Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 til RKD og National Institute of Health grant DK079307 til EKJ.

1. Cellekultur
MERK: Utfør cellehåndtering under sterile forhold.
<ol><li>Human Navlestreng Vene Endotelceller (HUVEC) subkultur<ol>
<li>Strøk 75 cm2 kolber med kollagen (5 μg/cm2) (rottehale) over natten (ON) ved romtemperatur (RT) eller 2-3 t ved 37 °C, skyll med vann og la kolben tørke.</li>
		<li>Vokse HUVECs i vekstmedium (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) supplert med glutamin (1x = 2 mM), antibiotika-antimykotisk løsning (AA; 100 μg/ml streptomycin, 100 ?...

Sammenlignet med 2D-cellekulturer er revolusjonerende 3D-sfæroidkulturteknologi et bedre og kraftigere verktøy for å rekonstruere et organs mikromiljø, cellecelleinteraksjoner og legemiddelresponser in vitro. Dette er den første protokollen som beskriver dannelsen av sfæroider fra multicellulære (epiteliale og endoteliale) cellelinjer for brystkreftforskning. Denne protokollen sikrer sfæroidal 3D-vekst av sfæroider i opptil 5 dager, og sfæroider kan undersøkes etter parafininnbygging, seksjonering og ...

Bruken av dyr til eksperimenter har begrensninger. Dyrestudier kan ikke nøyaktig etterligne sykdomsprogresjon hos mennesker, og dyr og mennesker har ikke identiske svar på patogener. I tillegg er restriksjoner i dyreforsøk på grunn av bekymringer for dyrelidelse og etiske problemer1,2 i økende grad begrense forskningsprogrammer. In vitro systemer har blitt mye utviklet for å omgå bruken av dyr; Videre har bruken av humane celler gjort at in vitro modeller som er mer relevante for den patofysiologiske og terapeutiske undersøkelsen. Konvensjonelle monolayer (2D) cellekulturer er mye brukt fordi de etterligner menneskelig vev til en viss grad. Imidlertid klarer ikke 2D-monokulturer å etterligne menneskelige organer, og 2D-monokulturer er ikke i stand til å simulere det komplekse mikromiljøet i de opprinnelige organene og etterligne in vivo situasjon3,4,5,6. I tillegg, i monolayer cellekulturer, narkotika behandlinger kan lett ødelegge / skade alle cellene. Det er viktig at noen av disse begrensningene overvinnes ved å bytte til tredimensjonale cellekulturer med flere lag (3D)7,8. Faktisk har 3D-kulturmodeller vist seg å bedre gjenspeile cellulær struktur, layout og funksjon av celler i primærvev. Disse 3D-kulturene kan dannes ved hjelp av en rekke cellelinjer, som ligner et funksjonelt organ. Faktisk er det to modeller av 3D-kulturer. En modell produserer sfæroider av aggregerte celler som danner klynger og omorganiserer dem til sfærer (stillasfrie modeller). Den andre gir organoider, som har en mer kompleks struktur og består av kombinasjoner av flere organspesifikke celler, som betraktes som en miniatyrversjon av organer.9,10. På grunn av dette representerer 3D-kultursystemer en innovativ teknologi med mange biologiske og kliniske applikasjoner. Dermed har sfæroider og organoider mange anvendelser for sykdomsmodellering og studier relatert til regenerativ medisin, legemiddelscreening og toksikologiske studier.6,11,12,13,14,15. Kreftfremkallende sfæroider, avledet fra 3D-teknologi, gjenskaper morfologien og fenotypen til relevante celletyper, etterligner in vivo tumormikromiljø, og modellcellekommunikasjon og signalveier som er operative under tumorutvikling16,17,18. I tillegg, for å forbedre