Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

מחקר זה נתמך על ידי הקרן לחקר הסרטן / הליגה השוויצרית לסרטן מענק KFS-4125-02-2017 ל RKD והמכון הלאומי לבריאות מענק DK079307 ל- EKJ.

1. תרבות התא
הערה: לנהל טיפול בתאים בתנאים סטריליים.
<ol><li>תת-תרבות תאי האנדותל של וריד הטבור האנושי (HUVECs)<ol>
<li>יש מעיל 75 ס"מ2 צלוחיות קולגן (5 מיקרוגרם/ס"מ2)(זנב חולדה) למשך הלילה (ON) בטמפרטורת החדר (RT) או 2-3 שעות ב-37 מעלות צלזיוס, לשטוף במים ולאפשר לבקבוק להתייבש.</li>
		<li>ל?...

בהשוואה לתרבויות תאים 2D, טכנולוגיית תרבית כדורית תלת-ממדית מהפכנית היא כלי טוב וחזק יותר לשחזור המיקרו-סביבה של איבר, אינטראקציות בין תאים ותגובות סמים במבחנה. זהו הפרוטוקול הראשון המתאר היווצרות של כדוריות מקווי תאים רב תאיים (אפיתל ואנדהל) לחקר סרטן השד. פרוטוקול זה מבטיח צמיחה תלת-...

