Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League bevilling KFS-4125-02-2017 til RKD og National Institute of Health tilskud DK079307 til EKJ.

1. Cellekultur
BEMÆRK: Udfør cellehåndtering under sterile forhold.
<ol><li>Human Umbilical Vene EndotelCeller (HUVECs) subkultur<ol>
<li>Frakke 75 cm2 kollagen med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) natten over (ON) ved stuetemperatur (RT) eller 2-3 timer ved 37 °C, skyl med vand, og lad kolben tørre.</li>
		<li>Grow HUVECs i vækstmedium (EBM-2, Endotel basal medium-2) suppleret med glutamin (1x = 2 mM), antibiotisk-antimykotisk opløsning (AA; 100 μg/ml streptomy...

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolutionerende 3D-spheroidkulturteknologi et bedre og mere kraftfuldt værktøj til at rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraktioner og lægemiddelrespons in vitro. Dette er den første protokol, der beskriver dannelsen af spheroider fra flercellede (epitel- og endotelcellelinjer) til brystkræftforskning. Denne protokol sikrer spheroidal 3D-vækst af spheroider i op til 5 dage, og spheroids kan undersøges efter paraffin indlejring, sektion og histologisk far...

Brugen af dyr til forsøg har begrænsninger. Dyreforsøg kan ikke nøjagtigt efterligne sygdomsprogression hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske reaktioner på patogener. Derudover er restriktioner i dyreforsøg på grund af bekymringer for dyrelidelser og etiske problemer1,2 i stigende grad begrænse forskningsprogrammerne. In vitro der er udviklet systemer i vid udstrækning for at omgå brugen af dyr; desuden har brugen af menneskelige celler gjort in vitro modeller, der er mere relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøgelse. Konventionelle monolayer (2D) cellekulturer er meget udbredt, fordi de efterligner humane væv til en vis grad. 2D-monokulturer efterligner imidlertid ikke menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til at simulere det komplekse mikromiljø af de oprindelige organer og efterligne in vivo situation3,4,5,6. Derudover, i monolayer celle kulturer, lægemiddelbehandlinger let kunne ødelægge / skade alle cellerne. Det er vigtigt, at nogle af disse begrænsninger kan overvindes ved at skifte til tredimensionelle (3D) cellekulturer (multilags)7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist sig bedre at afspejle cellestrukturen, layoutet og funktionen af celler i primære væv. Disse 3D-kulturer kan dannes ved hjælp af en række cellelinjer, svarende til et funktionelt organ. Faktisk er der to modeller af 3D-kulturer. En model producerer spheroids af aggregerede celler, der danner klynger og reorganisere dem i kugler (stillads-fri modeller). Den anden giver organoider, som har en mere kompleks struktur og består af kombinationer af flere organspecifikke celler, der betragtes som en miniatureversion af organer9,10. På grund af dette repræsenterer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske anvendelser. Spheroider og organoider har således talrige anvendelser for sygdomsmodellering og undersøgelser relateret til regenerativ medicin, lægemiddelscreening og toksikologiske undersøgelser6,11,12,13,14,15. Kræftfremkaldende spheroider, der stammer fra 3D-teknologi, genskabe morfologi og fænotype af relevante celletyper, efterligner in vivo tumor mikromiljø, og model cellekommunikation og signalering veje, der er operationelle under tumor udvikling16,17,18. Hertil kommer, at forbedre kræft biologi forståelse, tumor spheroids / organoider kan også bruges til at identificere en potentiel patient-specifik anti-cancer terapi (personlig) og vurdere dens effektivitet, toksicitet, og langsigtede virkninger19,20,21,22. Spheroids har åbnet fremtrædende muligheder for at undersøge patofysiologi, sygdom modellering og lægemiddelscreening på grund af deres evne til at bevare cellulære og tre-dimensionelle væv arkitektur, evnen til at efterligne in vivo og cellecelleinteraktionerne. Man skal dog også være opmærksom på begrænsningerne i dette system, såsom manglen på vaskulær/systemisk komponent, funktionel immun- eller nervesystem, og systemet repræsenterer en reduktionistisk tilgang sammenlignet med dyremodeller. I modsætning til dyremodeller giver 3D-strukturer faktisk kun en tilnærmelse af biologien i en menneskelig krop. Forståelse af begrænsningerne i 3D-metoden kan hjælpe forskere med at designe mere raffinerede og gyldige processer til fremstilling af spheroider, der bedre repræsenterer et organ i større skala23,24,25.
