Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Cette recherche a été soutenue par la Fondation pour la recherche sur le cancer / subvention de la Ligue suisse contre le cancer KFS-4125-02-2017 à RKD et la subvention de l’Institut national de la santé DK079307 à EKJ.

1. Culture cellulaire
REMARQUE: Effectuer la manipulation des cellules dans des conditions stériles.
<ol><li>Sous-culture des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC)<ol>
<li>Enduire 75 cm2 flacons de collagène (5 μg/cm2) (queue de rat) pendant la nuit (ON) à température ambiante (RT) ou 2-3 h à 37 °C, rincer à l’eau et laisser sécher la fiole.</li>
		<li>Cultiver des HUVEC en milieu de croissance (EBM-2, Milieu basal endothélial-2) com...

Comparée aux cultures cellulaires 2D, la technologie révolutionnaire de culture sphéroïde 3D est un outil meilleur et plus puissant pour reconstruire le microenvironnement d’un organe, les interactions cellule-cellule et les réponses médicamenteuses in vitro. Il s’agit du premier protocole décrivant la formation de sphéroïdes à partir de lignées cellulaires multicellulaires (épithéliales et endothéliales) pour la recherche sur le cancer du sein. Ce protocole assure la croissance 3D sphéroïdal...

L’utilisation d’animaux pour des expériences a des limites. Les études animales ne peuvent pas imiter avec précision la progression de la maladie chez les humains, et les animaux et les humains n’ont pas de réponses identiques aux agents pathogènes. En outre, des restrictions dans l’expérimentation animale en raison de préoccupations concernant la souffrance animale et des problèmes éthiques1,2 limiter de plus en plus les programmes de recherche. In vitro des systèmes ont été largement mis au point pour contourner l’utilisation des animaux; de plus, l’utilisation de cellules humaines a fait in vitro modèles plus pertinents pour l’investigation physiopathologique et thérapeutique. Les cultures cellulaires monocouches conventionnelles (2D) sont largement utilisées car elles imitent les tissus humains dans une certaine mesure. Cependant, les monocultures 2D ne parviennent pas à imiter les organes humains, et les monocultures 2D sont incapables de simuler le microenvironnement complexe des organes d’origine et d’imiter le in vivo situation3,4,5,6. De plus, dans les cultures cellulaires monocouches, les traitements médicamenteux pourraient facilement détruire / endommager toutes les cellules. Il est important de noter que certaines de ces limitations peuvent être surmontées en passant à des cultures cellulaires tridimensionnelles (3D) multicouches7,8. En fait, il a été démontré que les modèles de culture 3D reflètent mieux la structure cellulaire, la disposition et la fonction des cellules dans les tissus primaires. Ces cultures 3D peuvent être formées en utilisant une variété de lignées cellulaires, semblables à un organe fonctionnel. En effet, il existe deux modèles de cultures 3D. Un modèle produit des sphéroïdes de cellules agrégées qui forment des amas et les réorganisent en sphères (modèles sans échafaudage). Le second donne des organoïdes, qui ont une structure plus complexe et consistent en des combinaisons de plusieurs cellules spécifiques à un organe, qui sont considérées comme une version miniature des organes.9,10. Pour cette raison, les systèmes de culture 3D représentent une technologie innovante avec de nombreuses applications biologiques et cliniques. Ainsi, les sphéroïdes et les organoïdes ont de nombreuses applications pour la modélisation des maladies et les études liées à la médecine régénérative, au dépistage des médicaments et aux études toxicologiques.6,11,12,13,14,15. Les sphéroïdes cancérigènes, dérivés de la technologie 3D, recréent la morphologie et le phénotype des types de cellules pertinents, imitent le in vivo microenvironnement tumoral et modèles de communications cellulaires et de voies de signalisation qui sont opérationnelles pendant le développement de la tumeur16,17,18. En outre, pour améliorer la compréhension de la biologie du cancer, les sphéroïdes / organoïdes tumoraux peuvent également être utilisés