Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Dit onderzoek werd ondersteund door Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 aan RKD en National Institute of Health grant DK079307 aan EKJ.

1. Celkweek
OPMERKING: Voer celbehandeling uit onder steriele omstandigheden.
<ol><li>Humane Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) subcultuur<ol>
<li>Bestrijk 75 cm2 kolven met collageen (5 μg/cm2) (rattenstaart) 's nachts (AAN) bij kamertemperatuur (RT) of 2-3 uur bij 37 °C, spoel af met water en laat de kolf drogen.</li>
		<li>Kweek HUVECs in groeimedium (EBM-2, Endotheel Basaal Medium-2) aangevuld met glutamine (1x = 2 mM), antibiotisch-antimycotische oplossing...

In vergelijking met 2D-celculturen is revolutionaire 3D-sferoïde cultuurtechnologie een beter en krachtiger hulpmiddel om de micro-omgeving van een orgaan, cel-celinteracties en medicijnresponsen in vitrote reconstrueren. Dit is het eerste protocol dat de vorming van sferoïden uit meercellige (epitheliale en endotheel) cellijnen beschrijft voor borstkankeronderzoek. Dit protocol zorgt voor sferoïdale 3D-groei van sferoïden gedurende maximaal 5 dagen, en sferoïden kunnen worden onderzocht na paraffine-inbedd...

