Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

这项研究得到了癌症研究基金会/瑞士癌症联盟资助KFS-4125-02-2017给RKD和国家卫生研究院资助DK079307给EKJ的支持。

1. 细胞培养
注意：在无菌条件下进行细胞处理。
<ol><li>人脐静脉内皮细胞 （HUVECs） 传代培养<ol>
<li>在室温（RT）下用胶原蛋白（5μg/ cm 2）（大鼠尾巴）在75cm 2烧瓶中涂布过夜（ON）或在37°C下涂覆2-3小时，用水冲洗，并让烧瓶干燥。</li>
		<li>在补充谷氨酰胺（1x = 2 mM），抗生素 - 抗真菌溶液（AA;100μg/ mL链霉素，100μg/ mL青霉素和0.025μg/ mL两性霉素B），LSGS（2...

与2D细胞培养相比，革命性的3D球体培养技术是重建器官微环境，细胞间相互作用和 体外药物反应的更好，更强大的工具。这是描述用于乳腺癌研究的多细胞（上皮和内皮）细胞系中球状体形成的第一个方案。该协议可确保球体的球体3D生长长达5天，并且可以在石蜡包埋，切片和组织学染色后检查球体。有趣的是，球体内的细胞元件仍然表达促进细胞生长的受体，并对增殖和凋亡刺激有反?...

使用动物进行实验有局限性。动物研究无法准确模拟人类的疾病进展，动物和人类对病原体的反应也不尽相同。此外，由于担心动物的痛苦和道德问题，动物实验受到限制1,2 越来越限制研究项目。 In vitro 系统已被广泛开发，以规避动物的使用;而且，利用人体细胞已经使 in vitro 与病理生理学和治疗学研究更相关的模型。传统的单层（2D）细胞培养物被广泛使用，因为它们在某种程度上模仿人体组织。然而，2D单一培养无法模仿人体器官，2D单一培养无法模拟原始器官的复杂微环境并模仿 in vivo 情况3,4,5,6.此外，在单层细胞培养物中，药物治疗很容易破坏/损伤所有细胞。重要的是，可以通过切换到多层三维（3D）细胞培养物来克服其中一些限制。7,8.事实上，3D培养模型已被证明可以更好地反映原代组织中细胞的结构，布局和功能。这些3D培养物可以使用各种细胞系形成，类似于功能器官。事实上，有两种3D文化模型。一种模型产生聚集细胞的球体，这些细胞形成簇并将它们重组为球体（无支架模型）。第二种产生类器官，其具有更复杂的结构，由多个器官特异性细胞的组合组成，这些细胞被认为是器官的微型版本。9,10.因此，3D培养系统代表了一种具有许多生物学和临床应用的创新技术。因此，球状体和类器官在疾病建模和与再生医学，药物筛选和毒理学研究相关的研究中具有许多应用。6,11,12,13,14,15.源自3D技术的致癌球体，重建相关细胞类型的形态和表型，模仿 in vivo 肿瘤微环境，并对肿瘤发展过程中可操作的细胞通信和信号通路进行建模16,17,18.此外，为了提高对癌症生物学的理解，肿瘤球状体/类器官还可用于识别潜在的患者特异性抗癌疗法（个性化）并评估其疗效，毒性和长期影响。19,20,21,22.球状体为研究病理生理学，疾病建模和药物筛选提供了突出的机会，因为它们能够保存细胞和三维组织结构，能够模仿 in vivo 情况，以及细胞 - 细胞相互作用。然而，人们还必须意识到该系统的局限性，例如缺乏血管/全身成分，功能性免疫或神经系统，并且与动物模型相比，该系统代表了还原论的方法。事实上，与动物模型相比，3D结构仅提供人体内生物学的近似值。了解3D方法的局限性可能有助于研究人员设计更精细和有效的过程，以产生在更大尺度上更好地代表器官的球体。23,24,25.
癌症是全世界死亡的主要原因，而乳腺癌是女性中最常见的癌症26、27、28。为了模拟乳腺癌的复杂微环境，应使用在乳腺肿瘤中起突出作用的细胞（即上皮细胞，内皮细胞，成纤维细胞和/或免疫细胞）培养乳腺癌球状体。此外，对于代表乳腺癌的球状体，还应考虑女性激素受体（雌激素/孕激素受体）的表达，保存患者肿瘤组织学状态的能力以及模仿治疗反应的能力。研究表明，3D共培养系统具有与体内原代组织相似的细胞组织，具有对刺激实时反应的能力，并具有功能性雄激素受体29、30、31、32。因此，类似的方法可能有助于在体外模拟乳腺肿瘤 。当前方案的目的是建立一种产生乳腺癌球体的新方法。该方法利用雌激素受体阳性MCF-7细胞（上皮细胞的永生化人细胞系）和血管内皮细胞（HUVECs）或淋巴内皮细胞（HMVEC-DNeo）来创建模拟或密切反映肿瘤内这些细胞之间相互作用的模型。虽然MCF-7（雌激素反应性）和内皮细胞在本研究中已被用于发展球状体，但其他细胞，如占乳腺肿瘤质量约80%的成纤维细胞，也可以在未来结合，以更好地代表和模仿乳腺肿瘤。
形成球体的方法有几种，例如：1）采用重力33，34的悬挂液滴法;2）利用磁性纳米颗粒暴露于外部磁铁的磁悬浮法35，以及3）通过在低附着板上接种细胞来执行的球状微孔板法36，37。在仅使用一种细胞类型的现有方法的基础上，对本方案已利用上皮细胞和内皮细胞进行了优化，以更好地模拟乳腺癌肿瘤在体内38、39、40、41的生长条件。这种方法可以在实验室中以低成本和最低的设备要求轻松实现。根据实验室的需求/目标，使用不同的方法来形成旋转体并从这些旋转体中获得相关的细胞材料。在这种情况下，对于DNA，RNA或蛋白质分析，3D球体是通过与悬挂滴法共培养内皮和上皮细胞来产生的。然而，对于功能研究，例如，为了监测短干扰（siRNA）转染和/或激素处理后的细胞生长，使用U底板生成球状体。
该技术方案的目的是为1）形成乳腺癌多细胞型球体，2）制备用于组织学染色的样品以及3）收集用于提取RNA，DNA和蛋白质的细胞提供详细的分步描述。廉价的悬挂式下降方法和更昂贵的U底板都用于形成球体。在这里，提供了制备（固定）球体的方案，用于切片和随后的免疫染色，并用标记物评估细胞增殖，凋亡以及球体内上皮和内皮细胞的分布。此外，该协议显示了使用ImageJ软件对组织学数据的完整分步分析。生物数据的解释因实验类型和所用抗体而异。固定球体的切片和随后的切片染色由常规病理学实验室（Sophistolab：info@sophistolab.ch）进行

