Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta dalla Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 a RKD e National Institute of Health grant DK079307 a EKJ.

1. Coltura cellulare
NOTA: Condurre la manipolazione delle cellule in condizioni sterili.
<ol><li>Sottocoltura delle cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC)<ol>
<li>Rivestire 75 cm2 palloni con collagene (5 μg/cm2) (coda di ratto) durante la notte (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 ore a 37 °C, risciacquare con acqua e lasciare asciugare il matraccio.</li>
		<li>Crescere HUVEC in terreno di crescita (EBM-2, Endothelial Basal Medium-2) integrato con...

Rispetto alle colture cellulari 2D, la rivoluzionaria tecnologia di coltura sferoide 3D è uno strumento migliore e più potente per ricostruire il microambiente di un organo, le interazioni cellula-cellula e le risposte ai farmaci in vitro. Questo è il primo protocollo che descrive la formazione di sferoidi da linee cellulari multicellulari (epiteliali ed endoteliali) per la ricerca sul cancro al seno. Questo protocollo garantisce la crescita 3D sferoidale degli sferoidi per un massimo di 5 giorni e gli sferoi...

L'uso di animali per esperimenti ha dei limiti. Gli studi sugli animali non possono imitare accuratamente la progressione della malattia negli esseri umani e gli animali e gli esseri umani non hanno risposte identiche agli agenti patogeni. Inoltre, le restrizioni nella sperimentazione animale a causa delle preoccupazioni per la sofferenza degli animali e dei problemi etici1,2 vincolano sempre più i programmi di ricerca. In vitro sono stati ampiamente sviluppati sistemi per eludere l'uso degli animali; inoltre, l'uso di cellule umane ha reso in vitro modelli più rilevanti per l'indagine fisiopatologica e terapeutica. Le colture cellulari monostrato convenzionali (2D) sono ampiamente utilizzate perché imitano i tessuti umani in una certa misura. Tuttavia, le monocolture 2D non riescono a imitare gli organi umani e le monocolture 2D non sono in grado di simulare il complesso microambiente degli organi originali e imitare il in vivo situazione3,4,5,6. Inoltre, nelle colture cellulari monostrato, i trattamenti farmacologici potrebbero facilmente distruggere / danneggiare tutte le cellule. È importante sottolineare che alcune di queste limitazioni possono essere superate passando a colture cellulari tridimensionali multistrato (3D)7,8. In effetti, i modelli di coltura 3D hanno dimostrato di riflettere meglio la struttura cellulare, il layout e la funzione delle cellule nei tessuti primari. Queste colture 3D possono essere formate utilizzando una varietà di linee cellulari, simili a un organo funzionale. In effetti, ci sono due modelli di culture 3D. Un modello produce sferoidi di cellule aggregate che formano cluster e li riorganizzano in sfere (modelli senza impalcature). Il secondo produce organoidi, che hanno una struttura più complessa e consistono in combinazioni di più cellule specifiche dell'organo, che sono considerate come una versione in miniatura degli organi9,10. Per questo motivo, i sistemi di coltura 3D rappresentano una tecnologia innovativa con molte applicazioni biologiche e cliniche. Pertanto, gli sferoidi e gli organoidi hanno numerose applicazioni per la modellazione delle malattie e gli studi relativi alla medicina rigenerativa, allo screening dei farmaci e agli studi tossicologici.6,11,12,13,14,15. Gli sferoidi cancerogeni, derivati dalla tecnologia 3D, ricreano la morfologia e il fenotipo dei tipi cellulari rilevanti, imitano il in vivo microambiente tumorale e modelli di comunicazioni cellulari e vie di segnalazione che sono operative durante lo sviluppo del tumore16,17,18. Inoltre, per migliorare la comprensione della biologia del cancro, gli sferoidi / organoidi tumorali possono anche essere utilizzati per identificare una potenziale