Kræft er den hyppigste dødsårsag på verdensplan, og brystkræft er den mest almindelige kræftform hos kvinder26,27,28. For at efterligne det komplekse mikromiljø af brystkræft, bør brystkræft spheroider dyrkes ved hjælp af celler, der spiller en fremtrædende rolle i brysttumorer, dvs epitelceller, endotelceller, fibroblaster, og / eller immunceller. Desuden, for en spheroid repræsenterer brystkræft, udtrykket af kvindelige hormon receptorer (østrogen / progesteron receptorer), evne til at bevare patientens tumor histologiske status, og evnen til at efterligne respons på terapi bør også overvejes. Undersøgelser har vist, at 3D co-kultur systemer har en cellulær organisation svarende til den primære væv in vivo, har evnen til at reagere i realtid til stimuli, og har funktionelle androgen receptorer29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilgang være nyttig til at efterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nuværende protokol er at etablere en ny metode til at generere brystkræft spheroids. Denne metode udnytter østrogen receptor-positive MCF-7 celler (en udødeliggjort menneskelige celle linje af epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVECs) eller lymfe endotelceller (HMVEC-DNeo) til at skabe en model, der efterligner eller nøje afspejler samspillet mellem disse celler i en tumor. Selvom MCF-7 (østrogen-lydhør) og endotelceller er blevet brugt til at udvikle spheroids i denne undersøgelse, andre celler såsom fibroblaster, som repræsenterer ~ 80% af bryst tumor masse, kunne også kombineres i fremtiden for bedre at repræsentere og efterligne brysttumor.
Der er flere metoder til at danne spheroids, såsom: 1) den hængende dråbemetode, der anvender tyngdekraften33,34; 2) den magnetiske levitationsmetode, der bruger magnetiske nanopartikler, der udsættes for en ekstern magnet35, og 3) spheroid mikroplademetoden, der udføres ved at så celler på lavtilbehørsplader36,37. På grundlag af de eksisterende metoder, som kun bruger én celletype, er den nuværende protokol blevet optimeret ved hjælp af epitel- og endotelceller for bedre at efterligne vækstbetingelserne for brystkræfttumorer i vivo38,39,40,41. Denne metode kan nemt opnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale udstyrskrav. Baseret på laboratoriets behov/mål blev forskellige tilgange brugt til at danne spheroider og få relevant cellulært materiale fra disse spheroider. I denne sammenhæng, for DNA, RNA, eller protein analyse, 3D spheroids er produceret af co-culturing endotel og epitelceller med hængende dråbe metode. Men for funktionelle undersøgelser, for eksempel, for at overvåge cellevækst efter kort interferens (siRNA) transfection og / eller hormonbehandling, spheroids genereres ved hjælp af U-bund plader.
Formålet med denne tekniske protokol er at give en detaljeret trinvis beskrivelse af 1) danner brystkræft multicellulære-type spheroids, 2) forberede prøver til histologisk farvning, og 3) indsamling af celler til udvinding af RNA, DNA og proteiner. Både den billige hængende dråbemetode og de dyrere U-bundplader bruges til at danne spheroids. Her leveres en protokol til forberedelse (fastsættelse) spheroider til sektion og efterfølgende immunstaining med markører for at vurdere cellespredning, apoptose og fordeling af epitel- og endotelceller i en spheroid. Derudover viser denne protokol en komplet trinvis analyse af histologiske data ved hjælp af ImageJ-software. Fortolkningen af biologiske data varierer afhængigt af eksperimenttypen og de anvendte antistoffer. Afsnit af faste spheroider og efterfølgende farvning af sektionerne blev udført af et rutinemæssigt patologisk laboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Brystkræft er den hyppigste årsag til dødelighed hos kvinder. Væksten af brystkræftceller og deres efterfølgende metastaser er en nøglefaktor for dens progression. Selv om de mekanismer, der er involveret i at fremme brystkræft vækst er blevet intensivt undersøgt ved hjælp af monokulturer af brystkræftceller såsom MCF-7 celler, bidraget fra andre celletyper, såsom vaskulære og lymfe endotelceller, der er tæt involveret i tumorvækst, er ikke blevet undersøgt i dybden. Celle-celle interaktion spiller en central rolle i tumor vækst og progression. Neoangiogenese, eller udvikling af fartøjer, er afgørende for tumorvækst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kræftcellemigration og efterfølgende metastaser. Nylige undersøgelser giver bevis for, at vaskulære og lymfe endotelceller kan påvirke kræftcellevæksten betydeligt. Disse observationer indebærer et behov for at udvikle in vitro-modeller, der mere realistisk afspejler brystkræft vækstprocesser in vivo. Desuden kræver restriktioner inden for dyreforsøg, at der udvikles ex vivo-modeller for bedre at belyse de involverede mekanismer.
Denne artikel beskriver udviklingen af brystkræft spheroids består af både brystkræftceller (østrogen receptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfe endotelceller. Protokollen beskriver en detaljeret trin-for-trin tilgang til at skabe dual-celle spheroids ved hjælp af to forskellige tilgange, hængende drop (guld standard og billige) og 96-godt U-bund plader (dyrt). Der gives dybdegående instruktioner til, hvordan man forsigtigt afhenter de dannede spheroider for at overvåge væksten ved mikroskopisk dimensionering og vurdering af levedygtighed ved hjælp af døde og levende cellefarvninger. Desuden er procedurer til at fastsætte spheroids til sektionsafræning og farvning med vækstspecifikke antistoffer for at differentiere vækstmønstre i spheroider afgrænses. Derudover gives detaljer til fremstilling af spheroider med transfected celler og metoder til at udtrække RNA til molekylær analyse. Afslutningsvis giver denne artikel dybdegående instruktioner til forberedelse af multicellede spheroider til brystkræftforskning.

