Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Esta pesquisa foi apoiada pela Cancer Research Foundation / Swiss Cancer League grant KFS-4125-02-2017 para rkd e National Institute of Health grant DK079307 to EKJ.

1. Cultura celular
NOTA: Conduzir o manuseio da célula em condições estéreis.
<ol><li>Subcultura de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs)<ol>
<li>Cubra 75 cm2 frascos com colágeno (5 μg/cm2) (rabo-de-rato) durante a noite (ON) à temperatura ambiente (RT) ou 2-3 h a 37 °C, enxágue com água e deixe o frasco secar.</li>
		<li>Crescer HUVECs em meio de crescimento (EBM-2, Endotelial Basal Medium-2) suplementados com glutamina (1x = 2 mM), soluçã...

Em comparação com as culturas celulares 2D, a revolucionária tecnologia de cultura esferoide 3D é uma ferramenta melhor e mais poderosa para reconstruir o microambiente de um órgão, interações células-células e respostas medicamentosas in vitro. Este é o primeiro protocolo que descreve a formação de esferoides a partir de linhas celulares multicelulares (epiteliais e endoteliais) para a pesquisa do câncer de mama. Este protocolo garante o crescimento 3D esferoidal de esferoides por até 5 dias, e o...

O uso de animais para experimentos tem limitações. Estudos em animais não podem imitar com precisão a progressão da doença em humanos, e animais e humanos não têm respostas idênticas a patógenos. Além disso, restrições na experimentação animal devido a preocupações com o sofrimento animal e problemas éticos1,2 cada vez mais restringe programas de pesquisa. In vitro sistemas têm sido amplamente desenvolvidos para contornar o uso de animais; além disso, o uso de células humanas fez in vitro modelos mais relevantes para a investigação fisiofisiológica e terapêutica. Culturas celulares monocamadas convencionais (2D) são amplamente utilizadas porque imitam tecidos humanos até certo ponto. No entanto, as monoculturas 2D não imitam órgãos humanos, e as monoculturas 2D são incapazes de simular o microambiente complexo dos órgãos originais e imitar o in vivo situação3,4,5,6. Além disso, nas culturas de células monocamadas, os tratamentos medicamentosos podem facilmente destruir/danificar todas as células. É importante ressaltar que algumas dessas limitações podem ser superadas mudando para culturas celulares tridimensionais multicamadas (3D)7,8. De fato, modelos de cultura 3D têm sido mostrados para refletir melhor a estrutura celular, layout e função das células nos tecidos primários. Essas culturas 3D podem ser formadas usando uma variedade de linhas celulares, semelhantes a um órgão funcional. Na verdade, existem dois modelos de culturas 3D. Um modelo produz esferoides de células agregadas que formam clusters e as reorganizam em esferas (modelos livres de andaimes). O segundo produz organoides, que possuem uma estrutura mais complexa e consistem em combinações de múltiplas células específicas de órgãos, que são consideradas como uma versão em miniatura de órgãos9,10. Devido a isso, os sistemas de cultura 3D representam uma tecnologia inovadora com muitas aplicações biológicas e clínicas. Assim, esferoides e organoides têm inúmeras aplicações para modelagem de doenças e estudos relacionados à medicina regenerativa, rastreamento de medicamentos e estudos toxicológicos6,11,12,13,14,15. Esferoides cancerígenos, derivados da tecnologia 3D, recriam a morfologia e o fenótipo de tipos celulares relevantes, imitam o in vivo microambiente tumoral, e modelo de comunicações celulares e vias de sinalização que estão operacionais durante o desenvolvimento do tumor16,17,18. Além disso, para melhorar a compreensão da biologia do câncer, os esferoides/organoides tumorais também podem ser usados para identificar uma potencial terapia anticâncer específica do paciente (personalizada) e avaliar sua eficácia, toxicidade e efeitos a longo prazo19,20,21,22. Esferoides abriram oportunidades proeminentes para investigar a fisiopatologia, modelagem de doenças e rastreamento de medicamentos devido à sua capacidade de preservar a arquitetura celular e tridimensional do tecido, a capacidade de imitar o in vivo situação, e as interações célula-célula. No entanto, deve-se também estar atento às limitações desse sistema, como a falta de componente vascular/sistêmico, sistema imunológico funcional ou nervoso, e o sistema representa uma abordagem reducionista em relação aos modelos animais. De fato, ao contrário dos modelos animais, as estruturas 3D fornecem apenas uma aproximação da biologia dentro de um corpo humano. Entender as limitações do método 3D pode ajudar os pesquisadores a projetar processos mais refinados e válidos para a produção de esferoides que melhor representam um órgão em maior escala23,24,25.
O câncer é a principal causa de morte em todo o mundo, e o câncer de mama é o câncer mais comum em mulheres26,27,28. Para imitar o complexo microambiente do câncer de mama, os esferoides do câncer de mama devem ser cultivados usando células que desempenham um papel proeminente nos tumores mamários, ou seja, células epiteliais, células endoteliais, fibroblastos e/ou células imunes. Além disso, para um esferoide representando o câncer de mama, a expressão dos receptores hormonais femininos (receptores de estrogênio/progesterona), a capacidade de conservar o tumor do paciente status histológico e a capacidade de imitar a resposta à terapia também devem ser consideradas. Estudos têm demonstrado que os sistemas de cocultura 3D possuem uma organização celular semelhante à do tecido primário in vivo,têm a capacidade de reagir em tempo real a estímulos, e possuem receptores andrógenos funcionais29,30,31,32. Assim, uma abordagem semelhante poderia ser útil para imitar um tumor de mama in vitro. O objetivo do protocolo atual é estabelecer um novo método de geração de esferoides de câncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 receptores estrógenos positivos (uma linha celular humana imortalizada de células epiteliais) e células endoteliais vasculares (HUVECs) ou células endoteliais linfáticas (HMVEC-DNeo) para criar um modelo que imita ou reflete de perto as interações entre essas células dentro de um tumor. Embora as células MCF-7 (responsivas ao estrogênio) e as células endoteliais tenham sido usadas para desenvolver esferoides no presente estudo, outras células, como os fibroblastos que representam ~80% da massa tumor do mama, também poderiam ser combinadas no futuro para representar e imitar melhor o tumor mamário.
Existem vários métodos para formar esferoides, tais como: 1) o método de gotícula suspensa que emprega a gravidade33,34; 2) o método de levitação magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expostas a um ímã externo35, e 3) o método de microplaca esferoide que é realizado por células semeadas em placas de baixa fixação36,37. Com base nos métodos existentes, que utilizam apenas um tipo de célula, o presente protocolo tem sido otimizado utilizando células epiteliais e endoteliais para melhor imitar as condições de crescimento dos tumores de câncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método pode ser facilmente alcançado em laboratório a um baixo custo e com requisitos mínimos de equipamento. Com base na necessidade/objetivos do laboratório, diferentes abordagens foram utilizadas para formar esferoides e obter material celular relevante a partir desses esferoides. Neste contexto, para análise de DNA, RNA ou proteína, os esferoides 3D são produzidos por células endoteliais e epiteliais com o método de queda suspensa. No entanto, para estudos funcionais, por exemplo, para monitorar o crescimento celular após transfecção de interferência curta (siRNA) e/ou tratamento hormonal, os esferoides são gerados usando placas de fundo U.
O objetivo deste protocolo técnico é fornecer uma descrição detalhada passo a passo para 1) formação de esferoides multicelulares do câncer de mama, 2) preparando amostras para coloração histológica e 3) coleta de células para extração de RNA, DNA e proteínas. Tanto o método de queda de suspensão barato quanto as placas inferiores U mais caras são usadas para formar esferoides. Aqui, é fornecido um protocolo de preparação (fixação) de esferoides para secção e imunostenção subsequente com marcadores para avaliar a proliferação celular, apoptose e distribuição de células epiteliais e endoteliais dentro de um esferoide. Além disso, este protocolo mostra uma análise completa passo a passo dos dados histológicos usando o software ImageJ. A interpretação dos dados biológicos varia dependendo do tipo de experimento e dos anticorpos utilizados. A secção de esferoides fixos e a posterior coloração das seções foram realizadas por um laboratório de patologia de rotina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