terapia antitumorale specifica per il paziente (personalizzata) e valutarne l'efficacia, la tossicità e gli effetti a lungo termine19,20,21,22. Gli sferoidi hanno aperto importanti opportunità per studiare la fisiopatologia, la modellazione delle malattie e lo screening dei farmaci a causa della loro capacità di preservare l'architettura dei tessuti cellulari e tridimensionali, la capacità di imitare il in vivo e le interazioni cellula-cellula. Tuttavia, si deve anche essere consapevoli dei limiti di questo sistema, come la mancanza di componente vascolare / sistemica, sistema immunitario funzionale o nervoso, e il sistema rappresenta un approccio riduzionista rispetto ai modelli animali. Infatti, a differenza dei modelli animali, le strutture 3D forniscono solo un'approssimazione della biologia all'interno di un corpo umano. Comprendere i limiti del metodo 3D può aiutare i ricercatori a progettare processi più raffinati e validi per la produzione di sferoidi che rappresentino meglio un organo su scala più ampia.23,24,25.
Il cancro è la principale causa di morte in tutto il mondo e il cancro al seno è il cancro più comune nelle donne26,27,28. Per imitare il complesso microambiente del cancro al seno, gli sferoidi del cancro al seno devono essere coltivati utilizzando cellule che svolgono un ruolo di primo piano nei tumori al seno, cioè cellule epiteliali, cellule endoteliali, fibroblasti e / o cellule immunitarie. Inoltre, per uno sferoide che rappresenta il cancro al seno, dovrebbero essere prese in considerazione anche l'espressione dei recettori ormonali femminili (recettori degli estrogeni / progesterone), la capacità di conservare lo stato istologico del tumore del paziente e la capacità di imitare la risposta alla terapia. Gli studi hanno dimostrato che i sistemi di co-coltura 3D hanno un'organizzazione cellulare simile a quella del tessuto primario in vivo,hanno la capacità di reagire in tempo reale agli stimoli, e hanno recettori androgeni funzionali29,30,31,32. Quindi, un approccio simile potrebbe essere utile per imitare un tumore al seno in vitro. Lo scopo dell'attuale protocollo è quello di stabilire un nuovo metodo per generare sferoidi del cancro al seno. Questo metodo utilizza cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni (una linea cellulare umana immortalizzata di cellule epiteliali) e cellule endoteliali vascolari (HUVEC) o cellule endoteliali linfatiche (HMVEC-DNeo) per creare un modello che imita o riflette da vicino le interazioni tra queste cellule all'interno di un tumore. Sebbene MCF-7 (estrogeno-responsivo) e cellule endoteliali siano state utilizzate per sviluppare sferoidi nel presente studio, altre cellule come i fibroblasti che rappresentano circa l'80% della massa tumorale al seno, potrebbero anche essere combinate in futuro per rappresentare e imitare meglio il tumore al seno.
Esistono diversi metodi per formare sferoidi, come: 1) il metodo delle goccioline appese che impiega la gravità33,34; 2) il metodo di levitazione magnetica che utilizza nanoparticelle magnetiche esposte ad un magnete esterno35,e 3) il metodo delle micropiastre sferoidi che viene eseguito seminando cellule su piastre a basso attacco36,37. Sulla base dei metodi esistenti, che utilizzano un solo tipo di cellula, il presente protocollo è stato ottimizzato utilizzando cellule epiteliali ed endoteliali per imitare meglio le condizioni di crescita dei tumori del cancro al seno in vivo38,39,40,41. Questo metodo può essere facilmente ottenuto in laboratorio a basso costo e con requisiti minimi di attrezzatura. Sulla base delle necessità / obiettivi del laboratorio, sono stati utilizzati diversi approcci per formare sferoidi e ottenere materiale cellulare rilevante da questi sferoidi. In questo contesto, per l'analisi del DNA, dell'RNA o delle proteine, gli sferoidi 3D sono prodotti co-coltivando cellule endoteliali ed epiteliali con il metodo della goccia sospesa. Tuttavia, per gli studi funzionali, ad esempio, per monitorare la crescita cellulare dopo una breve trasfezione interferente (siRNA) e / o un trattamento ormonale, gli sferoidi vengono generati utilizzando piastre A-fondo.
