Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

تم دعم هذا البحث من قبل مؤسسة أبحاث السرطان / منحة الرابطة السويسرية للسرطان KFS-4125-02-2017 إلى RKD ومنحة المعهد الوطني للصحة DK079307 إلى EKJ.

1. ثقافة الخلية
ملاحظة: إجراء التعامل مع الخلايا في ظل ظروف معقمة.
<ol><li>زراعة الخلايا البطانية الوريدية البشرية (HUVECs)<ol>
<li>معطف 75 سم2 قوارير مع الكولاجين (5 ميكروغرام / سم2)(ذيل الفئران) بين عشية وضحاها (ON) في درجة حرارة الغرفة (RT) أو 2-3 ساعة في 37 درجة مئوية، وشطف بالماء?...

بالمقارنة مع ثقافات الخلايا 2D ، فإن تقنية ثقافة كروية ثلاثية الأبعاد الثورية هي أداة أفضل وأكثر قوة لإعادة بناء البيئة الدقيقة للجهاز ، وتفاعلات خلايا الخلية ، واستجابات الدواء في المختبر. هذا هو البروتوكول الأول الذي يصف تشكيل كرويات من خطوط الخلايا المتعددة الخلايا (الظهارية والظ?...

استخدام الحيوانات للتجارب له حدود. لا يمكن للدراسات الحيوانية أن تحاكي بدقة تطور المرض لدى البشر، وليس لدى الحيوانات والبشر استجابات متطابقة لمسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، القيود المفروضة على التجارب على الحيوانات بسبب المخاوف من معاناة الحيوانات والمشاكل الأخلاقية1,2 تقييد برامج البحث بشكل متزايد. In vitro وقد وضعت نظم على نطاق واسع للتحايل على استخدام الحيوانات؛ وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا البشرية جعلت in vitro نماذج أكثر ملاءمة للتحقيق المرضي والعلاجي. تستخدم ثقافات الخلايا أحادية الطبقة التقليدية (2D) على نطاق واسع لأنها تحاكي الأنسجة البشرية إلى حد ما. ومع ذلك ، تفشل الثقافات الأحادية 2D في محاكاة الأعضاء البشرية ، ولا تستطيع الثقافات الأحادية 2D محاكاة البيئة الدقيقة المعقدة للأعضاء الأصلية وتقليد in vivo موقف3,4,5,6. بالإضافة إلى ذلك ، في ثقافات الخلايا أحادية الطبقة ، يمكن أن تدمر العلاجات الدوائية / تلحق الضرر بكل الخلايا بسهولة. الأهم من ذلك ، يمكن التغلب على بعض هذه القيود عن طريق التحول إلى متعدد الطبقات ثلاثي الأبعاد (3D) ثقافات الخلية7,8. في الواقع، أظهرت نماذج الثقافة ثلاثية الأبعاد أنها تعكس بشكل أفضل البنية الخلوية والتخطيط ووظيفة الخلايا في الأنسجة الأولية. يمكن تشكيل هذه الثقافات ثلاثية الأبعاد باستخدام مجموعة متنوعة من خطوط الخلايا ، على غرار الجهاز الوظيفي. في الواقع ، هناك نموذجان من الثقافات ثلاثية الأبعاد. نموذج واحد ينتج كرويدات من الخلايا المجمعة التي تشكل مجموعات وإعادة تنظيمها في المجالات (نماذج خالية من السقالات). والثاني ينتج organoids ، التي لديها بنية أكثر تعقيدا وتتألف من مجموعات من خلايا متعددة خاصة بالأعضاء ، والتي تعتبر نسخة مصغرة من الأعضاء9,10. ونتيجة