לשימוש בבעלי חיים לניסויים יש מגבלות. מחקרים בבעלי חיים אינם יכולים לחקות במדויק את התקדמות המחלה בבני אדם, ולבעלי חיים ובני אדם אין תגובות זהות לפתוגנים. בנוסף, הגבלות בניסויים בבעלי חיים בשל חשש לסבל בעלי חיים ובעיות אתיות1,2 יותר ויותר להגביל תוכניות מחקר. In vitro מערכות פותחו באופן נרחב כדי לעקוף את השימוש בבעלי חיים; יתר על כן, השימוש בתאים אנושיים עשה in vitro מודלים רלוונטיים יותר לחקירה הפתופיזיולוגית והטיפולית. תרבויות תאים קונבנציונליות של monolayer (2D) נמצאות בשימוש נרחב מכיוון שהן מחקות רקמות אנושיות במידה מסוימת. עם זאת, מונוקולטרות 2D לא מצליחות לחקות איברים אנושיים, ומונוקולטרות 2D אינן מסוגלות לדמות את המיקרו-וירוס המורכב של האיברים המקוריים ולחקות את in vivo המצב3,4,5,6. בנוסף, בתרביות תאים חד שכבתיים, טיפולים תרופתיים יכולים בקלות להרוס / לפגוע בכל התאים. חשוב לציין, ניתן להתגבר על חלק ממגבלות אלה על-ידי מעבר לתרבויות תאים תלת-ממדיות רב שכבתיות (תלת-ממדיות)7,8. למעשה, מודלים של תרבית תלת-ממדית הוכחו כמשקף טוב יותר את המבנה התאי, הפריסה והתפקוד של תאים ברקמות ראשוניות. ניתן ליצור תרביות תלת-ממד אלה באמצעות מגוון קווי תאים, בדומה לאיבר פונקציונלי. ואכן, ישנם שני מודלים של תרבויות תלת-ממד. מודל אחד מייצר כדוריות של תאים מצטברים היוצרים אשכולות ומארגנים אותם מחדש לספירות (מודלים ללא פיגומים). השני מניב organoids, אשר יש מבנה מורכב יותר מורכב מורכב שילובים של תאים מרובים ספציפיים לאיבר, אשר נחשבים גרסה זעירה של איברים9,10. בשל כך, מערכות תרבות תלת-ממדית מייצגות טכנולוגיה חדשנית עם יישומים ביולוגיים וקליניים רבים. לפיכך, לספרואידים ולאורגנואידים יש יישומים רבים למידול מחלות ומחקרים הקשורים לרפואה רגנרטיבית, הקרנת תרופות ומחקרים טוקסיקולוגיים6,11,12,13,14,15. כדוריות מסרטנות, המופקות מטכנולוגיית תלת-ממד, משחזרים את המורפולוגיה והפנוטיפ של סוגי תאים רלוונטיים, מחקים את in vivo מיקרו-סביבה של גידולים, מודל תקשורת תאים ומסלולי איתות פעילים במהלך התפתחות הגידול16,17,18. בנוסף, כדי לשפר את ההבנה הביולוגית של הסרטן, ניתן להשתמש בספירואידים/אורגנוידים של גידולים כדי לזהות טיפול אנטי-סרטני פוטנציאלי ספציפי לחולה (מותאם אישית) ולהעריך את יעילותו, רעילותו והשפעותיו ארוכות הטווח19,20,21,22. כדוריות פתחו הזדמנויות בולטות לחקור פתופיזיולוגיה, מידול מחלות והקרנת תרופות בגלל יכולתם לשמר את ארכיטקטורת הרקמות התאיות והתלת-ממדיות, היכולת לחקות את in vivo המצב, והאינטראקציות בין התא לתאים. עם זאת, יש גם להיות מודעים למגבלות של מערכת זו, כגון היעדר רכיב כלי דם / מערכתית, מערכת החיסון או מערכת העצבים התפקודית, והמערכת מייצגת גישה רדוקציוניסטית בהשוואה למודלים של בעלי חיים. ואכן, בניגוד למודלים של בעלי חיים, מבנים תלת-ממדיים מספקים רק קירוב של הביולוגיה בתוך גוף האדם. הבנת המגבלות של שיטת 3D עשויה לסייע לחוקרים לעצב תהליכים מעודנים ותקפים יותר לייצור כדוריות המייצגות טוב יותר איבר בקנה מידה גדול יותר23,24,25.