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

乳腺癌是女性死亡的主要原因。乳腺癌细胞的生长及其随后的转移是其进展的关键因素。尽管使用MCF-7细胞等乳腺癌细胞的单一培养物对促进乳腺癌生长的机制进行了深入研究，但尚未深入研究其他细胞类型（例如密切参与肿瘤生长的血管和淋巴内皮细胞）的贡献。细胞 - 细胞相互作用在肿瘤生长和进展中起着关键作用。新血管生成或血管的发育对于肿瘤生长至关重要，而淋巴系统则是癌细胞迁移和随后转移的门户。最近的研究提供了证据表明，血管和淋巴内皮细胞可以显着影响癌细胞的生长。这些观察结果意味着需要开发体 外 模型，以更真实地反映 体内乳腺癌的生长过程 。此外，动物研究的限制要求开发 离体 模型，以更好地阐明所涉及的机制。
本文描述了由乳腺癌细胞（雌激素受体阳性MCF-7细胞）和血管和/或淋巴内皮细胞组成的乳腺癌球体的发展。该协议描述了使用两种不同的方法创建双细胞球体的详细分步方法，即悬挂式下降（黄金标准和便宜）和96孔U底板（昂贵）。提供了有关如何通过显微镜定量和使用死细胞和活细胞染色评估活力来精细拾取形成的球体以监测生长的深入说明。此外，还描述了用生长特异性抗体固定球体以进行切片和染色以区分球体中生长模式的程序。此外，还提供了用转染细胞制备球体的详细信息以及提取RNA进行分子分析的方法。总之，本文为制备用于乳腺癌研究的多细胞球体提供了深入的说明。

需要使用上皮和内皮共培养物的球状体模型来密切模拟乳腺肿瘤的 体内 条件以进行 体外 实验。 图1 中的方案描述了与乳腺癌上皮细胞和血管或淋巴内皮细胞形成球状体的方案（图1）。将每种细胞类型分别接种在3.5cm的圆形培养皿中，并用生长刺激剂/抑制剂处理或使用脂质聚胺转染寡核苷酸。上皮细胞或内皮细胞的汇合单层在胰蛋白酶?...

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乳腺上皮细胞和内皮细胞之间的串扰对乳腺癌进展、肿瘤生长和转移有重要贡献。在这项研究中，球状体是由乳腺癌细胞与血管和/或淋巴内皮细胞一起制成的，并证明了它们作为乳腺癌研究 的体外 系统的适用性。

