידי יחסי CFP בין נוירונים מוטוריים המבטאים TDP-43 וחיישן גלוקוז הוא סביב 10.9% ניהול זמן הוא קריטי עבור הליך זה, כך הנוירונים לא למות במהלך ההדמיה.חשוב לדמות מיד לאחר ניתוחים כדי להימנע מכך. טכניקה זו הדגישה את החשיבות של חילוף החומרים של גלוקוז בתאי עצב והובילה את הקבוצה שלנו לחקור עוד יותר את תפקיד הגליקוליזה בהתחדשות נוירונים מוטוריים.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying של תנועה, למידה, וזיכרון גירעונות תסיסנית מודלים של ניוון מוחיים

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Measuring Motor Coordination in Mice

מדידת קואורדינציה מוטורית בעכברים

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

ויזואליזציה של Proprioceptors ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; זחלים וגלמים

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Assay זול, Scalable התנהגות למדידת אתנול הרגעת רגישות וסובלנות מהירה ב<em&gt; דרוזופילה</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

מדידת כונן מזווג סירוס ועיקור במאלה<em&gt; תסיסנית</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

מדידת אנדוציטוזה שלפוחית סינפטית של נוירונים בהיפוקמפוס בתרבית

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

הערכה של דופאמין הומאוסטזיס בעכברים באמצעות ניתוח ביצועים גבוהים כרומטוגרפיה נוזלית, דופמין Synaptosomal ספיגת

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

טבילה חלופית בגלוקוז כדי לייצר היפרגליקמיה ממושכת בזברהפיש

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

קביעה כמותית למחצה של צפיפות נוירון דופאמין בסבסטנציה ניגרה של מודלים מכרסמים באמצעות ניתוח תמונה אוטומטי

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...