סרטן הוא הגורם המוביל למוות ברחבי העולם, וסרטן השד הוא הסרטן הנפוץ ביותר בקרב נשים26,27,28. כדי לחקות את המיקרו-סביבה המורכבת של סרטן השד, יש לתרבות כדורי סרטן השד באמצעות תאים הממלאים תפקיד בולט בגידולי השד, כלומר, תאי אפיתל, תאי אנדותל, פיברובלסטים ו/או תאי מערכת החיסון. יתר על כן, עבור כדורי המייצג סרטן השד, הביטוי של קולטני הורמון נשי (קולטני אסטרוגן / פרוגסטרון), היכולת לשמר את המצב היסטולוגי של הגידול החולה, ואת היכולת לחקות תגובה לטיפול יש לשקול גם. מחקרים הראו כי מערכות תרבית משותפת 3D יש ארגון הסלולר דומה לזה של הרקמה העיקרית ב vivo, יש את היכולת להגיב בזמן אמת לגירויים, ויש להם קולטני אנדרוגן פונקציונלי29,30,31,32. לפיכך, גישה דומה יכולה להיות שימושית כדי לחקות גידול בשד במבחנה. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא ליצור שיטה חדשה ליצירת כדורי סרטן השד. שיטה זו משתמשת בתאי MCF-7 חיוביים לקולטן אסטרוגן (קו תאים אנושי מונצח של תאי אפיתל) ותאי אנדותל וסקולריים (HUVECs) או תאי אנדותל לימפתיים (HMVEC-DNeo) כדי ליצור מודל המחקה או משקף מקרוב את האינטראקציות בין תאים אלה בתוך גידול. למרות MCF-7 (אסטרוגן מגיב) ותאי אנדותל שימשו לפיתוח כדורי במחקר הנוכחי, תאים אחרים כגון פיברובלסטים המייצגים ~ 80% של מסת הגידול בשד, יכול גם להיות משולב בעתיד כדי לייצג טוב יותר לחקות גידול השד.
ישנן מספר שיטות ליצירת כדוריות, כגון: 1) שיטת הטיפה התלויה המעסיקה כוח משיכה33,34; 2) שיטת הריחוף המגנטי המשתמשת בננו-חלקיקים מגנטיים החשופים למגנט חיצוני35, ו -3) שיטת המיקרו-לוחית הכדורית המבוצעת על ידי זריעת תאים על לוחות התקשרות נמוכים36,37. על בסיס השיטות הקיימות, המשתמשות רק בסוג תא אחד, הפרוטוקול הנוכחי עבר אופטימיזציה באמצעות תאי אפיתל ואנדותל כדי לחקות טוב יותר את תנאי הצמיחה של גידולים בסרטן השד ב vivo38,39,40,41. שיטה זו ניתן להשיג בקלות במעבדה בעלות נמוכה עם דרישות ציוד מינימליות. בהתבסס על הצורך / מטרות של המעבדה, גישות שונות שימשו ליצירת כדוריות ולקבל חומר תאי רלוונטי מן כדוריות אלה. בהקשר זה, עבור DNA, RNA, או ניתוח חלבון, כדורי התלת-ממד מיוצרים על ידי תאים אנדותל ואפיתל פולחניים עם שיטת טיפה תלויה. עם זאת, עבור מחקרים פונקציונליים, למשל, כדי לפקח על צמיחת התא לאחר הפרעה קצרה (siRNA) transfection ו/או טיפול הורמונלי, כדורי נוצרים באמצעות לוחות U-bottom.
מטרת הפרוטוקול הטכני הזה היא לספק תיאור מפורט שלב אחר שלב עבור 1) יצירת כדורי סרטן השד רב-תאיים, 2) הכנת דגימות להכתמה היסתולוגית, ו -3) אוסף תאים להפקת RNA, DNA וחלבונים. הן שיטת טיפת התלייה הזולה והן הצלחות היקרות יותר של U-bottom משמשות ליצירת כדוריות. כאן, פרוטוקול להכנת (תיקון) כדורי עבור חתך ולאחר מכן חיסונים עם סמנים כדי להעריך את התפשטות התא, אפופטוזיס, והפצה של אפיתל ותאי אנדותל בתוך כדורי מסופק. בנוסף, פרוטוקול זה מציג ניתוח מלא שלב אחר שלב של נתונים היסתולוגיים באמצעות תוכנת ImageJ. פרשנות הנתונים הביולוגיים משתנה בהתאם לסוג הניסוי והנוגדנים בהם נעשה שימוש. חלוקת כדוריות קבועות והכתמת החלקים לאחר מכן בוצעו על ידי מעבדה פתולוגית שגרתית (סופיסטולב: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

