Name: measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy
Uploaded: 2021-08-03T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

Stefanie Schirmeier ve Takeshi Iwatsubo'ya Drosophila suşları sağladıkları için teşekkür ederiz. Patricia Jansma'ya Arizona Üniversitesi'ndeki Marley Görüntüleme Çekirdeği'nde görüntülemeye yardımcı olduğu için de teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri NIH NS091299, NS115514 (DCZ'ye), HHMI Gilliam Bursu (EM'ye) ve Lisans Biyolojisi Araştırma Programı (HB'ye) tarafından finanse edildi.

UAS FLII12Pglu-700μδ6 transgenik sinekler Volkenhoff ve ark.10'da bildirilmiştir ve Dr. S. Schirmeier tarafından nazikça sağlanmıştır. UAS TDP-43G298S transgenik hatları Dr. T. Iwatsubo13tarafından sağlanmıştır. Zarnescu laboratuvarında standart genetik yaklaşımlar kullanılarak hem UAS FLII12Pglu-700μδ6 hem de UAS TDP-43 transgenes barındıran rekombinant Drosophila hatları üretildi ve Manzo veark. D42 GAL4...

<ol>
	<li>Ingre, C., Roos, P. M., Piehl, F., Kamel, F., Fang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risk+factors+for+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Risk factors for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Clinical Epidemiology. 7, 181-193 (2015).</li><li>Dupuis, L., Pradat, P. F., Ludolph, A. C., Loeffler, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energy+metabolism+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Energy metabolism in amyotrophic lateral sclerosis.</a> The Lancet Neurology. 10 (1), 75-82 (2011).</li><li>Buratti, E., Baralle, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+functional+implications+of+the+RNA+binding+properties+of+nuclear+factor+TDP-43,+a+novel+splicing+regulator+of+CFTR+exon+9.">Characterization and functional implications of the RNA binding properties of nuclear factor TDP-43, a novel splicing regulator of CFTR exon 9.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (39), 36337-36343 (2001).</li><li>Polymenidou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+pre-mRNA+depletion+and+RNA+missplicing+contribute+to+neuronal+vulnerability+from+loss+of+TDP-43.">Long pre-mRNA depletion and RNA missplicing contribute to neuronal vulnerability from loss of TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 459-468 (2011).</li><li>Tollervey, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nature Neuroscience. 14 (4), 452-458 (2011).</li><li>Ling, S. C., Polymenidou, M., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Converging+mechanisms+in+ALS+and+FTD:+disrupted+RNA+and+protein+homeostasis.">Converging mechanisms in ALS and FTD: disrupted RNA and protein homeostasis.</a> Neuron. 79 (3), 416-438 (2013).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wild-type+and+A315T+mutant+TDP-43+exert+differential+neurotoxicity+in+a+Drosophila+model+of+ALS.">Wild-type and A315T mutant TDP-43 exert differential neurotoxicity in a Drosophila model of ALS.</a> Human Molecular Genetics. 20 (12), 2308-2321 (2011).</li><li>Estes, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+neurons+and+glia+exhibit+specific+individualized+responses+to+TDP-43+expression+in+a+Drosophila+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Motor neurons and glia exhibit specific individualized responses to TDP-43 expression in a Drosophila model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 6 (3), 721-733 (2013).</li><li>Manzo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolysis+upregulation+is+neuroprotective+as+a+compensatory+mechanism+in+ALS.">Glycolysis upregulation is neuroprotective as a compensatory mechanism in ALS.</a> eLife. 8, 45114 (2019).</li><li>Volkenhoff, A., Hirrlinger, J., Kappel, J. M., Klambt, C., Schirmeier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+using+a+FRET+glucose+sensor+reveals+glucose+delivery+to+all+cell+types+in+the+Drosophila+brain.">Live imaging using a FRET glucose sensor reveals glucose delivery to all cell types in the Drosophila brain.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 55-64 (2018).</li><li>Fehr, M., Lalonde, S., Lager, I., Wolff, M. W., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+the+dynamics+of+glucose+uptake+in+the+cytosol+of+COS-7+cells+by+fluorescent+nanosensors.">In vivo imaging of the dynamics of glucose uptake in the cytosol of COS-7 cells by fluorescent nanosensors.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (21), 19127-19133 (2003).</li><li>Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GLUT1+and+GLUT9+as+major+contributors+to+glucose+influx+in+HepG2+cells+identified+by+a+high+sensitivity+intramolecular+FRET+glucose+sensor.">GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor.</a> Biochimedica et Biophysica Acta. 1778 (4), 1091-1099 (2008).</li><li>Ihara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+binding+mediates+neurotoxicity+in+the+transgenic+Drosophila+model+of+TDP-43+proteinopathy.">RNA binding mediates neurotoxicity in the transgenic Drosophila model of TDP-43 proteinopathy.</a> Human Molecular Genetics. 22 (22), 4474-4484 (2013).</li><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Diaz-Garcia, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+in+vivo+imaging+of+neuronal+glucose+concentrations+with+a+genetically+encoded+fluorescence+lifetime+sensor.">Quantitative in vivo imaging of neuronal glucose concentrations with a genetically encoded fluorescence lifetime sensor.</a> Journal of Neuroscience Research. 97 (8), 946-960 (2019).</li><li>Mergenthaler, P., Lindauer, U., Dienel, G. A., Meisel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sugar+for+the+brain:+the+role+of+glucose+in+physiological+and+pathological+brain+function.">Sugar for the brain: the role of glucose in physiological and pathological brain function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (10), 587-597 (2013).</li><li>Lu, B., Vogel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+models+of+neurodegenerative+diseases.">Drosophila models of neurodegenerative diseases.</a> Annual Review of Pathology. 4, 315-342 (2009).</li></ol>