لهذا، تمثل أنظمة الثقافة ثلاثية الأبعاد تقنية مبتكرة مع العديد من التطبيقات البيولوجية والسريرية. وهكذا ، فإن كرويدات و organoids لديها العديد من التطبيقات لنمذجة الأمراض والدراسات المتعلقة الطب التجديدي ، وفحص الأدوية ، والدراسات السمية6,11,12,13,14,15. كرويات مسرطنة، مستمدة من التكنولوجيا ثلاثية الأبعاد، إعادة مورفولوجيا والنمط الظاهري لأنواع الخلايا ذات الصلة، تحاكي in vivo البيئة الدقيقة الورم، ونموذج الاتصالات الخلية ومسارات الإشارات التي تعمل أثناء تطور الورم16,17,18. بالإضافة إلى ذلك ، لتحسين فهم بيولوجيا السرطان ، يمكن أيضا استخدام كرويدات / عضويات الورم لتحديد علاج محتمل مضاد للسرطان خاص بالمرضى (شخصي) وتقييم فعاليته وسمية وآثاره على المدى الطويل19,20,21,22. وقد فتحت Spheroids فرصا بارزة للتحقيق في علم وظائف الأعضاء المرضية ، والنمذجة المرض وفحص المخدرات بسبب قدرتها على الحفاظ على بنية الأنسجة الخلوية وثلاثية الأبعاد ، والقدرة على تقليد in vivo الوضع ، والتفاعلات الخلية الخلية. ومع ذلك ، يجب على المرء أيضا أن يكون على بينة من القيود المفروضة على هذا النظام ، مثل عدم وجود مكون الأوعية الدموية / الجهاز الجهازي ، والجهاز المناعي الوظيفي أو العصبي ، ويمثل النظام نهجا اختزاليا بالمقارنة مع النماذج الحيوانية. في الواقع ، على النقيض من النماذج الحيوانية ، لا توفر الهياكل ثلاثية الأبعاد سوى تقريب البيولوجيا داخل جسم الإنسان. قد يساعد فهم قيود الطريقة ثلاثية الأبعاد الباحثين على تصميم عمليات أكثر دقة وصالحة لإنتاج كرويدات تمثل جهازا بشكل أفضل على نطاق أوسع23,24,25.
السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في جميع أنحاء العالم، وسرطان الثدي هو السرطان الأكثر شيوعا لدى النساء26،27،28. لمحاكاة البيئة الدقيقة المعقدة لسرطان الثدي، يجب استزراع كرويات سرطان الثدي باستخدام الخلايا التي تلعب دورا بارزا في أورام الثدي، أي الخلايا الظهارية والخلايا البطانية والخلايا الليفية و/أو الخلايا المناعية. وعلاوة على ذلك، بالنسبة للكفرويد الذي يمثل سرطان الثدي، ينبغي أيضا النظر في التعبير عن مستقبلات الهرمونات الأنثوية (مستقبلات هرمون الاستروجين/البروجسترون)، والقدرة على الحفاظ على الحالة النسيجية للورم المريض، والقدرة على محاكاة الاستجابة للعلاج. وقد أظهرت الدراسات أن أنظمة 3D المشاركة في الثقافة لديها تنظيم الخلوية مماثلة لتلك التي من الأنسجة الأولية في الجسم الحي,لديها القدرة على التفاعل في الوقت الحقيقي للمحفزات, ولها مستقبلات الاندروجين وظيفية29,30,31,32. وبالتالي ، يمكن أن يكون نهجا مماثلا مفيدا لمحاكاة ورم الثدي في المختبر. الغرض من البروتوكول الحالي هو إنشاء طريقة جديدة لتوليد كرويدات سرطان الثدي. تستخدم هذه الطريقة خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات الإستروجين (خط خلايا بشرية خالدة من الخلايا الظهارية) والخلايا البطانية الوعائية (HUVECs) أو الخلايا البطانية اللمفاوية (HMVEC-DNeo) لإنشاء نموذج يحاكي أو يعكس عن كثب التفاعلات بين هذه الخلايا داخل الورم. على الرغم من أن MCF-7 (الإستروجين استجابة) والخلايا البطانية قد استخدمت لتطوير كرويدات في هذه الدراسة, خلايا أخرى مثل الخلايا الليفية التي تمثل ~ 80٪ من كتلة ورم الثدي, ويمكن أيضا أن تكون مجتمعة في المستقبل لتمثيل أفضل وتقليد ورم الثدي.
هناك عدة طرق لتشكيل كرويدات، مثل: 1) طريقة القطيرات المعلقة التي تستخدم الجاذبية33،34؛ 2) طريقة الارتفاع المغناطيسي الذي يستخدم الجسيمات النانوية المغناطيسية يتعرض لمغناطيس خارجي35، و 3) طريقة لوحة كروية الدقيقة التي يتم تنفيذها من قبل خلايا البذر على لوحات منخفضة المرفق36،37. على أساس الأساليب الموجودة، والتي تستخدم نوع خلية واحدة فقط، وقد تم الأمثل البروتوكول الحالي باستخدام الخلايا الظهارية والظهارية لمحاكاة أفضل لظروف نمو أورام سرطان الثدي في الجسم الحي38،39،40،41. ويمكن تحقيق هذه الطريقة بسهولة في المختبر بتكلفة منخفضة وبأقل قدر من الاحتياجات من المعدات. وبناء على حاجة/أهداف المختبر، استخدمت نهج مختلفة لتشكيل كرويدات والحصول على المواد الخلوية ذات الصلة من هذه الكرويات. في هذا السياق ، بالنسبة لتحليل الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي أو البروتين ، يتم إنتاج كرويدات ثلاثية الأبعاد عن طريق الخلايا البطانية والظهارية المشتركة مع طريقة الإسقاط المعلق. ومع ذلك ، للدراسات الوظيفية ، على سبيل المثال ، لمراقبة نمو الخلايا بعد التدخل القصير (siRNA) العدوى و / أو العلاج الهرموني ، يتم إنشاء كرويدات باستخدام لوحات U-bottom.
الغرض من هذا البروتوكول التقني هو تقديم وصف مفصل خطوة بخطوة ل1) تشكيل سرطان الثدي كرويدات متعددة الخلايا، 2) إعداد عينات لتلطيخ الخلايا النسيجية، و 3) جمع الخلايا لاستخراج الحمض النووي الريبي، الحمض النووي، والبروتينات. يتم استخدام كل من طريقة إسقاط شنقا غير مكلفة ولوحات U-أسفل أكثر تكلفة لتشكيل كرويدات. هنا، يتم توفير بروتوكول لإعداد (تحديد) كرويات للقسم والتلوي المناعي اللاحق مع علامات لتقييم انتشار الخلايا، وموت الخلايا المبرمج، وتوزيع الخلايا الظهارية والظهارية داخل كروية. بالإضافة إلى ذلك، يعرض هذا البروتوكول تحليلا كاملا خطوة بخطوة للبيانات النسيجية باستخدام برنامج ImageJ. يختلف تفسير البيانات البيولوجية حسب نوع التجربة والأجسام المضادة المستخدمة. تم إجراء تقسيم كرويات ثابتة وتلطيخ لاحق للأقسام من قبل مختبر علم الأمراض الروتيني (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