kreftbiologiforståelsen, kan tumorsfæroider/organoider også brukes til å identifisere en potensiell pasientspesifikk antikreftbehandling (personlig) og vurdere effekt, toksisitet og langsiktige effekter.19,20,21,22. Sfæroider har åpnet fremtredende muligheter for å undersøke patofysiologi, sykdomsmodellering og legemiddelscreening på grunn av deres evne til å bevare cellulær og tredimensjonal vevsarkitektur, evnen til å etterligne in vivo og cellecelleinteraksjonene. Imidlertid må man også være klar over begrensningene i dette systemet, for eksempel mangel på vaskulær / systemisk komponent, funksjonelt immun- eller nervesystem, og systemet representerer en reduksjonistisk tilnærming sammenlignet med dyremodeller. Faktisk, i motsetning til dyremodeller, gir 3D-strukturer bare en tilnærming av biologien i en menneskekropp. Å forstå begrensningene i 3D-metoden kan hjelpe forskere med å designe mer raffinerte og gyldige prosesser for å produsere sfæroider som bedre representerer et organ i større skala.23,24,25.
Kreft er den ledende dødsårsaken over hele verden, og brystkreft er den vanligste kreftformen hos kvinner26,27,28. For å etterligne den komplekse mikromiljøet av brystkreft, bør brystkreftsfæroider dyrkes ved hjelp av celler som spiller en fremtredende rolle i brysttumorer, det vil si epitelceller, endotelceller, fibroblaster og / eller immunceller. Videre, for en sfæroid som representerer brystkreft, bør uttrykket av kvinnelige hormonreseptorer (østrogen / progesteronreseptorer), evne til å bevare pasientens tumor histologisk status, og evne til å etterligne respons på terapi også vurderes. Studier har vist at 3D-samkultursystemer har en cellulær organisasjon som ligner på det primære vevet in vivo, har evnen til å reagere i sanntid på stimuli, og har funksjonelle androgenreseptorer29,30,31,32. Derfor kan en lignende tilnærming være nyttig for å etterligne en brystsvulst in vitro. Formålet med den nåværende protokollen er å etablere en ny metode for å generere brystkreftsfæroider. Denne metoden benytter østrogenreseptorpositive MCF-7-celler (en udødeliggjort human cellelinje av epitelceller) og vaskulære endotelceller (HUVEC) eller lymfatiske endotelceller (HMVEC-DNeo) for å lage en modell som etterligner eller reflekterer samspillet mellom disse cellene i en svulst. Selv om MCF-7 (østrogenresponsive) og endotelceller har blitt brukt til å utvikle sfæroider i den nåværende studien, kan andre celler som fibroblaster som representerer ~ 80% av brystsvulstmassen, også kombineres i fremtiden for bedre å representere og etterligne brystsvulst.
Det finnes flere metoder for å danne sfæroider, for eksempel: 1) den hengende dråpemetoden som bruker tyngdekraften33,34; 2) den magnetiske levitasjonsmetoden som bruker magnetiske nanopartikler utsatt for en ekstern magnet35, og 3) sfæroidmikroplatemetoden som utføres av såingsceller på lavfesteplater36,37. På grunnlag av de eksisterende metodene, som bare bruker en celletype, har den nåværende protokollen blitt optimalisert ved hjelp av epitelceller og endotelceller for bedre å etterligne vekstforholdene til brystkreftsvulster i vivo38,39,40,41. Denne metoden kan enkelt oppnås i laboratoriet til en lav pris og med minimale utstyrskrav. Basert på laboratoriets behov/mål ble ulike tilnærminger brukt til å danne sfæroider og få relevant cellulært materiale fra disse sfæroidene. I denne sammenhengen, for DNA-, RNA- eller proteinanalyse, produseres 3D-sfæroidene ved å kokulturere endotelceller og epitelceller med hengende dråpemetode. Men for funksjonelle studier, for eksempel for å overvåke cellevekst etter kort forstyrrende (siRNA) transfeksjon og / eller hormonbehandling, genereres sfæroidene ved hjelp av U-bunnplater.