Burada ayrıntılı olarak açıklanan teknik, glikoz seviyelerindeki değişiklikleri milimolerbiraralık 10 , 11,12'ye kadar algılayabilen FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak canlı Drosophila'ya belirli bir hücre türünde glikoz alımını ölçmek içinuygulanabilir. Bu sensör daha önce UAS-GAL4 sistemi ile birlikte, ifadesini nöronlar9,<sup class...

Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS) şu anda tedavi edilemeyen ilerleyici bir nörodejeneratif bozukluktur. ALS, tanıdan sonraki 2-5 yıl içinde motor koordinasyon kaybına, geri dönüşü olmayan felce, solunum yetmezliğine ve nihai ölüme yol açan üst ve alt motor nöronları etkiler1. ALS kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm gibi metabolik defektlerle ilişkilidir(2'degözden geçirilmiştir); bununla birlikte, metabolizmadaki bu değişikliklerin motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. ALS ve ilgili nörodejeneratif hastalıklarda ortak bir payda, RNA işleme 3,4 , 5'in çeşitli adımlarında yer alan nükleik asit bağlayıcı bir protein olan TDP-43'tür. TDP-43'teki mutasyonlar hastaların sadece %3-5'ini etkilese de, ALS vakalarının %97'> sinde sitoplazmik agregalarda vahşi tip TDP-43 proteini bulunur(6'dagözden geçirilmiştir). Bu patoloji Drosophila'da, sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış ömür dahil olmak üzere ALS'nin birçok yönünü yeniden oluşturan motor nöronlarda insan wildtype veya mutant TDP-43'ün (G298S) aşırı ifade edilmesiyle modellenmiştir7,8. Bu modeller kullanılarak, son zamanlarda TDP-43 proteinopatisinin piruvat seviyelerinde ve glikoliz9'unhız sınırlayıcı enzimi olan fosfolroktokinaz (PFK) mRNA'da önemli bir artışa neden olduğu bildirilmiştir. PFK transkriptlerinde benzer artışlar hasta kaynaklı motor nöronlarda ve omuriliklerde de bulundu ve glikolizin TDP-43 proteinopatisi bağlamında güncellendiğini düşündürmektedir. İlginçtir ki, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanarak glikolizdeki daha fazla artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde, dejenere motor nöronlarda telafi edici, nöroprotektif bir mekanizma ile tutarlı olarak, lokomotor disfonksiyonu ve artan yaşam süresi gibi birkaç ALS fenotipini hafifletti.
Glikolizdeki değişiklikleri daha fazla araştırmak ve TDP-43 proteinopatisinin Drosophila modellerinde glikoz alımını ölçmek için, daha önce bildirilen genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı sensör FLII12Pglu-700μδ610, özellikle UAS-GAL4 ekspresyon sistemi kullanılarak motor nöronlarda ifade edildi. FLII12Pglu-700μδ6 glikoz sensörü, glikozu hücresel düzeyde tespit etmek için yeşil floresan protein, siyan ve sarı floresan proteinlerin (CFP ve YFP) iki çeşidi arasında rezonans enerjisi transferi kullanır. Molekülün zıt uçlarında CFP ve YFP'ye kaynaşmış E. coli MglB geninden bakteriyel glikoz bağlayıcı etki alanından oluşur. Bir glikoz molekülüne bağlandığında, sensör CFP ve YFP'yi birbirine yaklaştıran ve FRET'in oluşmasına izin veren, daha sonra hücre içi glikoz seviyelerini ölçmek için kullanılabilecek konformasyonel bir değişikliğe uğrar10,11,12 ( Şekil1). Burada, FLII12Pglu-700μδ6 sensörünün motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin neden olduğu glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için nasıl