سرطان الثدي هو السبب الرئيسي للوفيات بين النساء. نمو خلايا سرطان الثدي ونقائلها اللاحقة هو عامل رئيسي لتطورها. على الرغم من أن الآليات المشاركة في تعزيز نمو سرطان الثدي قد درست بشكل مكثف باستخدام الثقافات الأحادية لخلايا سرطان الثدي مثل خلايا MCF-7 ، إلا أنه لم يتم التحقيق بعمق في مساهمة أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية التي تشارك بشكل وثيق في نمو الورم. التفاعل بين الخلية والخلية يلعب دورا رئيسيا في نمو الورم وتطوره. تكوين النيوانجيوجينيسيس، أو تطور الأوعية، أمر ضروري لنمو الورم، في حين أن الجهاز اللمفاوي بمثابة بوابة لهجرة الخلايا السرطانية والانبثاث اللاحق. تقدم الدراسات الحديثة أدلة على أن الخلايا البطانية الوعائية واللمفاوية يمكن أن تؤثر بشكل كبير على نمو الخلايا السرطانية. هذه الملاحظات تعني الحاجة إلى تطوير نماذج في المختبر من شأنها أن تعكس بشكل أكثر واقعية عمليات نمو سرطان الثدي في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، تتطلب القيود المفروضة على البحوث الحيوانية تطوير نماذج الجسم الحي السابق لتوضيح أفضل للآليات المعنية.
توضح هذه المقالة تطور كرويات سرطان الثدي المكونة من كل من خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF-7 الإيجابية لمستقبلات هرمون الاستروجين) والخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية. يصف البروتوكول نهجا مفصلا خطوة بخطوة في إنشاء كرويات ثنائية الخلية باستخدام نهجين مختلفين ، إسقاط معلق (معيار الذهب ورخيصة) ولوحات U-bottom 96 جيدا (مكلفة). يتم توفير تعليمات متعمقة لكيفية التقاط بدقة كرويات شكلت لرصد النمو عن طريق التحجيم المجهري وتقييم الجدوى باستخدام تلطيخ الخلايا الميتة والحية. وعلاوة على ذلك، يتم تحديد إجراءات لإصلاح كرويدات للتقسم وتلطيخ مع الأجسام المضادة الخاصة بالنمو للتمييز بين أنماط النمو في كرويدات. بالإضافة إلى ذلك، يتم توفير تفاصيل لإعداد كرويدات مع الخلايا المصابة وأساليب لاستخراج الحمض النووي الريبي للتحليل الجزيئي. في الختام، توفر هذه المقالة تعليمات متعمقة لإعداد كرويات متعددة الخلايا لأبحاث سرطان الثدي.