Spheroids model ved hjælp af epitel og endotel co-kulturer er forpligtet til nøje at efterligne in vivo betingelser for brysttumorer for in vitro eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen om at danne spheroider med brystkræft epitelceller og vaskulære eller lymfe endotelceller (Figur 1). Hver celletype sås separat i en rund skål på 3,5 cm og behandles med vækststimulatorer/hæmmere eller transfected med oligoukleotider ved...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

Krydstale mellem bryst epitelceller og endotelceller vigtigere bidrager til brystkræft progression, tumorvækst, og metastaser. I denne undersøgelse, spheroids er blevet lavet af brystkræftceller sammen med vaskulære og / eller lymfe endotelceller og demonstrere deres anvendelighed som en in vitro-system til brystkræft forskning.

Bryst epitel og endotelcellespheroider som en potentiel funktionel in vitro-model til brystkræftforskning

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Den brystkræft celle spheroids beskrevet heri vil gøre det muligt for forskere at undersøge molekylære mekanismer af kræft celle endotelcelle interaktioner, der er involveret i spredning og metastaser af kræftceller. Den største fordel ved denne 3D-model er, at det giver et mere realistisk cellulært arrangement, der forbedrer pålideligheden af slutninger vedrørende patofysiologi og behandling af brystkræft. Det vil være Giovanna Azzarito, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium.Begynd med at behandle eller transfecting de belagt celler i 24 timer, eller som ønsket. For at identificere cellefordeling i spheroid, vask cellerne med en milliliter Hanks'Balanced Salt Solution eller HBSS, der indeholder calcium og magnesium og ophold i HUVECs ved hjælp af 0,5 mikrogram per milliliter blå farvestof. Og MCF-7 celler ved hjælp af 0,5 mikromolar grønt farvestof fortyndet i forbindelse med vækstmedium.Placer pladen i en 37 grader Celsius og fem procent CO2 inkubator i 30 til 40 minutter. Vask cellerne med en milliliter HBSS uden calcium og magnesium. Derefter tilføje en milliliter af enzymatisk løsrivelse re-agent, som er 0,25% trypsin for HUVEC og 0,5% ture i fire MCF-7 til hver brun skål ved hjælp af en P1000 pipette.Vælg hver celletype separat i en fem milliliter runde bund polystyren rør, og tilsæt en milliliter af 10% føtal kalv Serum eller FCS medium ved hjælp af en P1000 pipette for at stoppe enzymatisk reaktion. Derefter centrifugere cellen suspensioner på 250 gange G i fem minutter. Omhyggeligt aspirere supernatant og suspendere cellerne i en milliliter af steroid gratis medium.Brug 100 mikroliter af hver celle suspension fortyndet med 10 milliliter fortynding 2 til at bestemme det samlede celletal. Tænd for maskinen og skyl ved at trykke på funktions- og startknapperne med Fortynding 2-opløsning i et celletællerglas. Brug opsætningen som fire, og tryk på start for at måle det tomme med frisk Fortynding 2-opløsning.Skift scintillationsglasglastet med 100 mikroliter celleaffjedring i 10 milliliter fortyndingsopløsning. Brug opsætningen som fire, og tryk på start for at måle prøverne. Bemærk antallet af celler per milliliter på den digitale skærm, Derefter forberede fem milliliter af hver celle suspension og bland dem for at få et endeligt volumen på 10 milliliter i en en til en forhold, ved hjælp af manuel gentage pipette til pipette ud 100 mikroliters af celle suspension i hver brønd af 96-brønd U-bund plade.Placer pladen i en inkubator under standard vævskulturforhold og kontroller for en spheroids dannelse efter 48 timer. Tag billeder af denne spheroids ved 40 X forstørrelse ved hjælp af en fase kontrast eller fluorescens stereo mikroskop. Til forberedelse af den hængende dråbekultur blandes celleaffjedringerne i et en-til-en-forhold for at få et sidste volumen på to milliliter.Brug en P20 pipette til at se celleblandingen i form af 15 mikroliterdråber på den omvendte ledning af en 10 centimeter petriskål. Vend låget med dråberne og tilsæt fem milliliter EBM-2 basemedium i bunden af skålen for at undgå fordampning af dråberne. Saml ca. 50 spheroids i et 1,5 milliliterrør med en tarmspids af en P200 mikroliterpipette.Lad dem slå sig ned til bunden af røret ved tyngdekraften og kassér derefter supernatanten. Fix denne spheroids med 500 mikroliter af 4% PFA i en time ved stuetemperatur. Kog 2% Nobel Algor Solution i PBS ved