kullanılabileceğini gösteriyoruz. Burada açıklanan deneyler, ALS ile ilişkili bir mutant olan TDP-43G298S'nin motor nöronlarda aşırı ifade alınmasının, kontrollere kıyasla glikoz alımında önemli bir artışa neden olduğunu göstermektedir. Bu yaklaşım, nörodejenerasyonla ilişkili glikoz alımındaki değişiklikleri belirlemek için diğer ALS türlerinde (örneğin, SOD1, C9orf72, vb.) ve/veya diğer hücre tiplerinde (örneğin, glia, kaslar) kullanılabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm tissue culture dishes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430165</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40X water immersion lens</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>440090</td>
			<td>dippable, N.A. 0.8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dissection scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100189-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minutien pins</td>
			<td>Fine Science tools</td>
			<td>26002-10</td>
			<td>used for dissections</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow</td>
			<td>1317318</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM880 NLO upright multiphoton/confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

measuring glucose uptake in drosophila models of tdp-43 proteinopathy

Amyotrofik lateral skleroz, tanıyı takip eden 2-5 yıl içinde ilerleyici kas güçsüzlüğüne ve ölüme neden olan nörodejeneratif bir bozukluktur. Klinik bulgular arasında kilo kaybı, dislipidemi ve hipermetabolizm sayılabilir; bununla birlikte, bunların motor nöron dejenerasyonu ile nasıl ilişkili olduğu belirsizliğini korumaktadır. Sitoplazmik inklüzyonlar, lokomotor disfonksiyonu ve azaltılmış yaşam süresi dahil olmak üzere ALS'nin çeşitli özelliklerini yeniden sağlayan bir Drosophila TDP-43 proteinopati modeli kullanarak, yakın zamanda geniş kapsamlı metabolik eksiklikler tespit ettik. Bunlar arasında glikolizin güncel olduğu tespit edildi ve genetik etkileşim deneyleri telafi edici bir nöroprotektif mekanizma için kanıt sağladı. Nitekim, glikolizde enzim oranını sınırlayan fosfolreküsyona rağmen, diyet ve genetik manipülasyonlar kullanılarak glikolizde bir artış, TDP-43 proteinopatisinin sinek modellerinde lokomotor disfonksiyonunu ve yaşam süresini artırdığı gösterilmiştir. Motor nöronlarda TDP-43 proteinopatisinin glikolitik akı üzerindeki etkisini daha fazla araştırmak için, daha önce genetik olarak kodlanmış, FRET tabanlı bir sensör olan FLII12Pglu-700μδ6 kullanıldı. Bu sensör, bakteriyel glikoz algılama etki alanı ve FRET çifti olarak siyan ve sarı floresan proteinlerden oluşur. Glikoz bağlanması üzerine sensör, FRET'in gerçekleşmesine izin vererek konformasyonsal bir değişikliğe uğrar. FLII12Pglu-700μδ6 kullanılarak, glikoz alımının ALS'ye neden olan bir varyant olan TDP-43G298S'yiifade eden motor nöronlarda önemli ölçüde arttığı bulunmuştur. Burada, TDP-43 proteinopatisi bağlamında Glikoz sensörü FLII12Pglu-700μδ6'yı ifade eden larva ventral sinir kordonu preparatlarında glikoz alımının nasıl ölçüldüğünü gösteriyoruz. Bu yaklaşım, glikoz alımını ölçmek ve farklı hücre tiplerinde glikolitik akıyı değerlendirmek veya ALS ve ilgili nörodejeneratif bozukluklara neden olan çeşitli mutasyonlar bağlamında kullanılabilir.