סרטן השד הוא הגורם המוביל לתמותה אצל נשים. הצמיחה של תאים סרטניים השד גרורות הבאות שלהם הוא גורם מפתח להתקדמות שלה. למרות המנגנונים המעורבים בקידום צמיחת סרטן השד נחקרו באינטנסיביות באמצעות מונוקולטרות של תאים סרטניים בשד כגון תאי MCF-7, תרומתם של סוגי תאים אחרים, כגון תאי אנדותל וסקולריים ולימפתיים המעורבים באופן אינטימי בגידול, לא נחקרה לעומק. אינטראקציה בין תאים ממלאת תפקיד מרכזי בצמיחת הגידול ובהתקדמותו. Neoangiogenesis, או התפתחות של כלי דם, חיוני לצמיחת הגידול, ואילו מערכת הלימפה משמשת פורטל לנדידת תאים סרטניים ולעלמות שלאחר מכן. מחקרים אחרונים מספקים ראיות כי תאי אנדותל כלי דם ולימפה יכול להשפיע באופן משמעותי על צמיחת תאים סרטניים. תצפיות אלה מרמזות על צורך בפיתוח מודלים במבחנה שישקפו באופן מציאותי יותר את תהליכי הצמיחה של סרטן השד ב- vivo. יתר על כן, הגבלות במחקר בבעלי חיים דורשות פיתוח של מודלים ex vivo כדי לברוח טוב יותר את המנגנונים המעורבים.
מאמר זה מתאר את ההתפתחות של כדורי סרטן השד המורכבים הן מתאי סרטן השד (תאי MCF-7 חיוביים לקולטן אסטרוגן) ותאי אנדותל וסקולריים ו/או לימפתיים. הפרוטוקול מתאר גישה מפורטת שלב אחר שלב ביצירת כדורי תאים כפולים באמצעות שתי גישות שונות, טיפה תלויה (תקן זהב וזול) וצלחות U-התחתונות 96-היטב (יקר). הוראות מעמיקות מסופקות כיצד להרים בעדינות את כדוריות שנוצרו כדי לפקח על הצמיחה על ידי גודל מיקרוסקופי והערכה של הכדאיות באמצעות כתמי תאים מתים וחיים. יתר על כן, נהלים לתיקון כדורי לחתך והכתמה עם נוגדנים ספציפיים לצמיחה כדי להבדיל דפוסי צמיחה בספירואידים הם מתווים. בנוסף, פרטים להכנת כדוריות עם תאים שהודבקו ושיטות לחילוץ RNA לניתוח מולקולרי מסופקים. לסיכום, מאמר זה מספק הוראות מעמיקות להכנת כדוריות מרובות תאים לחקר סרטן השד.