Het gebruik van dieren voor experimenten heeft beperkingen. Dierstudies kunnen ziekteprogressie bij mensen niet nauwkeurig nabootsen en dieren en mensen hebben geen identieke reacties op pathogenen. Bovendien, beperkingen in dierproeven als gevolg van bezorgdheid over dierenleed en ethische problemen1,2 onderzoeksprogramma's steeds meer beperken. In vitro er zijn op grote schaal systemen ontwikkeld om het gebruik van dieren te omzeilen; bovendien heeft het gebruik van menselijke cellen in vitro modellen die relevanter zijn voor het pathofysiologisch en therapeutisch onderzoek. Conventionele monolayer (2D) celculturen worden veel gebruikt omdat ze menselijke weefsels tot op zekere hoogte nabootsen. 2D-monoculturen slagen er echter niet in om menselijke organen na te bootsen en 2D-monoculturen zijn niet in staat om de complexe micro-omgeving van de oorspronkelijke organen te simuleren en de in vivo situatie3,4,5,6. Bovendien kunnen medicamenteuze behandelingen in monolaagcelculturen gemakkelijk alle cellen vernietigen / beschadigen. Belangrijk is dat sommige van deze beperkingen kunnen worden overwonnen door over te schakelen naar meerlaagse driedimensionale (3D) celculturen7,8. In feite is aangetoond dat 3D-kweekmodellen de cellulaire structuur, lay-out en functie van cellen in primaire weefsels beter weerspiegelen. Deze 3D-culturen kunnen worden gevormd met behulp van een verscheidenheid aan cellijnen, vergelijkbaar met een functioneel orgaan. Er zijn inderdaad twee modellen van 3D-culturen. Eén model produceert sferoïden van geaggregeerde cellen die clusters vormen en deze reorganiseren in bollen (steigervrije modellen). De tweede levert organoïden op, die een complexere structuur hebben en bestaan uit combinaties van meerdere orgaanspecifieke cellen, die worden beschouwd als een miniatuurversie van organen9,10. Hierdoor vertegenwoordigen 3D-kweeksystemen een innovatieve technologie met veel biologische en klinische toepassingen. Zo hebben sferoïden en organoïden tal van toepassingen voor ziektemodellering en studies met betrekking tot regeneratieve geneeskunde, geneesmiddelenscreening en toxicologische studies6,11,12,13,14,15. Kankerverwekkende sferoïden, afgeleid van 3D-technologie, recreëren de morfologie en het fenotype van relevante celtypen, bootsen de in vivo tumor micro-omgeving, en model cel communicatie en signalering routes die operationeel zijn tijdens de ontwikkeling van de tumor16,17,18. Bovendien, om het begrip van kankerbiologie te verbeteren, kunnen tumorsferoïden / organoïden ook worden gebruikt om een potentiële patiëntspecifieke antikankertherapie (gepersonaliseerd) te identificeren en de werkzaamheid, toxiciteit en langetermijneffecten ervan te beoordelen19,20,21,22. Sferoïden hebben prominente mogelijkheden geopend om pathofysiologie, ziektemodellering en medicijnscreening te onderzoeken vanwege hun vermogen om cellulaire en driedimensionale weefselarchitectuur te behouden, het vermogen om de in vivo situatie, en de cel-cel interacties. Men moet zich echter ook bewust zijn van de beperkingen van dit systeem, zoals het ontbreken van vasculaire / systemische component, functioneel immuunsysteem of zenuwstelsel, en het systeem vertegenwoordigt een reductionistische benadering in vergelijking met diermodellen. In tegenstelling tot diermodellen bieden 3D-structuren slechts een benadering van de biologie in een menselijk lichaam. Inzicht in de beperkingen van de 3D-methode kan onderzoekers helpen om meer verfijnde en geldige processen te ontwerpen voor het produceren van sferoïden die een orgaan op grotere schaal beter vertegenwoordigen23,24,25.
Kanker is wereldwijd de belangrijkste doodsoorzaak en borstkanker is de meest voorkomende kanker bij vrouwen van26,27,28jaar. Om de complexe micro-omgeving van borstkanker na te bootsen, moeten borstkankersferoïden worden gekweekt met behulp van cellen die een prominente rol spelen in borsttumoren, d.w.z. epitheelcellen, endotheelcellen, fibroblasten en / of immuuncellen. Bovendien moet voor een sferoïde die borstkanker vertegenwoordigt, ook de expressie van vrouwelijke hormoonreceptoren (oestrogeen / progesteronreceptoren), het vermogen om de histologische status van de tumor van de patiënt te behouden en het vermogen om de respons op therapie na te bootsen, worden overwogen. Studies hebben aangetoond dat 3D-co-kweeksystemen een cellulaire organisatie hebben die vergelijkbaar is met die van het primaire weefsel in vivo,de mogelijkheid hebben om in realtime te reageren op stimuli en functionele androgeenreceptorenhebben 29,30,31,32. Daarom kan een vergelijkbare aanpak nuttig zijn om een borsttumor in vitro na te bootsen. Het doel van het huidige protocol is om een nieuwe methode vast te stellen voor het genereren van sferoïden voor borstkanker. Deze methode maakt gebruik van oestrogeenreceptorpositieve MCF-7-cellen (een vereeuwigde menselijke cellijn van epitheelcellen) en vasculaire endotheelcellen (HUVECs) of lymfatische endotheelcellen (HMVEC-DNeo) om een model te creëren dat de interacties tussen deze cellen in een tumor nabootst of nauw weerspiegelt. Hoewel MCF-7 (oestrogeen-responsieve) en endotheelcellen in de huidige studie zijn gebruikt om sferoïden te ontwikkelen, kunnen andere cellen zoals fibroblasten die ~ 80% van de borsttumormassa vertegenwoordigen, in de toekomst ook worden gecombineerd om borsttumor beter weer te geven en na te bootsen.