Formålet med denne tekniske protokollen er å gi en detaljert trinnvis beskrivelse for 1) som danner multicellulære sfæroider av brystkreft, 2) forberede prøver for histologisk farging, og 3) samling av celler for utvinning av RNA, DNA og proteiner. Både den billige hengende dråpemetoden og de dyrere U-bunnplatene brukes til å danne sfæroider. Her er det gitt en protokoll for å forberede (fikse) sfæroider for seksjonering og påfølgende immunostaining med markører for å vurdere celleproliferasjon, apoptose og distribusjon av epitelceller og endotelceller i en sfæroid. I tillegg viser denne protokollen en komplett trinnvis analyse av histologiske data ved hjelp av ImageJ-programvare. Tolkning av biologiske data varierer avhengig av type eksperiment og antistoffene som brukes. Seksjonering av faste sfæroider og etterfølgende farging av seksjonene ble utført av et rutinemessig patologilaboratorium (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Brystkreft er den ledende årsaken til dødelighet hos kvinner. Veksten av brystkreftceller og deres påfølgende metastase er en nøkkelfaktor for progresjonen. Selv om mekanismene for å fremme brystkreftvekst har blitt intensivt studert ved hjelp av monokulturer av brystkreftceller som MCF-7-celler, har bidraget fra andre celletyper, som vaskulære og lymfatiske endotelceller som er intimt involvert i tumorvekst, ikke blitt undersøkt i dybden. Cellecelleinteraksjon spiller en nøkkelrolle i tumorvekst og progresjon. Neoangiogenese, eller utvikling av fartøy, er avgjørende for tumorvekst, mens lymfesystemet fungerer som en portal for kreftcellemigrasjon og påfølgende metastase. Nyere studier gir bevis på at vaskulære og lymfatiske endotelceller kan påvirke kreftcelleveksten betydelig. Disse observasjonene innebærer et behov for å utvikle in vitro-modeller som mer realistisk vil gjenspeile brystkreftvekstprosesser in vivo. Videre krever restriksjoner i dyreforskning utvikling av ex vivo-modeller for å belyse bedre mekanismene som er involvert.
Denne artikkelen beskriver utviklingen av brystkreft sfæroider sammensatt av både brystkreftceller (østrogenreseptor-positive MCF-7 celler) og vaskulære og / eller lymfatiske endotelceller. Protokollen beskriver en detaljert trinnvis tilnærming til å lage tocellede sfæroider ved hjelp av to forskjellige tilnærminger, hengende fall (gullstandard og billig) og 96-brønns U-bunnplater (dyrt). Grundige instruksjoner er gitt for hvordan du delikat kan plukke opp de dannede sfæroidene for å overvåke vekst ved mikroskopisk størrelse og vurdere levedyktighet ved hjelp av død og levende cellefarging. Videre avgrenses prosedyrer for å fikse sfæroidene for seksjonering og farging med vekstspesifikke antistoffer for å skille vekstmønstre i sfæroider. I tillegg er detaljer for å forberede sfæroider med transfekterte celler og metoder for å trekke ut RNA for molekylær analyse gitt. Til slutt gir denne artikkelen grundige instruksjoner for å forberede flercellede sfæroider for brystkreftforskning.