מודל כדורי באמצעות תרבויות אפיתל ואנדותל נדרש לחקות מקרוב בתנאי vivo של גידולי השד לניסויים במבחנה. התוכנית באיור 1 מתארת את הפרוטוקול ליצירת כדוריות עם תאי אפיתל לסרטן השד ותאי אנדותל וסקולריים או לימפתיים(איור 1). כל סוג תא נזרע בנפרד בצלחת עגולה 3....

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

הצלבה בין תאי אפיתל חלביים לתאי אנדותל תורמת חשובה להתקדמות סרטן השד, לצמיחת הגידול ולגרורות. במחקר זה, כדוריות נעשו מתאי סרטן השד יחד עם תאי אנדותל כלי דם ו/או לימפתיים ולהדגים את ישימותם כמערכת במבחנה לחקר סרטן השד.

כדורי תא אפיתל ואנדותל של חלבי כמודל הפריה תפקודי פוטנציאלי לחקר סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

כדורי תאי סרטן השד המתוארים כאן יאפשרו לחוקרים לחקור מנגנונים מולקולריים של אינטראקציות תאי אנדותל של תאים סרטניים המעורבים בשגשוג ובגלמת תאים סרטניים. היתרון העיקרי של מודל תלת-ממד זה הוא שהוא מספק סידור תאי מציאותי יותר המשפרת את אמינות המסקנות לגבי הפתופיזיולוגיה והטיפול בסרטן השד. מדגימה את ההליך תהיה ג'ובאנה אזאריטו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי.התחל על ידי טיפול או טרנספקט של התאים מצופים במשך 24 שעות, או לפי הצורך. לזיהוי התפלגות תאים בספירואיד, יש לשטוף את התאים במיליליטר אחד של תמיסת מלח מאוזנת של Hanks'Balanced Solution או HBSS, המכיל סידן ומגנזיום ולהישאר ב- HUVECs באמצעות 0.5 מיקרוגרם לצבע כחול מיליליטר. ותאי MCF-7 המשתמשים בצבע ירוק מיקרומולרי 0.5 מדוללים ביחס למדיום הצמיחה.מניחים את הצלחת לתוך 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים CO2 אינקובטור במשך 30 עד 40 דקות. לשטוף את התאים עם מיליליטר אחד של HBSS ללא סידן ומגנזיום. לאחר מכן להוסיף מיליליטר אחד של סוכן מחדש ניתוק אנזימטי, שהוא 0.25% טריפסין עבור HUVEC ו 0.5% נסיעות בארבעה MCF-7 לכל צלחת חומה באמצעות פיפטה P1000.בחר כל סוג תא בנפרד בצינור פוליסטירן תחתון עגול חמישה מיליליטר, ולהוסיף מיליליטר אחד של סרום עגל עוברי 10% או בינוני FCS באמצעות פיפטה P1000 כדי לעצור את התגובה אנזימטית. ואז צנטריפוגה ההשעיות התא ב 250 פעמים G במשך חמש דקות. בזהירות לשאוף supernatant ולהשעות את התאים במיליליטר אחד של מדיום ללא סטרואידים.השתמש 100 microliters של כל השעיה תא מדולל עם 10 מיליליטר של דילול 2 כדי לקבוע את מספר התא הכולל. הפעל את המחשב ורוקן על-ידי לחיצה על לחצני הפונקציה וההפעלה, עם פתרון דילול 2 במתקפת מונה התא. השתמש בגדר כארבע ולחץ על התחל למדוד את הריק עם פתרון 2 דילול טרי.שנה את מבחן הניקוד עם 100 מיקרוליטרים של השעיית תאים ב 10 מיליליטר של פתרון דילול 2. השתמש בגדר כארבע ולחץ על התחל למדוד את הדגימות. שים לב למספר התאים למיליליטר על הצג הדיגיטלי, ואז להכין חמישה מיליליטר של כל מתלה תא ולערבב אותם כדי לקבל נפח סופי של 10 מיליליטר ביחס אחד לאחד, באמצעות pipette חוזר ידני כדי pipette החוצה 100 microliters של השעיית התא לתוך כל באר של צלחת U-bottom 96 טוב.מניחים את הצלחת לתוך אינקובטור בתנאי תרבית רקמות סטנדרטיים ולבדוק היווצרות כדוריות לאחר 48 שעות. צלם תמונות של כדוריות אלה בהגדלה של 40 X באמצעות ניגודיות פאזה או מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. להכנת תרבות הטיפה התלויה מערבבים את מתלי התאים ביחס של אחד לאחד כדי לקבל נפח סופי של שני מיליליטר.השתמש פיפטה P20 כדי לראות את תערובת התא בצורה של 15 טיפות microliter על עופרת הפוכה של צלחת פטרי 10 ס"מ. הפוך את המכסה עם טיפות ולהוסיף חמישה מיליליטר של EBM-2 בסיס בינוני בתחתית המנה כדי למנוע אידוי של טיפות. לאסוף כ 50 כדוריות בצינור 1.5 מיליליטר עם קצה המעיים של פיפטה מיקרוליטר P200.אפשר להם להתיישב לתחתית הצינור על ידי כוח המשיכה ולאחר מכן להשליך את supernatant. תקן את כדורי זה עם 500 מיקרוליטרים של 4%PFA לשעה אחת בטמפרטורת החדר. מרתיחים 2%תמיסת נובל אלגור ב-PBS באמצעות פלטה חמה עם ערבוב מגנטי במשך שלוש עד חמש דקות כדי להמיס את האבקה האוגורית לחלוטין ומצוננת לסביבות 60 מעלות צלזיוס.