Lo scopo di questo protocollo tecnico è quello di fornire una descrizione dettagliata passo-passo per 1) formare sferoidi di tipo multicellulare del cancro al seno, 2) preparare campioni per la colorazione istologica e 3) raccogliere cellule per l'estrazione di RNA, DNA e proteine. Sia il metodo economico della goccia sospesa che le piastre più costose con fondo a U vengono utilizzate per formare sferoidi. Qui, viene fornito un protocollo per la preparazione (fissaggio) di sferoidi per il sezionamento e la successiva immunocolorazione con marcatori per valutare la proliferazione cellulare, l'apoptosi e la distribuzione delle cellule epiteliali ed endoteliali all'interno di uno sferoide. Inoltre, questo protocollo mostra un'analisi completa passo-passo dei dati istologici utilizzando il software ImageJ. L'interpretazione dei dati biologici varia a seconda del tipo di esperimento e degli anticorpi utilizzati. Il sezionamento degli sferoidi fissi e la successiva colorazione delle sezioni è stato eseguito da un laboratorio di patologia di routine (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Il cancro al seno è la principale causa di mortalità nelle donne. La crescita delle cellule del cancro al seno e le loro successive metastasi è un fattore chiave per la sua progressione. Sebbene i meccanismi coinvolti nella promozione della crescita del cancro al seno siano stati intensamente studiati utilizzando monocolture di cellule di cancro al seno come le cellule MCF-7, il contributo di altri tipi di cellule, come le cellule endoteliali vascolari e linfatiche che sono intimamente coinvolte nella crescita del tumore, non è stato studiato in profondità. L'interazione cellula-cellula svolge un ruolo chiave nella crescita e nella progressione del tumore. La neoangiogenesi, o lo sviluppo dei vasi, è essenziale per la crescita del tumore, mentre il sistema linfatico funge da portale per la migrazione delle cellule tumorali e le successive metastasi. Studi recenti forniscono la prova che le cellule endoteliali vascolari e linfatiche possono influenzare significativamente la crescita delle cellule tumorali. Queste osservazioni implicano la necessità di sviluppare modelli in vitro che riflettano più realisticamente i processi di crescita del cancro al seno in vivo. Inoltre, le restrizioni nella ricerca sugli animali richiedono lo sviluppo di modelli ex vivo per chiarire meglio i meccanismi coinvolti.
Questo articolo descrive lo sviluppo di sferoidi del cancro al seno composti sia da cellule di cancro al seno (cellule MCF-7 positive al recettore degli estrogeni) che da cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche. Il protocollo descrive un approccio dettagliato passo-passo nella creazione di sferoidi a doppia cella utilizzando due diversi approcci, hanging drop (gold standard ed economico) e piastre a U a 96 pozzetti (costose). Vengono fornite istruzioni approfondite su come raccogliere delicatamente gli sferoidi formati per monitorare la crescita mediante dimensionamento microscopico e valutazione della vitalità utilizzando la colorazione di cellule morte e vive. Inoltre, vengono delineate le procedure per fissare gli sferoidi per il sezionamento e la colorazione con anticorpi specifici della crescita per differenziare i modelli di crescita negli sferoidi. Inoltre, vengono forniti dettagli per la preparazione di sferoidi con cellule trasfettate e metodi per estrarre l'RNA per l'analisi molecolare. In conclusione, questo articolo fornisce istruzioni approfondite per la preparazione di sferoidi multicellulari per la ricerca sul cancro al seno.