Er zijn verschillende methoden om sferoïden te vormen, zoals: 1) de hangende druppelmethode die de zwaartekracht gebruikt33,34; 2) de magnetische levitatiemethode die magnetische nanodeeltjes gebruikt die zijn blootgesteld aan een externe magneet35,en 3) de sferoïde microplaatmethode die wordt uitgevoerd door zaaicellen op platen met een lage bevestiging36,37. Op basis van de bestaande methoden, die slechts één celtype gebruiken, is het huidige protocol geoptimaliseerd met behulp van epitheel- en endotheelcellen om de groeiomstandigheden van borstkankertumoren in vivobeter na te bootsen38,39,40,41. Deze methode kan eenvoudig worden bereikt in het laboratorium tegen lage kosten en met minimale apparatuurvereisten. Op basis van de behoefte / doelen van het lab werden verschillende benaderingen gebruikt om sferoïden te vormen en relevant cellulair materiaal uit deze sferoïden te halen. In deze context, voor DNA-, RNA- of eiwitanalyse, worden de 3D-sferoïden geproduceerd door co-cultivering van endotheel- en epitheelcellen met de hanging drop-methode. Voor functionele studies, bijvoorbeeld om de celgroei na korte interfererende (siRNA) transfectie en / of hormoonbehandeling te volgen, worden de sferoïden gegenereerd met behulp van U-bodemplaten.
Het doel van dit technische protocol is om een gedetailleerde stapsgewijze beschrijving te geven voor 1) het vormen van borstkanker meercellige sferoïden, 2) het voorbereiden van monsters voor histologische kleuring en 3) het verzamelen van cellen voor extractie van RNA, DNA en eiwitten. Zowel de goedkope hangdruppelmethode als de duurdere U-bodemplaten worden gebruikt om sferoïden te vormen. Hier wordt een protocol verstrekt voor het voorbereiden (fixeren) van sferoïden voor sectie en daaropvolgende immunostaining met markers om celproliferatie, apoptose en distributie van epitheel- en endotheelcellen binnen een sferoïde te beoordelen. Bovendien toont dit protocol een volledige stapsgewijze analyse van histologische gegevens met behulp van ImageJ-software. De interpretatie van biologische gegevens varieert afhankelijk van het type experiment en de gebruikte antilichamen. Sectie van vaste sferoïden en daaropvolgende kleuring van de secties werd uitgevoerd door een routine pathologielaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Borstkanker is de belangrijkste doodsoorzaak bij vrouwen. De groei van borstkankercellen en hun daaropvolgende metastase is een belangrijke factor voor de progressie ervan. Hoewel de mechanismen die betrokken zijn bij het bevorderen van de groei van borstkanker intensief zijn bestudeerd met behulp van monoculturen van borstkankercellen zoals MCF-7-cellen, is de bijdrage van andere celtypen, zoals vasculaire en lymfatische endotheelcellen die nauw betrokken zijn bij tumorgroei, niet diepgaand onderzocht. Cel-cel interactie speelt een sleutelrol in tumorgroei en progressie. Neoangiogenese, of de ontwikkeling van bloedvaten, is essentieel voor tumorgroei, terwijl het lymfestelsel dient als een portaal voor migratie van kankercellen en daaropvolgende metastase. Recente studies leveren bewijs dat vasculaire en lymfatische endotheelcellen de groei van kankercellen aanzienlijk kunnen beïnvloeden. Deze observaties impliceren een behoefte aan het ontwikkelen van in vitro modellen die de groeiprocessen van borstkanker in vivorealistischer zouden weergeven. Bovendien vereisen beperkingen in dieronderzoek de ontwikkeling van ex vivo modellen om de betrokken mechanismen beter te verduidelijken.
Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van borstkanker sferoïden samengesteld uit zowel borstkankercellen (oestrogeen receptor-positieve MCF-7 cellen) en vasculaire en /of lymfatische endotheelcellen. Het protocol beschrijft een gedetailleerde stapsgewijze aanpak bij het maken van dual-cell sferoïden met behulp van twee verschillende benaderingen, hangende druppel (gouden standaard en goedkoop) en 96-goed U-bodemplaten (duur). Er worden diepgaande instructies gegeven voor het subtiel oppakken van de gevormde sferoïden om de groei te volgen door microscopische dimensionering en het beoordelen van de levensvatbaarheid met behulp van dode en levende celkleuring. Bovendien worden procedures om de sferoïden te fixeren voor sectie en kleuring met groeispecifieke antilichamen om groeipatronen in sferoïden te differentiëren, afgebakend. Daarnaast worden details verstrekt voor het bereiden van sferoïden met getransfecteerde cellen en methoden om RNA te extraheren voor moleculaire analyse. Kortom, dit artikel biedt diepgaande instructies voor het voorbereiden van meercellige sferoïden voor borstkankeronderzoek.