hjælp af en kogeplade med en magnetisk omrøring i tre til fem minutter for at opløse det augurøse pulver helt og afkølet til omkring 60 grader Celsius.Fjern PFA med en P1000 pipette, vask disse spheroids med 500 mikroliter PBS og lad dem sedimentere. Når afgjort kassere supernatant omhyggeligt pipette 600 mikroliter af Agora opløsning i 1,5 milliliter rør med spheroids og placeret røret straks i en centrifuge med en vandret rotor på 177 gange G i to minutter. Tilføj en kort snor i midten af Agro Solution for nemt at fjerne stikket fra røret.Størk Agros stikket på is, eller ved fire grader Celsius tilføje 500 mikroliter af PBS i 1,5 milliliter rør for at undgå udtørring af pellet. Erhverve billeder af spheroid sektioner ved hjælp af et stereomikroskop. Beregn mængden af opløsning, der er nødvendig for at tilføje en 10 mikroliter pr. brønd af en blanding af calcium Aam og etium homodimers fortyndet ved hjælp af EBM-2 i et forhold på 1 til 50.Tilsæt farvningsblandingen til spheroiderne og læg pladen i inkubatoren under standarden, vævskulturforholdene i 30 til 60 minutter. Erhverve billeder på 40 X forstørrelse ved hjælp af fluorescens stereo mikroskop. I U-bund plader spheroids dannelse blev observeret 48 timer efter såning af MCF syv celler.Spheroids-dannelsen blev dog ikke observeret i tilfælde af endotelceller eller lymfeceller. Såning af MCF syv plus endotelceller eller MCF syv plus lymfeceller på en-til-en forhold resulterede også i spheroid dannelse. Tidsafhængig sekventiel vækst af MCF syv spheroid blev registreret fra 24 til 120 timer.Spheroids størrelse steg fra omkring 100 mikrometer til omkring 200 mikrometer over på fem dage. Med en øget vækstrate observeret i spheroids behandlet med vækststimulatoren. Spheroidernes struktur og formen af deres celler viste ingen abnormiteter efter transfection med kontrololiigoukleotider i nærværelse af Lipofectamin.Celler, der udtrykker deres proliferative markør Ki-67 blev fordelt homogent i denne spheroids. Cleave til caspase tre farvning af denne spheroids viste apatiske celler efter fire dages kultur. Undersøgelse af cellerne i denne spheroids med CD-31 og Ki-67 viste, at 55% af cellerne er epitel 45% er endotel og 25% af cellerne breder sig.For at vurdere procentdelen af levende og døde celler blev fire dage gamle spheroider farvet med calcium Aam og ethidium-homodimer. En frisk tanke spheroid også plet for døde og levende celler afslørede, at spheroids er meget følsomme over for frostforhold. Når du følger hans protokol, sørg for, at sunde celler bruges til at blande afrodite En anden ting at huske ville være at undgå at beskadige disse afrodite under DP cap for at opnå en god sektioner også sikrer at gane afrodite før på tværs polymerizes.Denne model kunne forbedres yderligere ved at inkludere andre celler, såsom fibroblaster involveret i tumor progression og bruge det til at vurdere effekten af terapeutiske midler rettet mod en kræft vækst.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Ved hjælp af Functional Genomics Screening at identificere potentielt nyt lægemiddel mod cancer Cell sfæroide Cultures

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

Kirurgiske Procedurer og Metodologi til Præklinisk Murin Model af<em&gt; De Novo</em&gt; Mammakræft Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

En Portal Vein Injection Model at studere levermetastaser af brystkræft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

Opnåelse kræft stamceller kugler fra gynækologiske og brystkræft tumorer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

En 3D Spheroid model som et mere fysiologisk system for kræft-associeret fibroblaster differentiering og invasion in vitro undersøgelser

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Studere Triple Negative Breast Cancer Brug Orthotopic Breast Cancer Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

Rotte Mammary Epithelial Celletransplantation i Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Ortotopisk transplantation af brysttumorer som prækliniske modeller for brystkræft

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

In Vitro evaluering af onkogene transformation i humane mammary epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

Isolering og funktionel vurdering af stamceller fra brystkræft fra celle- og vævsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...