Ventral sinir kordonu (VNC), ex vivo glikoz sensörünün görüntü alımı TDP-43'e dayalı bir DROSOPHILA ALS modelinde glikoz alımındaki farklılıkları belirlemek için genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı bir glikoz sensörü kullanılmıştır. Sensör, CFP ve YFP'den oluşuyor ve E. coli MglB geninden glikoz bağlama alanına kaynaştı. Glikoz bağlama, CFP ve YFP 10 , 11,<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy at JoVE.com

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

TAR DNA bağlayıcı protein (TDP-43) proteinopatisi tarafından etkilenen Drosophila motor nöronlarında, FRET tabanlı, genetik olarak kodlanmış bir glikoz sensörü tarafından belirtildiği gibi glikoz alımı artar.

TDP-43 Proteinopatisinin Drosophila Modellerinde Glikoz Alımının Ölçülmesi

Amyotrophic lateral sclerosis is a neurodegenerative disorder causing progressive muscle weakness and death within 2-5 years following diagnosis. Clinical ...

Bu teknik önemlidir, çünkü canlı Drosophila dokularındaki belirli hücrelerde glikoz alımını ölçebilir. FRET tabanlı sensör, hücre içi glikoz seviyelerindeki değişikliklerin doğrudan ölçüsünü sağlar. Bu teknik, araştırmacıların ALS modellerinden canlı motor nöronlar içinde kontrollere karşı glikoz seviyelerindeki değişiklikleri gerçek zamanlı olarak değerlendirmelerini sağlar.Zorlu bir husus, tamponu değiştirdikten sonra aynı nöron kümesini görüntülemektir. Numuneyi mikroskopta bırakmak, VMC'nin mümkün olduğunca az hareket etmesine yardımcı olur. Diseksiyonlara başlamadan önce görüntüleme mikroskobu ve lazerleri açın.Daha sonra dolaşan üçüncü bir instar larva toplayın, çift damıtılmış su ile durulayın ve daha önce hazırlanmış bir elastomer astarlı kabın üzerine bir damla HL3 tampona yerleştirin. Daha sonra bir diseksiyon mikroskobu altında, larvayı böcek pimleriyle uzunluk açısından dikkatlice gererek larvanın ön ve arka uçlarını, dorsal tarafı yukarı sabitlemek için bir çift ön uç kullanın. Açılı bir çift Iris makası kullanarak, arka pimin hemen üzerinde bir kesi yapın.Daha sonra kesiden larvaların ön ucuna doğru dikey bir kesim yapın. Gerekirse birkaç damla HL3 tamponu ekledikten sonra, merkezi sinir sistemini bozmadan trakeayı ve yüzen organların geri kalanını çıkarın. Daha sonra kanatları sabitleyerek, nöromüsküler sistemi sağlam tutarken merkezi sinir sistemini ortaya çıkarmak için vücut duvarını gerin.Görüntü alımı için 40 kat su daldırma lensi ile dik konfokal mikroskop kullanın. Ardından CFP'yi heyecanlandırmak için 405 nanometre lazeri seçin. Ardından, tarama hızı, ortalama, hedef, yakınlaştırma iğne deliği boyutu ve uzamsal çözünürlük gibi edinme parametrelerini optimize edin.Kazancı, sinyalin en uygun dinamik aralıkta olması için ayarlayın ve tüm genotipler için aynı parametreleri kullanın. Motor nöronları ventral sinir kordonu içinde görüntülemek için, diseksiyonlu numuneye sahip silikon kabı lensin altına yerleştirin ve trehaloz sakkaroz HL3 tamponu ile temas etmesi için lensi küçümseyin. Lensin arabelleğe tamamen batırıldığından emin olun ve gerekirse daha fazla arabellek ekleyin. Önümüzdeki.CFP ve FRET kanallarını kullanarak, ventral sinir kordonu orta çizgisi boyunca bulunan odaktaki en az altı motor nörondan oluşan bir optik seçimi manuel olarak seçin. Ardından 10 dakika boyunca her 10 saniyede bir görüntü alın. Bu görüntüler taban çizgisini temsil eder.Glikoz stimülasyonu için Pasteur pipet kullanarak HL3 tamponu içeren trehaloz sakkarozunu çıkarın ve ventral sinir kordonunu hareket ettirmeden beş