نموذج كرويدات باستخدام الثقافات الظهارية والظهارية المشتركة مطلوب لمحاكاة عن كثب في ظروف الجسم الحي من أورام الثدي للتجارب في المختبر. يصور المخطط في الشكل 1 البروتوكول لتشكيل كرويات مع خلايا ظهارية سرطان الثدي والخلايا البطانية الوعائية أو اللمفاوية (<strong class="x...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

تساهم المحادثات المتقاطعة بين الخلايا الظهارية الثديية والخلايا البطانية بشكل كبير في تطور سرطان الثدي ونمو الورم والانبثاث. في هذه الدراسة، تم صنع كرويدات من خلايا سرطان الثدي جنبا إلى جنب مع الخلايا البطانية الوعائية و / أو اللمفاوية وإثبات قابليتها للتطبيق كنظام في المختبر لأبحاث سرطان الثدي.

ماماري الظهارية والبطانية الخلايا كرويدات كنموذج وظيفي محتمل في المختبر لأبحاث سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

سوف الكرويات خلايا سرطان الثدي الموصوفة هنا تسمح للباحثين للتحقيق في الآليات الجزيئية للتفاعلات الخلايا البطانية الخلايا السرطانية التي تشارك في انتشار وانبثاث الخلايا السرطانية. الميزة الرئيسية لهذا النموذج 3D هو أنه يوفر ترتيب الخلوية أكثر واقعية أن يحسن موثوقية الاستدلالات بشأن الفيزيولوجيا المرضية وعلاج سرطان الثدي. إثبات الإجراء سيكون جيوفانا أزاريتو، طالبة دكتوراه من مختبري.ابدأ بعلاج أو إعادة إصابة الخلايا المطلية لمدة 24 ساعة، أو حسب الرغبة. لتحديد توزيع الخلايا في كروية، اغسل الخلايا مع ملليلتر واحد من محلول الملح المتوازن Hanks'أو HBSS، الذي يحتوي على الكالسيوم والمغنيسيوم والبقاء في HUVECs باستخدام 0.5 ميكروغرام لكل صبغة زرقاء ملليلتر. وخلايا MCF-7 باستخدام 0.5 صبغة خضراء ميكرومولار مخففة فيما يتعلق متوسط النمو.ضع اللوحة في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 37 درجة مئوية وخمسة في المائة لمدة 30 إلى 40 دقيقة. غسل الخلايا مع ملليلتر واحد من HBSS دون الكالسيوم والمغنيسيوم. ثم أضف ملليلتر واحد من إعادة عامل مفرزة الأنزيمية، وهو 0.25٪ تريبسين لHUVEC و 0.5٪ رحلات في أربع MCF-7 إلى كل طبق بني باستخدام ماصة P1000.انتخاب كل نوع الخلية بشكل منفصل في خمسة ملليلتر جولة أنبوب البوليسترين القاع, وإضافة ملليلتر واحد من 10٪ مصل العجل الجنين أو FCS المتوسطة باستخدام ماصة P1000 لوقف رد الفعل الأنزيمي. ثم الطرد المركزي تعليق الخلية في 250 مرة G لمدة خمس دقائق. يستنشق بعناية supernatant وتعليق الخلايا في ملليلتر واحد من الستيرويد المتوسطة الحرة.استخدام 100 ميكرولتر من كل تعليق الخلية المخفف مع 10 ملليلتر من ديلونت 2 لتحديد العدد الإجمالي للخلية. قم بتشغيل الجهاز وامسحه بالضغط على أزرار الوظيفة والبدء، مع حل Diluent 2 في قارورة عداد الخلية. استخدام إعداد أربعة واضغط بدء لقياس فارغة مع حل Diluent 2 الطازجة.تغيير قارورة التلألؤ مع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في 10 ملليلتر من محلول ديلونت 2. استخدام إعداد أربعة واضغط على بدء لقياس العينات. لاحظ عدد الخلايا لكل ملليلتر على الشاشة الرقمية، ثم قم بإعداد خمسة ملليلترات من كل تعليق للخلية واخلطها للحصول على حجم نهائي من 10 ملليلترات بنسبة واحدة إلى واحدة، باستخدام ماصة مكررة يدوية لإخراج 100 ميكرولتر من تعليق الخلية في كل بئر من لوحة U-bottom ذات 96 بئرا.ضع اللوحة في حاضنة تحت ظروف زراعة الأنسجة القياسية وتحقق من تكوين كرويدات بعد 48 ساعة. التقاط صور لهذه كرويدات في 40 X التكبير باستخدام النقيض من المرحلة أو المجهر ستيريو مضان. لإعداد ثقافة إسقاط شنقا مزيج تعليق الخلية في نسبة واحد إلى واحد للحصول على حجم النهائي من اثنين من ملليلتر.استخدام ماصة P20 لرؤية خليط الخلية في شكل قطرات 15 ميكرولتر على الرصاص المقلوب من طبق بيتري 10 سم. عكس الغطاء مع قطرات وإضافة خمسة ملليلتر من EBM-2 قاعدة المتوسطة في الجزء السفلي من الطبق لتجنب تبخر قطرات. جمع ما يقرب من 50 كروية في أنبوب 1.5 ملليلتر مع غيض من القناة الهضمية من ماصة P200 ميكرولتر.السماح لهم لتسوية إلى الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الجاذبية ومن ثم تجاهل supernatant. إصلاح هذه كرويات مع 500 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. يغلي 2٪ نوبل ألغور الحل في برنامج تلفزيوني باستخدام لوحة ساخنة مع ضجة مغناطيسية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق لإذابة مسحوق يبشر بالخير تماما وتبريدها إلى حوالي 60 درجة مئوية.