乳腺上皮和内皮细胞球状体作为乳腺癌研究的潜在功能 体外 模型

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

本文中描述的乳腺癌细胞球状体将允许研究人员研究参与癌细胞增殖和转移的癌细胞内皮细胞相互作用的分子机制。这种3D模型的主要优点是它提供了更逼真的细胞排列，提高了乳腺癌病理生理学和治疗的推理的可靠性。演示该过程的将是来自我实验室的博士生Giovanna Azzarito。首先处理或转染接种的细胞24小时，或根据需要。为了识别球状体中的细胞分布，用一毫升含有钙和镁的Hanks'平衡盐溶液或HBSS洗涤细胞，并使用每毫升蓝色染料0.5微克留在HUVECs中。并将MCF-7细胞采用0.5微摩尔绿色染料稀释在生长培养基上。将板放入37摄氏度和5%CO2培养箱中30至40分钟。用一毫升不含钙和镁的HBSS洗涤细胞。然后使用P1000移液管向每个棕色培养皿中加入一毫升酶分离剂，其中HUVEC为0.25%胰蛋白酶，4个MCF-7中为0.5%。。在五毫升圆底聚苯乙烯管中分别选择每种细胞类型，并使用P1000移液管加入一毫升10%胎儿小牛血清或FCS培养基以停止酶促反应。然后将细胞悬浮液以250倍G离心五分钟。小心地吸出上清液并将细胞悬浮在一毫升不含类固醇的培养基中。使用用10毫升稀释剂2稀释的每个细胞悬浮液的100微升来确定总细胞数。打开机器并通过按下功能和启动按钮进行冲洗，稀释剂2溶液在细胞计数器小瓶中。使用设置为四，然后按开始用新鲜的稀释剂2溶液测量坯料。在10毫升稀释剂2溶液中用100微升细胞悬浮液更换闪烁小瓶。使用设置为四，然后按开始测量样品。在数字显示屏上记下每毫升的细胞数，然后准备每个细胞悬浮液的5毫升并混合它们以一比一的比例获得10毫升的最终体积，使用手动重复移液器将100微升的细胞悬浮液移出到96孔U底板的每个孔中。将板置于标准组织培养条件下的培养箱中，并在48小时后检查球体形成。使用相差或荧光体视显微镜以40 X放大倍率拍摄该球体的照片。用于制备悬挂滴培养物的混合将细胞悬浮液以一比一的比例混合，以获得2毫升的最终体积。使用P20移液器在10厘米培养皿的倒置铅上以15微升滴的形式观察细胞混合物。用滴剂倒置盖子，并在培养皿底部加入五毫升EBM-2基础培养基，以避免滴剂蒸发。将大约50个球体收集在1.5毫升的管中，其内脏尖端为P200微升移液器。让它们通过重力沉降到管的底部，然后丢弃上清液。在室温下用500微升4%PFA固定该球体一小时。使用加热板在PBS中煮沸2%诺贝尔算法溶液，磁力搅拌三到五分钟，以完全溶解预兆粉末，并冷却至60摄氏度左右。用P1000移液器去除PFA，用500微升PBS洗涤该球体并使其沉淀。沉降后，将上清液小心地将600微升的Agora溶液移入带有球体的1.5毫升管中，并立即将管放入具有177倍G的水平转子的离心机中两分钟。在Agro Solution的中间添加一根短绳，以轻松从管子上取下插头。将Agros塞固化在冰上，或在4摄氏度下将500微升PBS加入1.5毫升管中，以避免颗粒变干。使用体视显微镜采集球体切片的图像。计算使用EBM-2以1至50的比例稀释的Aam钙和乙锭均聚体混合物每孔添加10微升所需的溶液量。将染色混合物加入球状体中，并将板置于标准，组织培养条件下的培养皿中30至60分钟。使用荧光体视显微镜以40倍放大倍率获取图像。在U形底板中，在MCF七个细胞接种后48小时观察到球体的形成。然而，在内皮细胞或淋巴细胞的情况下没有观察到球状体的形成。以一比一的比例接种MCF七加内皮细胞或MCF七加淋巴细胞也导致球状体形成。记录了MCF七个球体的时间依赖性顺序生长，范围从24小时到120小时不等。在五天的时间里，球体的大小从大约100微米增加到大约200微米。在用生长刺激剂处理的球体中观察到生长速率增加。在Lipofectamine存在下，用对照寡核苷酸转染后，球状体的结构及其细胞的形状没有异常。表达其增殖标记Ki-67的细胞均匀分布在该球体中。切开至半胱天冬氨酸酶三次染色后，这种球体的染色显示细胞在培养四天后出现冷漠。用CD-31和Ki-67研究该球体中的细胞显示，55%的细胞是上皮细胞，45%是内皮细胞，25%的细胞是增殖的。为了评估活细胞和死细胞的百分比，用钙Aam和乙锭同源二聚体染色四天龄的球体。一种新鲜想到的球体也对死细胞和活细胞进行了染色，这表明球体对冷冻条件非常敏感。在遵循他的方案时，确保使用健康的细胞来混合阿佛洛狄忒 另一件要记住的事情是避免在DP帽期间损坏这些阿佛洛狄忒，以获得良好的切片，也确保在交叉聚合之前腭化阿佛洛狄忒。通过包括其他细胞，例如参与肿瘤进展的成纤维细胞并使用它来评估靶向癌症生长的治疗剂的功效，可以进一步改进该模型。

Research

JoVE Journal

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人类乳腺上皮细胞致癌转化的体外评价

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从细胞和组织样本中分离和功能评估人类乳腺癌干细胞

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...