Il modello di sferoidi che utilizza co-colture epiteliali ed endoteliali è necessario per imitare da vicino le condizioni in vivo dei tumori al seno per esperimenti in vitro. Lo schema in Figura 1 illustra il protocollo per formare sferoidi con cellule epiteliali del cancro al seno e cellule endoteliali vascolari o linfatiche (Figura 1). Ogni tipo di cellula viene seminato separatamente in un piatto rotondo di 3,5 cm e trattato con stimolatori...

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Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research (Video) | JoVE

La diafonia tra cellule epiteliali mammarie e cellule endoteliali contribuisce in modo importante alla progressione del cancro al seno, alla crescita del tumore e alle metastasi. In questo studio, gli sferoidi sono stati realizzati da cellule di cancro al seno insieme a cellule endoteliali vascolari e / o linfatiche e dimostrano la loro applicabilità come sistema in vitro per la ricerca sul cancro al seno.

Sferoidi epiteliali ed endoteliali mammari come potenziale modello funzionale in vitro per la ricerca sul cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Gli sferoidi a cellule di cancro al seno qui descritti consentiranno ai ricercatori di studiare i meccanismi molecolari delle interazioni delle cellule endoteliali delle cellule tumorali che sono coinvolte nella proliferazione e nelle metastasi delle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questo modello 3D è che fornisce una disposizione cellulare più realistica che migliora l'affidabilità delle inferenze riguardanti la fisiopatologia e il trattamento del cancro al seno. A dimostrare la procedura sarà Giovanna Azzarito, dottoranda del mio laboratorio.Iniziare trattando o trasfezionando le cellule placcate per 24 ore o come desiderato. Per identificare la distribuzione cellulare nello sferoide, lavare le cellule con un millilitro di Hanks'Balanced Salt Solution o HBSS, contenente calcio e magnesio e rimanere in HUVEC usando 0,5 microgrammi per millilitro colorante blu. E le cellule MCF-7 utilizzano 0,5 coloranti verdi micromolari diluiti nel rispetto del mezzo di crescita.Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius e cinque percento di CO2 per 30-40 minuti. Lavare le cellule con un millilitro di HBSS senza calcio e magnesio. Quindi aggiungere un millilitro di ri-agente di distacco enzimatico, che è lo 0,25% di tripsina per HUVEC e lo 0,5% di viaggi in quattro MCF-7 a ciascun piatto marrone usando una pipetta P1000.Eleggere ciascun tipo di cellula separatamente in un tubo di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri e aggiungere un millilitro di siero per vitello fetale al 10% o mezzo FCS usando una pipetta P1000 per fermare la reazione enzimatica. Quindi centrifugare le sospensioni cellulari a 250 volte G per cinque minuti. Aspirare accuratamente il surnatante e sospendere le cellule in un millilitro di mezzo privo di steroidi.Utilizzare 100 microlitri di ogni sospensione cellulare diluita con 10 millilitri di diluente 2 per determinare il numero totale di cellule. Accendere la macchina e lavare premendo i pulsanti funzione e di avvio, con la soluzione di Diluent 2 in un flaconcino del contatore cellulare. Utilizzare set up come quattro e premere start per misurare lo spazio vuoto con una soluzione fresca di Diluent 2.Cambiare il flaconcino di scintillazione con 100 microlitri di sospensione cellulare in 10 millilitri di soluzione di Diluente 2. Utilizzare imposta come quattro e premere start per misurare i campioni. Notare il numero di celle per millilitro sul display digitale, quindi preparare cinque millilitri di ciascuna sospensione cellulare e mescolarli per ottenere un volume finale di 10 millilitri in un rapporto uno a uno, utilizzando la pipetta a ripetizione manuale per pipettare 100 microlitri della sospensione cellulare in ciascun pozzetto della piastra inferiore a U a 96 pozzetti.Posizionare la piastra in un'incubatrice in condizioni standard di coltura tissutale e verificare la presenza di una formazione di sferoidi dopo 48 ore. Scatta foto di questi sferoidi con ingrandimento 40 X usando uno stereomicroscopio a contrasto di fase o a fluorescenza. Per preparare la coltura a goccia sospesa mescolare le sospensioni cellulari in un rapporto uno-a-uno per ottenere un volume finale di due millilitri.Utilizzare una pipetta P20 per vedere la miscela cellulare sotto forma di gocce di microlitro 15 sul piombo invertito di una capsula di Petri di 10 centimetri. Capovolgere