Sfæroidmodellen ved hjelp av epitel- og endotelkulturer er nødvendig for å etterligne in vivo-forhold av brystsvulster for in vitro-eksperimenter. Ordningen i figur 1 skildrer protokollen for å danne sfæroider med brystkreft epitelceller og vaskulære eller lymfatiske endotelceller (figur 1). Hver celletype frøes separat i en 3,5 cm rund tallerken og behandles med vekststimulatorer/-hemmere eller transfektert med oligonukleotider ved hjel...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

Krysstale mellom pattedyr epitelceller og endotelceller bidrar viktig til brystkreftprogresjon, tumorvekst og metastase. I denne studien er sfæroider laget av brystkreftceller sammen med vaskulære og/eller lymfatiske endotelceller og viser deres anvendbarhet som et in vitro-system for brystkreftforskning.

Pattedyr epitel- og endotelcellesfæroider som en potensiell funksjonell in vitro-modell for brystkreftforskning

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Brystkreftcellesfæroidene som er beskrevet her, vil tillate forskere å undersøke molekylære mekanismer for kreftcelle endotelcelleinteraksjoner som er involvert i spredning og metastase av kreftceller. Den største fordelen med denne 3D-modellen er at den gir et mer realistisk cellulært arrangement som forbedrer påliteligheten av slutninger angående patofysiologi og behandling av brystkreft. Å demonstrere prosedyren vil være Giovanna Azzarito, en stipendiat fra laboratoriet mitt.Begynn med å behandle eller transfektere de belagte cellene i 24 timer, eller etter ønske. For å identifisere cellefordeling i sfæroid, vask cellene med en milliliter Hanks'Balansert saltløsning eller HBSS, som inneholder kalsium og magnesium og bli i HUVECer ved hjelp av 0,5 mikrogram per milliliter blått fargestoff. Og MCF-7 celler som bruker 0,5 mikromolargrønn fargestoff fortynnet med hensyn til vekstmedium.Plasser platen i en 37 grader celsius og fem prosent CO2-inkubator i 30 til 40 minutter. Vask cellene med en milliliter HBSS uten kalsium og magnesium. Tilsett deretter en milliliter enzymatisk løsrivelsesmiddel, som er 0,25% trypsin for HUVEC og 0,5% turer i fire MCF-7 til hver brun tallerken ved hjelp av en P1000 pipette.Velg hver celletype separat i et fem milliliter rundbunnspolystyrenrør, og tilsett en milliliter 10% fetal kalveserum eller FCS-medium ved hjelp av en P1000 pipette for å stoppe den enzymatiske reaksjonen. Sentrifuger deretter cellesuspensjonene ved 250 ganger G i fem minutter. Forsiktig aspirere supernatant og suspendere cellene i en milliliter steroidfritt medium.Bruk 100 mikroliter av hver celleoppheng fortynnet med 10 milliliter Diluent 2 for å bestemme det totale cellenummeret. Slå på maskinen og skyll ved å trykke på funksjonen og startknappene, med Fortynningsoppløsning 2 i et celletellerhette hetteglass. Bruk oppsett som fire og trykk på start for å måle det tomme med fersk Fortynningsløsning 2.Bytt scintillation hetteglasset med 100 mikroliter celle suspensjon i 10 milliliter diluent 2 løsning. Bruk set up som fire, og trykk start for å måle prøvene. Legg merke til antall celler per milliliter på det digitale displayet, Forbered deretter fem milliliter av hver cellefjæring og bland dem for å få et sluttvolum på 10 milliliter i et en-til-en-forhold, ved hjelp av manuell gjentatt pipette for å pipette ut 100 mikroliter av celleopphenget i hver brønn av den 96-brønns U-bunnplaten.Plasser platen i en inkubator under standard vevskulturforhold og se etter en sfæroiddannelse etter 48 timer. Ta bilder av disse sfæroidene med 40 X forstørrelse ved hjelp av en fasekontrast eller fluorescens stereomikroskop. For å forberede hengende dråpekultur blander cellesuspensjonene i et en-til-en-forhold for å få et sluttvolum på to milliliter.Bruk en P20 pipette for å se celleblandingen i form av 15 mikroliterdråper på den omvendte ledningen til en 10 centimeter Petri-tallerken. Snu lokket med dråpene og tilsett fem milliliter EBM-2 basemedium på bunnen av parabolen for å unngå fordampning av dråpene. Samle ca 50 sfæroider i et 1,5 milliliterrør med en tarmspiss av en P200 mikroliterpipette.La dem slå seg ned på bunnen av røret med tyngdekraften og kast deretter supernatanten. Fest disse sfæroidene med 500 mikroliter 4% PFA i en time ved romtemperatur. Kok 2%Nobel Algor Solution i PBS ved hjelp av en varm plate med magnetisk røre i tre til fem