milimoler glikoz takviyeli HL3 tamponu ekleyin. Ardından 10 dakikada bir 10 dakikada bir görüntü alın. Bu görüntüler stimülasyon aşamasını temsil eder.Görüntüleri CZI dosyaları veya görüntüleme yazılımı tarafından desteklenen herhangi bir dosya türü olarak tarih, genetik arka plan, deneysel durum ve kullanılan kanallar dahil olmak üzere bir dosya adıyla kaydedin. Tüm genotipleri görüntülemek için parametreleri yeniden kullanın. Görüntü işleme için Fiji-ImageJ görüntüleme yazılımını açın, ardından CZI dosyalarını açın, hiper yığınla görünüm yığınını seçin ve renk modunu gri ölçeğe ayarlayın ve kanalları ayrı pencerelere bölün. Önümüzdeki.Drift düzeltme eklentileri, turbo reg ve stack reg kullanarak görüntüleri işleyin. Her kanal, eklentiler altında yığın reg'i seçip çeviriye dönüştürmeyi seçerek ayrı ayrı düzeltilir. Tüm zaman serisi boyunca odakta kalan tüm motor nöronları izleyerek ilgi alanlarını veya ROI'leri manuel olarak seçin.Ardından, her motor nöron anahattını kaydetmek için yatırım getirisi yöneticisini kullanın. Her zaman noktasındaki her yatırım getirislerindeki ortalama gri değeri ölçmek için çok ölçüm işlevini kullanın. Ardından, ilk kanaldan izlenen ROI'leri, uyarım öncesi görüntü için ikinci kanala kopyalayın.Veri analizi için, FRET ve CFP kanallarının ortalama gri değerlerini kullanarak FRET'i CFP oranına göre hesaplayın. FRET'te CFP oranlarına göre yapılan değişiklikler hücre içi glikoz konsantrasyonundaki değişiklikleri yansıtır. Ardından FRET'i her yatırım getirisi ve zaman noktası için cfp oranlarına göre çizin.Motor nöronlarda glikoz alımını ölçmek için genetik olarak kodlanmış FRET tabanlı bir glikoz sensörü kullanıldı. Glikoz sensöre bağlı olmadığında, CFP ekscitasyonu yalnızca CFP emisyonuna neden olur. Glikoz bağlandığında, CFP ve YFP arasında meydana gelen FRET nedeniyle YFP sinyali tespit edilebilir.Burada gösterilenler, TDP-43 mutant nöronlarında temel ve stimülasyon koşullarında glikoz sensörü kontrollerinde FRET ve CFP sinyallerinin görüntüleridir. Her görüntüde yatırım getirisi örneği olarak temsili bir motor nöron özetlenmiştir. Glikoz stimülasyonu üzerine, glikoz sensörlerini ifade eden kontrol motor nöronları, Glikoz alımında küçük bir artış gösterirken, TDP-43'ü ifade eden nöronlar önemli ölçüde daha yüksek bir glikoz alımı gösterdi.TDP-43 mutant motor nöronların CFP oranları ile daha fazla FRET, her zaman noktasında glikoz sensörü kontrollerine normalleştirildi. Temel koşullar altında, genotipler arasında bir fark yoktu. Bununla birlikte, glikoz stimülasyonu üzerine, TDP-43 mutantlarında kontrole kıyasla glikoz alımında hızlı ve önemli bir artış gözlenmiştir.Bir çubuk grafik gösteriminde, glikoz sensörunu ifade eden nöronlardaki glikoz stimülasyonu, temele kıyasla FRET'te CFP oranına göre küçük ama önemli bir artış göstermiştir. Buna karşılık TDP-43'i ifade eden nöronlar, stimülasyona bağlı olarak taban çizgisine göre önemli bir oran artışı göstermiştir. TDP-43'ü ifade eden motor nöronlar ile glikoz sensörü arasındaki CFP oranları ile FRET'teki net fark%10,9 civarındadır Zaman yönetimi bu prosedür için kritik öneme sahiptir, böylece nöronlar görüntüleme sırasında ölmezler.Bunu önlemek için diseksiyonları hemen takip etmek önemlidir. Bu teknik, nöronlarda glikoz metabolizmasının önemini vurgulamış ve grubumuzun glikolizin motor nöron yenilenmesindeki rolünü daha fazla araştırmasına yol açmıştır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Measuring Glucose Uptake in Drosophila Models of TDP-43 Proteinopathy