pour identifier un traitement anticancéreux potentiel spécifique au patient (personnalisé) et évaluer son efficacité, sa toxicité et ses effets à long terme.19,20,21,22. Les sphéroïdes ont ouvert d’importantes possibilités d’étudier la physiopathologie, la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments en raison de leur capacité à préserver l’architecture cellulaire et tridimensionnelle des tissus, la capacité d’imiter le in vivo et les interactions cellule-cellule. Cependant, il faut également être conscient des limites de ce système, telles que l’absence de composant vasculaire / systémique, système immunitaire ou nerveux fonctionnel, et le système représente une approche réductionniste par rapport aux modèles animaux. En effet, contrairement aux modèles animaux, les structures 3D ne fournissent qu’une approximation de la biologie au sein d’un corps humain. Comprendre les limites de la méthode 3D peut aider les chercheurs à concevoir des processus plus raffinés et valides pour produire des sphéroïdes qui représentent mieux un organe à plus grande échelle23,24,25.
Le cancer est la principale cause de décès dans le monde, et le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez les femmes26,27,28. Pour imiter le microenvironnement complexe du cancer du sein, les sphéroïdes du cancer du sein doivent être cultivés à l’aide de cellules qui jouent un rôle de premier plan dans les tumeurs du sein, c’est-à-dire les cellules épithéliales, les cellules endothéliales, les fibroblastes et / ou les cellules immunitaires. De plus, pour un sphéroïde représentant le cancer du sein, l’expression des récepteurs hormonaux féminins (récepteurs œstrogènes/progestérone), la capacité de conserver l’état histologique de la tumeur de la patiente et la capacité d’imiter la réponse au traitement doivent également être prises en compte. Des études ont montré que les systèmes de co-culture 3D ont une organisation cellulaire similaire à celle du tissu primaire in vivo,ont la capacité de réagir en temps réel aux stimuli, et ont des récepteurs androgènes fonctionnels29,30,31,32. Par conséquent, une approche similaire pourrait être utile pour imiter une tumeur du sein in vitro. Le but du protocole actuel est d’établir une nouvelle méthode de génération de sphéroïdes du cancer du sein. Cette méthode utilise des cellules MCF-7 à récepteurs d’œstrogènes positifs (une lignée cellulaire humaine immortalisée de cellules épithéliales) et des cellules endothéliales vasculaires (HUVEC) ou des cellules endothéliales lymphatiques (HMVEC-DNeo) pour créer un modèle qui imite ou reflète étroitement les interactions entre ces cellules au sein d’une tumeur. Bien que les cellules MCF-7 (sensibles aux œstrogènes) et endothéliales aient été utilisées pour développer des sphéroïdes dans la présente étude, d’autres cellules telles que les fibroblastes qui représentent environ 80% de la masse tumorale du sein pourraient également être combinées à l’avenir pour mieux représenter et imiter la tumeur mammaire.
Il existe plusieurs méthodes pour former des sphéroïdes, telles que: 1) la méthode des gouttelettes suspendues qui utilise la gravité33,34; 2) la méthode de lévitation magnétique qui utilise des nanoparticules magnétiques exposées à un aimant externe 35 , et3)la méthode de microplaque sphéroïde qui est réalisée en ensemençant des cellules sur des plaques à faible fixation36,37. Sur la base des méthodes existantes, qui n’utilisent qu’un seul type de cellule, le présent protocole a été optimisé en utilisant des cellules épithéliales et endothéliales pour mieux imiter les conditions de croissance des tumeurs du cancer du sein in vivo38,39,40,41. Cette méthode peut être facilement réalisée en laboratoire à faible coût et avec un minimum d’équipement. Sur la base des besoins / objectifs du laboratoire, différentes approches ont été utilisées pour former des sphéroïdes et obtenir du matériel cellulaire pertinent à partir de ces sphéroïdes. Dans ce contexte, pour l’analyse de l’ADN, de l’ARN ou des protéines, les sphéroïdes 3D sont produits en co-cultivant des cellules endothéliales et épithéliales avec la méthode de la goutte suspendue. Cependant, pour les études fonctionnelles, par exemple, pour surveiller la croissance cellulaire après une transfection interférente courte (siRNA) et / ou un traitement hormonal, les sphéroïdes sont générés à l’aide de plaques à fond en U.