il coperchio con le gocce e aggiungere cinque millilitri di EBM-2 base medium sul fondo del piatto per evitare l'evaporazione delle gocce. Raccogliere circa 50 sferoidi in un tubo da 1,5 millilitri con una punta intestinale di una pipetta di microlitri P200.Lasciare che si depositino sul fondo del tubo per gravità e quindi scartare il surnatante. Fissare questi sferoidi con 500 microlitri di 4% PFA per un'ora a temperatura ambiente. Far bollire il 2% della soluzione Nobel Algor in PBS usando una piastra calda con una mescola magnetica per tre-cinque minuti per sciogliere completamente la polvere di auguri e raffreddarla a circa 60 gradi Celsius.Rimuovere il PFA con una pipetta P1000, lavare questi sferoidi con 500 microlitri di PBS e lasciarli sedimentare. Una volta sistemato, scartare con cura il surnatante pipettare 600 microlitri della soluzione di Agora nel tubo da 1,5 millilitri con sferoidi e posizionare immediatamente il tubo in una centrifuga con rotore orizzontale a 177 volte G per due minuti. Aggiungere una stringa corta al centro della soluzione Agro per rimuovere facilmente la spina dal tubo.Solidificare il tappo Agros sul ghiaccio, o a quattro gradi Celsius aggiungere 500 microlitri di PBS nel tubo da 1,5 millilitri per evitare di asciugare il pellet. Acquisire immagini di sezioni sferoidi utilizzando uno stereomicroscopio. Calcolare la quantità di soluzione necessaria per aggiungere 10 microlitri per pozzetto di una miscela di calcio Aam e omodimeri di etidio diluiti usando EBM-2 in un rapporto uno a 50.Aggiungere la miscela colorante agli sferoidi e posizionare la piastra nell'incubatore sotto lo standard, le condizioni di coltura tissutale per 30-60 minuti. Acquisisci immagini con ingrandimento 40 X utilizzando lo stereomicroscopio a fluorescenza. Nelle placche con fondo a U la formazione di sferoidi è stata osservata 48 ore dopo la semina di sette cellule MCF.Tuttavia, la formazione di sferoidi non è stata osservata nel caso di cellule endoteliali o cellule linfatiche. La semina di MCF sette più cellule endoteliali o MCF sette più cellule linfatiche in rapporto uno a uno ha anche portato alla formazione di sferoidi. È stata registrata una crescita sequenziale dipendente dal tempo di sette sferoidi MCF che vanno da 24 a 120 ore.La dimensione degli sferoidi è aumentata da circa 100 micrometri a circa 200 micrometri in cinque giorni. Con un aumento del tasso di crescita osservato negli sferoidi trattati con lo stimolatore della crescita. La struttura degli sferoidi e la forma delle loro cellule non hanno mostrato anomalie a seguito della trasfezione con oligonucleotidi di controllo in presenza di Lipofectamine.Le cellule che esprimono il loro marcatore proliferativo Ki-67 sono state distribuite in modo omogeneo in questi sferoidi. Cleave to caspase tre colorazioni di questi sferoidi hanno mostrato cellule apatiche dopo quattro giorni di coltura. Lo studio delle cellule in questi sferoidi con CD-31 e Ki-67 ha rivelato che il 55% delle cellule sono epiteliali, il 45% sono endoteliali e il 25% delle cellule proliferano.Per valutare la percentuale di cellule vive e morte, gli sferoidi di quattro giorni sono stati colorati con calcio Aam ed etidium-omodimer. Uno sferoide appena pensato anche per le cellule morte e vive ha rivelato che gli sferoidi sono molto sensibili alle condizioni di congelamento. Quando si segue il suo protocollo, assicurarsi che le cellule sane vengano utilizzate per mescolare afrodite Un'altra cosa da ricordare sarebbe quella di evitare di danneggiare queste afrodite durante il tappo DP per ottenere una buona sezione anche assicurando al palato l'afrodite prima del across polimerizza.Questo modello potrebbe essere ulteriormente migliorato includendo altre cellule, come i fibroblasti coinvolti nella progressione del tumore e utilizzandolo per valutare l'efficacia degli agenti terapeutici mirati alla crescita del cancro.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures (Video) | JoVE

Utilizzando Genomica Funzionale screening per identificare gli obiettivi farmaco potenzialmente romanzo in Cancer Cell Culture Spheroid

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Ricerca

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In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE

Valutazione in vitro della trasformazione oncogenica nelle cellule epiteliali mammarie umane

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples (Video) | JoVE

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...