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration

Assaying Lokomotor, Öğrenme ve Hafıza Açıkları. Drosophila Nörodejenerasyon, modeller

Advances in genetic methods have enabled the study of genes involved in human neurodegenerative diseases using Drosophila as a model system1. Most of ...

Measuring Motor Coordination in Mice

Farelerde Motor Koordinasyon Ölçüm

Mice are increasingly being used in behavioral neuroscience, largely replacing rats as the behaviorist's animal of choice. Before aspects of behavior such ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

An Inexpensive, Scalable Behavioral Assay for Measuring Ethanol Sedation Sensitivity and Rapid Tolerance in Drosophila

Etanol sedasyon Hassasiyet ve hızlı Hoşgörü Ölçüm Ucuz bir, Ölçeklenebilir Davranış Deneyi<em&gt; Drosophila</em

Alcohol use disorder (AUD) is a serious health challenge. Despite a large hereditary component to AUD, few genes have been unambiguously implicated in ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Ölçme ve Male Değiştirme Çiftleşme Sürücü<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, ...

Measuring Synaptic Vesicle Endocytosis in Cultured Hippocampal Neurons

Sinaptik vezikül endositoz kültürlü Hipokampal nöronlar içinde ölçme

During endocytosis, fused synaptic vesicles are retrieved at nerve terminals, allowing for vesicle recycling and thus the maintenance of synaptic ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Quantitative Cell Biology of Neurodegeneration in Drosophila Through Unbiased Analysis of Fluorescently Tagged Proteins Using ImageJ

Ateş Drosophila ImageJ kullanarak Fluorescently Tagged proteinlerin tarafsız analizi ile yılında niceliksel hücre biyolojisi

With the rising prevalence of neurodegenerative diseases, it is increasingly important to understand the underlying pathophysiology that leads to neuronal ...

Alternate Immersion in Glucose to Produce Prolonged Hyperglycemia in Zebrafish

Zebra Balıklarında Uzun Süreli Hiperglisemi Üretmek için Glikozda Alternatif Daldırma

Zebrafish (Danio rerio) are an excellent model to investigate the effects of chronic hyperglycemia, a hallmark of Type II Diabetes Mellitus (T2DM). This ...

Semi-Quantitative Determination of Dopaminergic Neuron Density in the Substantia Nigra of Rodent Models using Automated Image Analysis

Otomatik Görüntü Analizi Kullanılarak Kemirgen Modellerinin Substantia Nigra'sında Dopaminerjik Nöron Yoğunluğunun Yarı Nicel Belirlenmesi

Estimation of the number of dopaminergic neurons in the substantia nigra is a key method in pre-clinical Parkinson's disease research. Currently, unbiased ...