Le but de ce protocole technique est de fournir une description détaillée étape par étape pour 1) la formation de sphéroïdes multicellulaires du cancer du sein, 2) la préparation d’échantillons pour la coloration histologique et 3) la collecte de cellules pour l’extraction de l’ARN, de l’ADN et des protéines. La méthode de chute suspendue peu coûteuse et les plaques à fond en U plus chères sont utilisées pour former des sphéroïdes. Ici, un protocole pour préparer (fixer) les sphéroïdes pour la section et l’immunocoloration ultérieure avec des marqueurs pour évaluer la prolifération cellulaire, l’apoptose et la distribution des cellules épithéliales et endothéliales dans un sphéroïde est fourni. De plus, ce protocole montre une analyse complète étape par étape des données histologiques à l’aide du logiciel ImageJ. L’interprétation des données biologiques varie en fonction du type d’expérience et des anticorps utilisés. La section des sphéroïdes fixes et la coloration ultérieure des sections ont été effectuées par un laboratoire de pathologie de routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Le cancer du sein est la principale cause de mortalité chez les femmes. La croissance des cellules cancéreuses du sein et leurs métastases subséquentes sont un facteur clé de sa progression. Bien que les mécanismes impliqués dans la promotion de la croissance du cancer du sein aient été étudiés de manière intensive à l’aide de monocultures de cellules cancéreuses du sein telles que les cellules MCF-7, la contribution d’autres types de cellules, telles que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques qui sont intimement impliquées dans la croissance tumorale, n’a pas été étudiée en profondeur. L’interaction cellule-cellule joue un rôle clé dans la croissance et la progression tumorales. La néoangiogenèse, ou le développement des vaisseaux, est essentielle à la croissance tumorale, tandis que le système lymphatique sert de portail pour la migration des cellules cancéreuses et les métastases ultérieures. Des études récentes fournissent des preuves que les cellules endothéliales vasculaires et lymphatiques peuvent influencer de manière significative la croissance des cellules cancéreuses. Ces observations impliquent la nécessité de développer des modèles in vitro qui refléteraient de manière plus réaliste les processus de croissance du cancer du sein in vivo. De plus, les restrictions dans la recherche animale nécessitent le développement de modèles ex vivo pour mieux élucider les mécanismes impliqués.
Cet article décrit le développement de sphéroïdes du cancer du sein composés à la fois de cellules cancéreuses du sein (cellules MCF-7 positives aux récepteurs d’œstrogènes) et de cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques. Le protocole décrit une approche détaillée étape par étape dans la création de sphéroïdes à deux cellules en utilisant deux approches différentes, la goutte suspendue (étalon-or et bon marché) et les plaques à fond en U à 96 puits (coûteuses). Des instructions détaillées sont fournies sur la façon de ramasser délicatement les sphéroïdes formés pour surveiller la croissance par dimensionnement microscopique et évaluer la viabilité à l’aide de la coloration des cellules mortes et vivantes. De plus, les procédures pour fixer les sphéroïdes pour la section et la coloration avec des anticorps spécifiques à la croissance afin de différencier les modèles de croissance chez les sphéroïdes sont délimitées. En outre, des détails pour la préparation des sphéroïdes avec des cellules transfectées et des méthodes d’extraction de l’ARN pour l’analyse moléculaire sont fournis. En conclusion, cet article fournit des instructions détaillées pour la préparation des sphéroïdes multicellulaires pour la recherche sur le cancer du sein.