إزالة PFA مع ماصة P1000، وغسل هذه كرويدات مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني والسماح لهم الرواسب. استقر مرة واحدة تجاهل supernatant بعناية ماصة 600 ميكرولتر من محلول أغورا في أنبوب 1.5 ملليلتر مع كرويدات ووضع الأنبوب على الفور في جهاز طرد مركزي مع الدوار الأفقي في 177 مرة G لمدة دقيقتين. إضافة سلسلة قصيرة في منتصف الحل الزراعي لإزالة بسهولة المكونات من الأنبوب.ترسيخ المكونات Agros على الجليد، أو في أربع درجات مئوية إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في أنبوب 1.5 ملليلتر لتجنب تجفيف بيليه. الحصول على صور من المقاطع كروية باستخدام مجهر ستيريو. حساب كمية الحل اللازمة لإضافة 10 ميكرولتر لكل بئر من خليط من الكالسيوم Aam وethidium homodimers المخفف باستخدام EBM-2 في نسبة 1 إلى 50.إضافة خليط تلطيخ إلى كرويدات ووضع لوحة في الحاضنة تحت المعيار، وظروف زراعة الأنسجة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. الحصول على الصور في 40 X التكبير باستخدام المجهر ستيريو مضان. في لوحات U-bottom لوحظ تشكيل كرويدات بعد 48 ساعة من بذر MCF سبع خلايا.ومع ذلك ، لم يلاحظ تشكيل كرويدات في حالة الخلايا البطانية أو الخلايا اللمفاوية. البذر MCF سبعة بالإضافة إلى الخلايا البطانية أو MCF سبعة بالإضافة إلى الخلايا اللمفاوية بنسبة واحد إلى واحد أدى أيضا إلى تشكيل كروي. تم تسجيل نمو متتابع يعتمد على الوقت لسبع كرويات MCF تتراوح بين 24 إلى 120 ساعة.زاد حجم الكرويات من حوالي 100 ميكرومتر إلى حوالي 200 ميكرومتر على مدى خمسة أيام. مع زيادة معدل النمو لوحظ في كرويدات تعامل مع محفز النمو. لم يظهر هيكل كرويدات وشكل خلاياها أي شذوذ بعد العدوى مع أوليغونوكليوتيدات التحكم في وجود ليبوفيكتامين.تم توزيع الخلايا التي تعبر عن علامة التكاثر كي-67 بشكل متجانس في هذه الكرويات. Cleave إلى caspase ثلاثة تلطيخ من هذه الكرويات أظهرت الخلايا اللامبالاة بعد أربعة أيام من الثقافة. دراسة الخلايا في هذه الكرويات مع CD-31 وكي-67 كشفت أن 55٪ من الخلايا هي الظهارية 45٪ هي البطانية و 25٪ من الخلايا تتكاثر.لتقييم النسبة المئوية للخلايا الحية والميتة كانت كرويدات عمرها أربعة أيام ملطخة بالكالسيوم Aam وethidium-homodimer. وكشف كرويد الفكر الطازج وصمة عار أيضا للخلايا الميتة والحية أن كرويدات حساسة جدا لظروف التجمد. عند اتباع بروتوكول له، تأكد من أن يتم استخدام خلايا صحية لخلط أفروديت شيء آخر أن نتذكر أن يكون لتجنب إتلاف هذه أفروديت خلال كاب DP للحصول على أقسام جيدة أيضا ضمان الحنك أفروديت قبل عبر البوليمرات.ويمكن زيادة تحسين هذا النموذج من خلال تضمين خلايا أخرى، مثل الخلايا الليفية المشاركة في تطور الورم واستخدامه لتقييم فعالية العوامل العلاجية التي تستهدف نمو السرطان.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

الاستفادة من علم الجينوم وظيفية الفرز لتحديد أهداف المخدرات رواية يحتمل في الثقافات كروي الخلية السرطانية

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

الإجراءات الجراحية ومنهجية لنموذج الفئران قبل السريرية<em&gt; دي نوفو</em&gt; سرطان الثديي الانبثاث

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

والوريد البابي حقن نموذج لدراسة الكبد الانبثاث من سرطان الثدي

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

الحصول على خلايا السرطان الجذعية من أورام أمراض النساء وسرطان الثدي

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

نموذج Spheroid 3D كنظام أكثر فسيولوجية للتمييز الليفي المرتبطة بالسرطان والغزو في الدراسات المختبرية

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

دراسة ثلاثية سلبية سرطان الثدي باستخدام نموذج سرطان الثدي Orthotopic

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

الجرذ ماماري زرع الخلايا الظهارية في وسادة الدهون البيضاء Interscapular

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

زرع العظام لأورام الثدي كنماذج ما قبل السريرية لسرطان الثدي

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

في المختبر تقييم التحول Oncogenic في الخلايا الظهارية ماماري الإنسان

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

العزل والتقييم الوظيفي للخلايا الجذعية لسرطان الثدي البشري من عينات الخلايا والأنسجة

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...