Het sferoïdenmodel met behulp van epitheliale en endotheelcoculturen is nodig om in vivo omstandigheden van borsttumoren nauwkeurig na te bootsen voor in vitro experimenten. Het schema in figuur 1 toont het protocol om sferoïden te vormen met epitheelcellen van borstkanker en vasculaire of lymfatische endotheelcellen(figuur 1). Elk celtype wordt afzonderlijk gezaaid in een ronde schaal van 3,5 cm en behandeld met groeistimulatoren/-remmers of...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

Kruisverwijzing tussen borstepitheelcellen en endotheelcellen draagt belangrijk bij aan de progressie van borstkanker, tumorgroei en metastase. In deze studie zijn sferoïden gemaakt van borstkankercellen samen met vasculaire en / of lymfatische endotheelcellen en tonen hun toepasbaarheid aan als een in vitro systeem voor borstkankeronderzoek.

Mammary Epitheliale en Endotheelcel Sferoïden als een potentieel functioneel in vitro model voor borstkankeronderzoek

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

De hierin beschreven sferoïden van borstkankercellen zullen onderzoekers in staat stellen moleculaire mechanismen van endotheliale celinteracties van kankercellen te onderzoeken die betrokken zijn bij proliferatie en metastase van kankercellen. Het belangrijkste voordeel van dit 3D-model is dat het een meer realistische cellulaire opstelling biedt die de betrouwbaarheid van gevolgtrekkingen met betrekking tot de pathofysiologie en behandeling van borstkanker verbetert. De procedure wordt gedemonstreerd door Giovanna Azzarito, een promovendus uit mijn laboratorium.Begin met het behandelen of transfecteren van de vergulde cellen gedurende 24 uur, of zoals gewenst. Voor het identificeren van de celverdeling in sferoïde, was de cellen met één milliliter Hanks'Balanced Salt Solution of HBSS, die calcium en magnesium bevat en blijf in HUVECs met behulp van 0,5 microgram per milliliter blauwe kleurstof. En MCF-7-cellen met behulp van 0,5 micromolaire groene kleurstof verdund in het opzicht van groeimedium.Plaats de plaat gedurende 30 tot 40 minuten in een incubator van 37 graden Celsius en vijf procent CO2. Was de cellen met één milliliter HBSS zonder calcium en magnesium. Voeg vervolgens een milliliter enzymatische detachement re-agent, dat is 0,25% trypsine voor HUVEC en 0,5% trips in vier MCF-7 aan elke bruine schaal met behulp van een P1000 pipet.Kies elk celtype afzonderlijk in een polystyreenbuis met vijf milliliter rond bodem en voeg één milliliter 10% Foetaal Kalfsserum of FCS-medium toe met behulp van een P1000-pipet om de enzymatische reactie te stoppen. Centrifugeer vervolgens de celsuspensies op 250 keer G gedurende vijf minuten. Aspirateer het supernatant zorgvuldig en suspenseer de cellen in een milliliter steroïdevrij medium.Gebruik 100 microliter van elke celsuspensie verdund met 10 milliliter verdund verdund verdund stof 2 om het totale celnummer te bepalen. Schakel het apparaat in en spoel door op de functie- en startknoppen te drukken, met Verdunningsmiddel 2-oplossing in een injectieflacon met celteller. Gebruik de set-up als vier en druk op start om de blanco te meten met verse Verdunningsmiddel 2-oplossing.Vervang de scintillatieflacon met 100 microliter celsuspensie in 10 milliliter verdunningsmiddel 2-oplossing. Gebruik de installatie als vier en druk op start om de monsters te meten. Let op het aantal cellen per milliliter op het digitale display, bereid vervolgens vijf milliliter van elke celsuspensie voor en meng ze om een eindvolume van 10 milliliter in een één-op-één verhouding te krijgen, met behulp van handmatig herhalende pipet om 100 microliter van de celsuspensie in elke put van de 96-well U-bottom plaat te pipetten.Plaats de plaat in een incubator onder standaard weefselkweekomstandigheden en controleer na 48 uur op een sferoïdenvorming. Maak foto's van deze sferoïden bij 40 X vergroting met behulp van een fasecontrast of fluorescentie stereomicroscoop. Voor het bereiden van de hangende druppelcultuur mengt u de celsuspensies in een één-op-één-verhouding om een eindvolume van twee milliliter te krijgen.Gebruik een P20-pipet om het celmengsel te zien in de vorm van 15 microliter druppels op het omgekeerde lood van een petrischaaltje van 10 centimeter. Keer het deksel om met de druppels en voeg vijf milliliter EBM-2 basismedium toe aan de onderkant van de schaal om verdamping van de druppels te voorkomen. Verzamel ongeveer 50 sferoïden in een buis van 1,5 milliliter met een darmpunt van een P200 microliter pipet.Laat ze door de zwaartekracht naar de bodem van de buis zakken en gooi het supernatant dan weg. Bevestig deze sferoïden met 500 microliter van 4% PFA gedurende één uur bij kamertemperatuur. Kook 2% Nobel Algor Solution in PBS met behulp van een hete plaat met een magnetische roer gedurende drie tot vijf