Le modèle de sphéroïdes utilisant des co-cultures épithéliales et endothéliales est nécessaire pour imiter étroitement les conditions in vivo des tumeurs mammaires pour des expériences in vitro. Le schéma de la figure 1 illustre le protocole de formation de sphéroïdes avec des cellules épithéliales du cancer du sein et des cellules endothéliales vasculaires ou lymphatiques (Figure 1). Chaque type de cellule est ensemencé sépar?...

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Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Les sphéroïdes des cellules cancéreuses du sein décrits ici permettront aux chercheurs d’étudier les mécanismes moléculaires des interactions des cellules endothéliales des cellules cancéreuses qui sont impliquées dans la prolifération et les métastases des cellules cancéreuses. Le principal avantage de ce modèle 3D est qu’il fournit un arrangement cellulaire plus réaliste qui améliore la fiabilité des inférences concernant la physiopathologie et le traitement du cancer du sein. Giovanna Azzarito, doctorante de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Commencez par traiter ou transfecter les cellules plaquées pendant 24 heures, ou comme vous le souhaitez. Pour identifier la distribution cellulaire dans le sphéroïde, lavez les cellules avec un millilitre de solution saline équilibrée de Hanks ou HBSS, contenant du calcium et du magnésium et restez dans des HUVEC en utilisant 0,5 microgramme par millilitre de colorant bleu. Et les cellules MCF-7 utilisant un colorant vert 0,5 micromolaire dilué dans le respect du milieu de croissance.Placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de CO2 pendant 30 à 40 minutes. Lavez les cellules avec un millilitre de HBSS sans calcium ni magnésium. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de détachement enzymatique, soit 0,25% de trypsine pour HUVEC et 0,5% de voyages dans quatre MCF-7 à chaque plat brun à l’aide d’une pipette P1000.Choisissez chaque type de cellule séparément dans un tube de polystyrène à fond rond de cinq millilitres et ajoutez un millilitre de sérum de veau fœtal à 10 % ou de milieu FCS à l’aide d’une pipette P1000 pour arrêter la réaction enzymatique. Ensuite, centrifugez les suspensions de cellules à 250 fois G pendant cinq minutes. Aspirez soigneusement le surnageant et suspendez les cellules dans un millilitre de milieu sans stéroïdes.Utilisez 100 microlitres de chaque suspension cellulaire diluée avec 10 millilitres de diluant 2 pour déterminer le nombre total de cellules. Allumez la machine et rincez en appuyant sur les boutons de fonction et de démarrage, avec la solution de Diluent 2 dans un flacon de compteur de cellules. Utilisez la mise en place à quatre et appuyez sur start pour mesurer l’ébauche avec une solution fraîche de Diluent 2.Changer le flacon de scintillation avec 100 microlitres de suspension cellulaire dans 10 millilitres de solution de diluant 2. Utilisez la configuration à quatre et appuyez sur Démarrer pour mesurer les échantillons. Notez le nombre de cellules par millilitre sur l’écran numérique, puis préparez cinq millilitres de chaque suspension cellulaire et mélangez-les pour obtenir un volume final de 10 millilitres dans un rapport de un à un, en utilisant une pipette répétitive manuelle pour pipeter 100 microlitres de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque inférieure en U de 96 puits.Placez la plaque dans un incubateur dans des conditions de culture tissulaire standard et vérifiez la présence d’une formation de sphéroïdes après 48 heures. Prenez des photos de ces sphéroïdes à un grossissement de 40 X à l’aide d’un stéréomicroscope à contraste de phase ou à fluorescence. Pour préparer la culture de goutte suspendue, mélangez les suspensions cellulaires dans un rapport de un pour un pour obtenir un volume final de deux millilitres.Utilisez une pipette P20 pour voir le mélange cellulaire sous la forme de gouttes de 15 microlitres sur le plomb inversé d’une boîte de Petri de 10 centimètres. Inverser le couvercle avec les gouttes et ajouter cinq millilitres de milieu de base EBM-2 au fond du plat pour éviter l’évaporation des gouttes. Recueillir environ 50 sphéroïdes dans un tube de 1,5 millilitre avec une pointe d’intestin d’une pipette de microlitre P200.Laissez-les se déposer au fond du tube par gravité, puis jetez le surnageant. Fixez ces sphéroïdes avec 500 microlitres de 4% PFA pendant une heure à température ambiante. Faire bouillir 2% Nobel