minutter for å oppløse det augurøse pulveret helt og avkjølt ned til rundt 60 grader Celsius.Fjern PFA med en P1000 pipette, vask disse sfæroidene med 500 mikroliter PBS og la dem sedimentere. Når den er avgjort, kast den supernatante forsiktig pipetten 600 mikroliter Agora-løsningen i 1,5 milliliterrøret med sfæroider og plasser røret umiddelbart i en sentrifuge med en horisontal rotor ved 177 ganger G i to minutter. Tilsett en kort streng midt i Agro Solution for enkelt å fjerne pluggen fra røret.Størk Agros-pluggen på is, eller ved fire grader celsius tilsett 500 mikroliter PBS i 1,5 milliliterrøret for å unngå å tørke ut pelletsen. Skaff bilder av sfæroide seksjoner ved hjelp av et stereomikroskop. Beregn mengden løsning som er nødvendig for å legge til en 10 mikroliter per brønn av en blanding av kalsium Aam og ethidium homodimers fortynnet ved hjelp av EBM-2 i forholdet en til 50.Tilsett fargingsblandingen til sfæroidene og legg platen i inkubatoren under standarden, vevskulturforholdene i 30 til 60 minutter. Hent bilder med 40 X forstørrelse ved hjelp av fluorescens stereomikroskopet. I U-bunnplater ble sfæroidformasjonen observert 48 timer etter sådd av MCF syv celler.Sfæroidenes dannelse ble imidlertid ikke observert i tilfelle endotelceller eller lymfatiske celler. Såing av MCF syv pluss endotelceller eller MCF syv pluss lymfatiske celler ved en-til-en-forhold resulterte også i sfæroiddannelse. Tidsavhengig sekvensiell vekst av MCF syv sfæroid ble registrert fra 24 til 120 timer.Sfæroidenes størrelse økte fra rundt 100 mikrometer til rundt 200 mikrometer over på fem dager. Med en økt vekstrate observert i sfæroidene behandlet med vekststimulatoren. Strukturen av sfæroidene og formen på cellene deres viste ingen abnormiteter etter transfeksjon med kontroll oligonukleotider i nærvær av Lipofectamine.Celler som uttrykker sin proliferative markør Ki-67 ble distribuert homogent i denne sfæroidene. Cleave til caspase tre farging av denne sfæroider viste apatiske celler etter fire dager med kultur. Studier av cellene i denne sfæroiden med CD-31 og Ki-67 viste at 55% av cellene er epiteliale 45% er endoteliale og 25% av cellene sprer seg.For å vurdere prosentandelen levende og døde celler ble fire dager gamle sfæroider farget med kalsium Aam og ethidium-homodimer. En nytenkt sfæroid flekker også for døde og levende celler avslørte at sfæroider er svært følsomme for fryseforhold. Når du følger hans protokoll, sørg for at sunne celler brukes til å blande afrodite En annen ting å huske ville være å unngå å skade disse afrodite under DP-hetten for å få en god seksjon sikrer også å gane afrodite før over polymeriserer.Denne modellen kan forbedres ytterligere ved å inkludere andre celler, for eksempel fibroblaster involvert i tumorprogresjon og bruke den til å vurdere effekten av terapeutiske midler rettet mot en kreftvekst.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Utnytte Funksjonell genom Screening for å identifisere potensielt Novel narkotika mål i Cancer Cell spheroid kulturer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

Kirurgiske prosedyrer og metodikk for en præklinisk murinmodell av<em&gt; De Novo</em&gt; Mammakreft Metastase

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

En Portal Vein Injection modell for å studere levermetastaser fra brystkreft

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

Få kreft stamcellesfærer fra gynekologiske og brystkreft svulster

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

En 3D spheroid modell som en mer fysiologisk system for kreft-Associated fibroblaster differensiering og Invasion in vitro studier

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Studere trippel negativ brystkreft ved hjelp ortotopisk brystkreft modell

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

Rotte mammary epitelcelletransplantasjon i Interscapular Hvit Fett Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Ortotopisk transplantasjon av brystsvulster som prekliniske modeller for brystkreft

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

In Vitro evaluering av onkogen transformasjon i humane pattedyr epitelceller

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

Isolering og funksjonell vurdering av humane brystkreftstamceller fra celle- og vevsprøver

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...