minuten om het augureuze poeder volledig op te lossen en afgekoeld tot ongeveer 60 graden Celsius.Verwijder de PFA met een P1000 pipet, was deze sferoïden met 500 microliter PBS en laat ze bezinken. Gooi het bovennatuurlijke middel na het afwikkelen voorzichtig 600 microliter Agora-oplossing in de buis van 1,5 milliliter met sferoïden en plaats de buis onmiddellijk in een centrifuge met een horizontale rotor op 177 maal G gedurende twee minuten. Voeg een kort touwtje toe in het midden van de Agro Solution om de plug eenvoudig uit de buis te verwijderen.Versterk de Agros-plug op ijs, of voeg bij vier graden Celsius 500 microliter PBS toe aan de buis van 1,5 milliliter om uitdroging van de pellet te voorkomen. Verkrijg afbeeldingen van sferoïde secties met behulp van een stereomicroscoop. Bereken de hoeveelheid oplossing die nodig is om een 10 microliter per put toe te voegen van een mengsel van calcium Aam en ethidium homodimeren verdund met EBM-2 in een verhouding van één tot 50.Voeg het kleuringsmengsel toe aan de sferoïden en plaats de plaat in de couveuse onder de standaard, de weefselkweekomstandigheden gedurende 30 tot 60 minuten. Verkrijg foto's met een vergroting van 40 X met behulp van de fluorescentie stereomicroscoop. In U-bodemplaten werd de vorming van sferoïden waargenomen 48 uur na het zaaien van MCF zeven cellen.De vorming van sferoïden werd echter niet waargenomen in het geval van endotheelcellen of lymfecellen. Het zaaien van de MCF zeven plus endotheelcellen of MCF zeven plus lymfecellen in één-op-één verhouding resulteerde ook in sferoïde vorming. Tijdsafhankelijke sequentiële groei van MCF zeven sferoïde werd geregistreerd, variërend van 24 tot 120 uur.De grootte van de sferoïden nam in vijf dagen toe van ongeveer 100 micrometer tot ongeveer 200 micrometer. Met een verhoogde groeisnelheid waargenomen in de sferoïden behandeld met de groeistimulator. De structuur van de sferoïden en de vorm van hun cellen vertoonden geen afwijkingen na transfectie met controle oligonucleotiden in aanwezigheid van Lipofectamine.Cellen die hun proliferatieve marker Ki-67 tot expressie brachten, waren homogeen verdeeld in deze sferoïden. Kleef aan caspase drie kleuringen van deze sferoïden toonden apathische cellen na vier dagen cultuur. Studie van de cellen in deze sferoïden met CD-31 en Ki-67 onthulde dat 55% van de cellen epitheel zijn 45% endotheel en 25% van de cellen prolifereert.Om het percentage levende en dode cellen te beoordelen, werden vier dagen oude sferoïden gekleurd met calcium Aam en ethidium-homodimeer. Een vers bedachte sferoïde ook vlek voor dode en levende cellen onthulde dat sferoïden erg gevoelig zijn voor vriesomstandigheden. Wanneer u zijn protocol volgt, zorg er dan voor dat gezonde cellen worden gebruikt om aphrodite te mengen Een ander ding om te onthouden is om te voorkomen dat deze aphrodite tijdens DP-dop wordt beschadigd om een goede sectie te verkrijgen die ook zorgt voor het gehemelte van de aphrodite voordat de overkant polymeriseert.Dit model kan verder worden verbeterd door andere cellen op te nemen, zoals fibroblasten die betrokken zijn bij tumorprogressie en het te gebruiken om de werkzaamheid te beoordelen van therapeutische middelen die gericht zijn op een kankergroei.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Gebruik makend van Functional Genomics Screening om potentieel nieuwe drug targets in Cancer Cell Sferoïde Cultures Identificeer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

Chirurgische Procedures en Methodologie voor een Preklinisch Murine Model van<em&gt; De Novo</em&gt; Maagkanker Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Een poortader Injection Model op de studie van de lever metastase van borstkanker

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

Het verkrijgen van kanker stamcelbollen van gynaecologische en borstkankertumoren

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

Een 3D-Spheroid-model als een fysiologisch systeem voor de differentiatie van kanker-geassocieerde fibroblasten en invasies in vitro studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Studeren Triple Negatieve Borstkanker met behulp van Orthotopische Borstkanker Model

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

Rat Mammary Epitheliale Celtransplantatie in de Interscapular White Fat Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Orthotopische transplantatie van borsttumoren als preklinische modellen voor borstkanker

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

In Vitro Evaluatie van Oncogene Transformatie in Human Mammary Epithelial Cells

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

Isolatie en functionele beoordeling van menselijke borstkankerstamcellen uit cel- en weefselmonsters

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...