Algor Solution dans PBS à l’aide d’une plaque chauffante avec un brassage magnétique pendant trois à cinq minutes pour dissoudre complètement la poudre augureuse et refroidir à environ 60 degrés Celsius.Retirez le PFA avec une pipette P1000, lavez ces sphéroïdes avec 500 microlitres de PBS et laissez-les sédimenter. Une fois installé, jetez soigneusement le surnageant pipette 600 microlitres de solution Agora dans le tube de 1,5 millilitre avec des sphéroïdes et placez le tube immédiatement dans une centrifugeuse avec un rotor horizontal à 177 fois G pendant deux minutes. Ajoutez une courte ficelle au milieu de l’Agro Solution pour retirer facilement le bouchon du tube.Solidifiez le bouchon Agros sur de la glace ou, à quatre degrés Celsius, ajoutez 500 microlitres de PBS dans le tube de 1,5 millilitre pour éviter de dessécher la pastille. Acquérir des images de sections sphéroïdes à l’aide d’un stéréomicroscope. Calculer la quantité de solution nécessaire pour ajouter 10 microlitres par puits d’un mélange d’Aam de calcium et d’homodimères d’éthidium dilués à l’aide d’EBM-2 dans un rapport de un à 50.Ajouter le mélange colorant aux sphéroïdes et placer la plaque dans l’incubateur sous la norme, les conditions de culture tissulaire pendant 30 à 60 minutes. Obtenez des images à un grossissement de 40 X à l’aide du stéréomicroscope à fluorescence. Dans les plaques à fond en U, la formation de sphéroïdes a été observée 48 heures après l’ensemencement de sept cellules MCF.Cependant, la formation de sphéroïdes n’a pas été observée dans le cas des cellules endothéliales ou lymphatiques. L’ensemencement des cellules endothéliales MCF sept plus ou MCF sept cellules lymphatiques plus à un rapport de un pour un a également entraîné la formation de sphéroïdes. Une croissance séquentielle dépendante du temps de MCF sept sphéroïdes a été enregistrée allant de 24 à 120 heures.La taille des sphéroïdes est passée d’environ 100 micromètres à environ 200 micromètres en cinq jours. Avec un taux de croissance accru observé dans les sphéroïdes traités avec le stimulateur de croissance. La structure des sphéroïdes et la forme de leurs cellules n’ont montré aucune anomalie après transfection avec des oligonucléotides de contrôle en présence de lipofectamine.Les cellules exprimant leur marqueur prolifératif Ki-67 ont été distribuées de manière homogène dans ces sphéroïdes. Clivage à la caspase trois colorations de ces sphéroïdes ont montré des cellules apathiques après quatre jours de culture. L’étude des cellules de ces sphéroïdes avec CD-31 et Ki-67 a révélé que 55% des cellules sont épithéliales, 45% sont endothéliales et 25% des cellules prolifèrent.Pour évaluer le pourcentage de cellules vivantes et mortes, des sphéroïdes âgés de quatre jours ont été colorés avec de l’Aam de calcium et de l’homodimère d’éthidium. Un sphéroïde fraîchement pensé également teinté pour les cellules mortes et vivantes a révélé que les sphéroïdes sont très sensibles aux conditions de congélation. Lorsque vous suivez son protocole, assurez-vous que des cellules saines sont utilisées pour mélanger l’aphrodite Une autre chose à retenir serait d’éviter d’endommager ces aphrodites pendant le capuchon DP pour obtenir une bonne section assurant également au palais l’aphrodite avant que l’ensemble ne polymérise.Ce modèle pourrait être encore amélioré en incluant d’autres cellules, telles que les fibroblastes impliqués dans la progression tumorale et en l’utilisant pour évaluer l’efficacité des agents thérapeutiques ciblant une croissance cancéreuse.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

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Utilisant la génomique fonctionnelle de dépistage pour identifier les cibles de médicaments potentiellement nouveaux dans Cancer Cell Cultures Spheroid

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Recherche

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Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Transplantation orthotopique de tumeurs mammaires comme modèles précliniques pour le cancer du sein

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

Évaluation in vitro de la transformation oncogène des cellules épithéliales mammaires humaines

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

Isolement et évaluation fonctionnelle des cellules souches du cancer du sein humain à partir d’échantillons de cellules et de tissus

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...