Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
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Ringraziamo Stefanie Schirmeier e Takeshi Iwatsubo per aver fornito ceppi di Drosophila. Ringraziamo anche Patricia Jansma per l'assistenza con l'imaging nel Marley Imaging Core presso l'Università dell'Arizona. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institutes of Health NIH NS091299, NS115514 (a DCZ), HHMI Gilliam Fellowship (a EM) e il Undergraduate Biology Research Program (a HB).

Le mosche transgeniche UAS FLII12Pglu-700μδ6 sono state riportate in Volkenhoff et al.10 e gentilmente fornite dal Dr. S. Schirmeier. Le linee transgeniche UAS TDP-43G298S sono state gentilmente fornite dal Dr. T. Iwatsubo13. Le linee di Drosophila ricombinanti che ospitano entrambi i transgeni UAS FLII12Pglu-700μδ6 e UAS TDP-43 sono state generate nel laboratorio di Zarnescu utilizzando approcci genetici standard e riportate in Manzo et al.<sup clas...

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	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. 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R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. 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B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

La tecnica qui descritta in dettaglio può essere applicata per misurare l'assorbimento di glucosio in uno specifico tipo di cellula di interesse nella Drosophila viva utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, un sensore basato su FRET in grado di rilevare cambiamenti nei livelli di glucosio in un intervallo millimolare10,11,12. Questo sensore è stato precedentemente utilizzato in combinazione con il sistema UAS-GAL4 per indiri...

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa progressiva attualmente incurabile. La SLA colpisce i motoneuroni superiori e inferiori portando alla perdita della coordinazione motoria, alla paralisi irreversibile, all'insufficienza respiratoria e all'eventuale morte entro 2-5 anni dalla diagnosi1. La SLA è associata a difetti metabolici come perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo (esaminato in2); tuttavia, non è chiaro come queste alterazioni del metabolismo si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Un denominatore comune nella SLA e nelle malattie neurodegenerative correlate è il TDP-43, una proteina legante l'acido nucleico coinvolta in diverse fasi dell'elaborazione dell'RNA3,4,5. Sebbene le mutazioni in TDP-43 colpiscano solo il 3%-5% dei pazienti, la proteina TDP-43 wild-type si trova all'interno di aggregati citoplasmatici in >97% dei casi di SLA (esaminata in6). Questa patologia è stata modellata in Drosophila sovraespressione di wildtype umano o mutante TDP-43 (G298S) nei motoneuroni, che ricapitola molteplici aspetti della SLA, tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e ridotta durata della vita7,8. Utilizzando questi modelli, è stato recentemente riportato che la proteinopatia TDP-43 provoca un aumento significativo dei livelli di piruvato e dell'mRNA della fosfofruttochinasi (PFK), l'enzima limitante la velocità della glicolisi9. Aumenti simili nei trascritti PFK sono stati trovati nei motoneuroni derivati dal paziente e nel midollo spinale, suggerendo che la glicolisi è sovraregolata nel contesto della proteinopatia TDP-43. È interessante notare che l'ulteriore aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha mitigato diversi fenotipi della SLA come la disfunzione locomotoria e l'aumento della durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43, coerente con un meccanismo compensatorio e neuroprotettivo nei motoneuroni degenerati.
Per sondare ulteriormente i cambiamenti nella glicolisi e misurare l'assorbimento del glucosio nei modelli Drosophila della proteinopatia TDP-43, un sensore basato su FRET geneticamente codificato FLII12Pglu-700μδ610 precedentemente riportato è stato espresso nei motoneuroni utilizzando specificamente il sistema di espressione UAS-GAL4. Il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 utilizza il trasferimento di energia di risonanza tra due varianti di proteina fluorescente verde, proteine fluorescenti ciano e gialle (CFP e YFP) per rilevare il glucosio a livello cellulare. Consiste in un dominio di legame batterico del glucosio dal gene E. coli MglB fuso a CFP e YFP alle estremità opposte della molecola. Quando è legato a una molecola di glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che avvicina CFP e YFP e consente il FRET, che può quindi essere utilizzato per quantificare i livelli di glucosio intracellulare10,11,12 (Figura 1). Qui, mostriamo come il sensore FLII12Pglu-700μδ6 può essere utilizzato per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio causati dalla proteinopatia TDP-43 nei motoneuroni. Gli esperimenti qui descritti mostrano che la sovraespressione di un mutante associato alla SLA, TDP-43G298S, nei motoneuroni provoca un aumento significativo dell'assorbimento del glucosio rispetto ai controlli. Questo approccio può essere utilizzato in altri tipi di SLA (ad esempio, SOD1, C9orf72, ecc.) e / o altri tipi di cellule (ad esempio, glia, muscoli) per determinare i cambiamenti nell'assorbimento del glucosio associati alla neurodegenerazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