הסר PFA עם פיפטה P1000, לשטוף את הכדורידים האלה עם 500 microliters של PBS ולאפשר להם משקעים. לאחר התיישב להשליך את supernatant בזהירות pipette 600 microliters של פתרון אגורה לתוך צינור 1.5 מיליליטר עם כדורי והניחו את הצינור מיד בצנטריפוגה עם רוטור אופקי ב 177 פעמים G במשך שתי דקות. הוסף מחרוזת קצרה באמצע פתרון אגרו כדי להסיר בקלות את התקע מהצינור.לחזק את תקע אגרו על קרח, או בארבע מעלות צלזיוס להוסיף 500 microliters של PBS לתוך צינור 1.5 מיליליטר כדי למנוע ייבוש הכדור. השג תמונות של מקטעים כדוריים באמצעות מיקרוסקופ סטריאו. חשב את כמות הפתרון הדרוש כדי להוסיף 10 microliters לכל באר של תערובת של סידן Aam ואתידיום homodimers מדולל באמצעות EBM-2 ביחס אחד עד 50.מוסיפים את תערובת הכתמים לספרואידים ומניחים את הצלחת באינקובטור תחת התקן, תנאי תרבית הרקמות במשך 30 עד 60 דקות. השג תמונות בהגדלה של 40 X באמצעות מיקרוסקופ סטריאו פלואורסצנטי. בלוחות התחתית של כדוריות נצפתה היווצרות כדורית 48 שעות לאחר זריעת תאי MCF שבעה.עם זאת, היווצרות כדורית לא נצפתה במקרה של תאי אנדותל או תאי לימפה. זריעת ה- MCF שבעה בתוספת תאי אנדותל או MCF שבע בתוספת תאי לימפה ביחס של אחד לאחד הביאה גם להיווצרות כדורית. צמיחה רציפה תלוית זמן של MCF שבע ספרואיד נרשם נע בין 24 ל 120 שעות.גודל כדורי גדל מ 100 מיקרומטר לכ 200 מיקרומטר מעל בחמישה ימים. עם קצב צמיחה מוגבר נצפתה כדורי שטופלו עם ממריץ הצמיחה. המבנה של כדורי ואת הצורה של התאים שלהם לא הראו חריגות בעקבות transfection עם שליטה אוליגונוקלאוטידים בנוכחות ליפופקטמין.תאים המבטאים את הסמן הרב שלהם Ki-67 הופצו באופן הומוגני בספירואידים אלה. Cleave כדי caspase שלושה כתמים של כדורי זה הראה תאים אדישים לאחר ארבעה ימים של תרבות. מחקר של התאים בספירואידים אלה עם CD-31 ו- Ki-67 גילה כי 55% מהתאים הם אפיתל 45%הם אנדותל ו -25% מהתאים מתרבים.כדי להעריך את אחוז התאים החיים והמתים ארבעה כדורים בני ארבעה ימים היו מוכתמים בסידן Aam ואתידיום-הומודימר. ספרואיד שנחשב זה עתה גם כתם על תאים מתים וחיים גילה כי כדורי רגישים מאוד לתנאי הקפאה. בעת ביצוע הפרוטוקול שלו, ודא כי תאים בריאים משמשים לערבב אפרודיטה דבר נוסף לזכור יהיה למנוע נזק אפרודיטה אלה במהלך כובע DP כדי להשיג קטעים טובים גם להבטיח לחך אפרודיטה לפני פני פילמורים.מודל זה יכול להשתפר עוד יותר על ידי הכללת תאים אחרים, כגון פיברובלסטים המעורבים בהתקדמות הגידול ושימוש בו כדי להעריך את היעילות של סוכנים טיפוליים המתמקדים בצמיחה סרטן.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

ניצול הקרנת Genomics פונקציונלית כדי לזהות מטרות תרופה חדשנית פוטנציאלי תרבויות אליפטית תא סרטני

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

כירורגית נהלים ומתודולוגיה עבור מודל Murlin פרה קלינית של<em&gt; דה נובו</em&gt; גרורות סרטן החלב

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

מודל הזרקת Portal Vein לחקר גרור בכבד של סרטן השד

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

קבלת סרטן גזע כדורים מגינקולוגית סרטן השד גידולים

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

לומדת משולשת סרטן השד שלילי באמצעות אורתובנושא שד סרטן השד מודל

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

חולדה השתלת תא האפיתל לתוך משטח שומן לבן הגלימה

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

השתלה אורתוטופית של גידולי שד כמודלים פרה-אקליניים לסרטן השד

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

הערכה במבחנה של טרנספורמציה אונקוגנית בתאי אפיתל ממ"ר אנושיים

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

בידוד והערכה תפקודית של תאי גזע מסרטן השד האנושי מדגימות תאים ורקמות

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...