La sclerosi laterale amiotrofica è una malattia neurodegenerativa che causa progressiva debolezza muscolare e morte entro 2-5 anni dalla diagnosi. Le manifestazioni cliniche includono perdita di peso, dislipidemia e ipermetabolismo; tuttavia, non è chiaro come questi si riferiscano alla degenerazione del motoneurone. Utilizzando un modello di Drosophila della proteinopatia TDP-43 che ricapitola diverse caratteristiche della SLA tra cui inclusioni citoplasmatiche, disfunzione locomotoria e durata della vita ridotta, abbiamo recentemente identificato deficit metabolici ad ampio raggio. Tra questi, la glicolisi è risultata sovraregolata e gli esperimenti di interazione genetica hanno fornito prove di un meccanismo neuroprotettivo compensatorio. Infatti, nonostante l'upregulation della fosfofruttochinasi, l'enzima limitante la velocità nella glicolisi, un aumento della glicolisi utilizzando manipolazioni dietetiche e genetiche ha dimostrato di mitigare la disfunzione locomotoria e aumentare la durata della vita nei modelli di mosca della proteinopatia TDP-43. Per studiare ulteriormente l'effetto sulla proteinopatia TDP-43 sul flusso glicolitico nei motoneuroni, è stato utilizzato un sensore basato su FRET geneticamente codificato precedentemente riportato, FLII12Pglu-700μδ6. Questo sensore è composto da un dominio batterico di rilevamento del glucosio e da proteine fluorescenti ciano e gialle come coppia FRET. Dopo il legame con il glucosio, il sensore subisce un cambiamento conformazionale che consente il FRET. Utilizzando FLII12Pglu-700μδ6, l'assorbimento di glucosio è risultato significativamente aumentato nei motoneuroni che esprimono TDP-43G298S,una variante che causa la SLA. Qui, mostriamo come misurare l'assorbimento di glucosio, ex vivo, in preparati del cordone nervoso ventrale larvale che esprimono il sensore di glucosio FLII12Pglu-700μδ6 nel contesto della proteinopatia TDP-43. Questo approccio può essere utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio e valutare il flusso glicolitico in diversi tipi di cellule o nel contesto di varie mutazioni che causano la SLA e le relative malattie neurodegenerative.

Acquisizione dell'immagine del sensore di glucosio nel cordone nervoso ventrale (VNC), ex vivo Per determinare le differenze nell'assorbimento del glucosio in un modello di Drosophila di SLA basato su TDP-43, è stato utilizzato un sensore di glucosio a base di FRET geneticamente codificato. Il sensore comprendeva CFP e YFP fusi al dominio di legame del glucosio dal gene E. coli MglB. Il legame del glucosio provoca un cambiamento conformazionale, che può ...

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Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

L'assorbimento del glucosio è aumentato nei motoneuroni Drosophila affetti da proteinopatia TDP-43 (TAR DNA binding protein), come indicato da un sensore di glucosio geneticamente codificato basato su FRET.

Misurazione dell'assorbimento di glucosio in modelli di Drosophila di proteinopatia TDP-43

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Questa tecnica è significativa perché può misurare l'assorbimento di glucosio in cellule specifiche nei tessuti vivi di Drosophila. Il sensore basato su FRET fornisce una misura diretta delle variazioni dei livelli di glucosio intracellulare. Questa tecnica consente ai ricercatori di valutare i cambiamenti nei livelli di glucosio in tempo reale, all'interno dei motoneuroni viventi dai modelli di SLA rispetto ai controlli.Un aspetto impegnativo è l'imaging dello stesso insieme di neuroni dopo aver cambiato il buffer. Lasciare il campione sul microscopio aiuta a garantire che il VMC si muova il meno possibile. Prima di iniziare le dissezioni accendere il microscopio di imaging e i laser.Quindi raccogliere una terza larva instar errante, sciacquarla con acqua doppia distillata e metterla in una goccia di tampone HL3 su un piatto rivestito di elastomero precedentemente preparato. Successivamente, sotto un microscopio sezionante, usa un paio di pinze per fissare le estremità anteriore e posteriore della larva, lato dorsale verso l'alto, allungando attentamente la larva in senso longitudinale con spilli per insetti. Usando un paio di forbici dell'iride angolate, fai un'incisione appena sopra il perno posteriore.Quindi effettuare un taglio verticale dall'incisione verso l'estremità anteriore della larva. Dopo aver aggiunto alcune gocce di tampone HL3, se necessario, rimuovere la trachea e il resto degli organi galleggianti senza disturbare il sistema nervoso centrale. Quindi appuntare i lembi, allungando la parete del corpo per esporre il sistema nervoso centrale mantenendo intatto il sistema neuromuscolare.Per l'acquisizione di immagini, utilizzare un microscopio confocale verticale con una lente ad immersione in acqua 40 volte. Quindi selezionare il laser a 405 nanometri per eccitare la CFP. Successivamente, ottimizza i parametri di acquisizione come velocità di scansione, media, obiettivo, dimensione del foro stenopeico dello zoom e risoluzione spaziale.Regolare il guadagno in modo che il segnale sia nella gamma dinamica ottimale e utilizzare gli stessi parametri per tutti i genotipi. Per visualizzare i motoneuroni all'interno del cordone nervoso ventrale, posizionare il piatto di silicone con il campione sezionato sotto la lente e abbassare la lente in modo che entri in contatto con il tampone HL3 di trealosio saccarosio. Assicurarsi che l'obiettivo sia completamente immerso nel buffer e aggiungere più buffer se necessario. Prossimo.Utilizzando i canali CFP e FRET, selezionare manualmente una selezione ottica composta da almeno sei motoneuroni a fuoco situati lungo la linea mediana del cordone nervoso ventrale. Quindi acquisire immagini ogni 10 secondi per 10 minuti. Queste immagini rappresentano la linea di base.Per la stimolazione del glucosio, rimuovere il tampone di trealosio contenente HL3 utilizzando una pipetta Pasteur e aggiungere cinque tamponi HL3 integrati con glucosio millimolare senza spostare il cordone nervoso ventrale. Quindi acquisire immagini ogni 10 secondi per altri 10 minuti. Queste immagini rappresentano la fase di stimolazione.Salva le immagini come file CZI o qualsiasi tipo di file supportato dal software di imaging con un nome di file che includa data, background genetico, condizione sperimentale e canali utilizzati. Riutilizzare i parametri per visualizzare tutti i genotipi. Per l'elaborazione delle immagini aprire il software di imaging Fiji-ImageJ, quindi aprire i file CZI, scegliere lo stack di visualizzazione con hyper stack e impostare la modalità colore su scala di grigi e selezionare i canali divisi in finestre separate. Prossimo.Elabora le immagini utilizzando plug-in di correzione alla deriva, turbo reg e stack reg. Ogni canale viene corretto separatamente selezionando stack reg sotto plug-in e quindi scegliendo la trasformazione in traduzione. Scegli manualmente le regioni di interesse o ROI tracciando tutti i motoneuroni che rimangono a fuoco per l'intera serie temporale.Quindi utilizzare il ROI manager per salvare ogni contorno del motoneurone. Utilizzare la funzione multi misura per misurare il valore di grigio medio in ciascun ROI in ogni punto temporale. Quindi copiare i ROI tracciati dal primo canale al secondo canale per l'immagine di pre stimolazione.Per l'analisi dei dati, calcolare il rapporto FRET per CFP utilizzando i valori di grigio medi per i canali FRET e CFP. Le variazioni nei rapporti FRET by CFP riflettono alterazioni nella concentrazione intracellulare di glucosio. Quindi traccia i rapporti FRET per CFP per ogni ROI e punto temporale rispetto al tempo.Un sensore di glucosio basato su FRET geneticamente codificato è stato utilizzato per misurare l'assorbimento del glucosio nei motoneuroni. Quando il glucosio non è legato al sensore, l'eccitazione CFP causa solo l'emissione di CFP. E quando il glucosio si lega, il segnale YFP può essere rilevato a causa del FRET che si verifica tra CFP e YFP.Qui sono mostrate immagini dei segnali FRET e CFP nei controlli del sensore di glucosio nei neuroni mutanti TDP-43 in condizioni di base e di stimolazione. Un motoneurone rappresentativo è delineato in ogni immagine come esempio di ROI. Dopo la stimolazione del glucosio, i motoneuroni di controllo che esprimono sensori di glucosio, mostrano un piccolo aumento dell'assorbimento di glucosio mentre i neuroni che esprimono TDP-43 hanno mostrato un assorbimento di glucosio significativamente più elevato.Ulteriori rapporti FRET by CFP di motoneuroni mutanti TDP-43 sono stati normalizzati ai controlli del sensore di glucosio in ogni punto temporale. In condizioni basali, non c'era differenza tra i genotipi. Tuttavia, dopo la stimolazione del glucosio, è stato osservato un rapido e significativo aumento dell'assorbimento di glucosio nei mutanti TDP-43 rispetto al controllo.In una rappresentazione a barre, la stimolazione del glucosio nei neuroni che esprimono il sensore di glucosio ha dimostrato un piccolo ma significativo aumento del rapporto FRET per CFP rispetto al basale. Al contrario, i neuroni che esprimono TDP-43 hanno mostrato un aumento significativo del rapporto alla stimolazione rispetto al basale. La differenza netta nei rapporti FRET per CFP tra i motoneuroni che esprimono TDP-43 e il sensore di glucosio è di circa il 10,9% La gestione del tempo è fondamentale per questa procedura in modo che i neuroni non muoiano nel corso dell'imaging.È importante visualizzare immediatamente dopo le dissezioni per evitare questo. Questa tecnica ha evidenziato l'importanza del metabolismo del glucosio nei neuroni e ha portato il nostro gruppo a studiare ulteriormente il ruolo della glicolisi nella rigenerazione dei motoneuroni.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

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Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

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Neuroscienze

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Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

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Biologia cellulare quantitativa della neurodegenerazione in Drosophila attraverso analisi imparziale delle proteine fluorescente contrassegnate usando ImageJ

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