O câncer de mama é a principal causa de mortalidade em mulheres. O crescimento das células cancerígenas de mama e sua metástase subsequente é um fator-chave para sua progressão. Embora os mecanismos envolvidos na promoção do crescimento do câncer de mama tenham sido intensamente estudados utilizando monoculturas de células cancerígenas de mama, como as células MCF-7, a contribuição de outros tipos celulares, como células endoteliais vasculares e linfáticas que estão intimamente envolvidas no crescimento do tumor, não tem sido investigada em profundidade. A interação célula-célula desempenha um papel fundamental no crescimento e progressão do tumor. A neoangiogênese, ou o desenvolvimento de vasos, é essencial para o crescimento do tumor, enquanto o sistema linfático serve como um portal para a migração de células cancerígenas e metástase subsequente. Estudos recentes fornecem evidências de que células endoteliais vasculares e linfáticas podem influenciar significativamente o crescimento de células cancerosas. Essas observações implicam a necessidade de desenvolver modelos in vitro que reflitam de forma mais realista os processos de crescimento do câncer de mama in vivo. Além disso, as restrições na pesquisa animal exigem o desenvolvimento de modelos ex vivo para elucidar melhor os mecanismos envolvidos.
Este artigo descreve o desenvolvimento de esferoides de câncer de mama compostos tanto de células cancerígenas de mama (células mcf-7 positivas do receptor de estrogênio) quanto de células endoteliais vasculares e/ou linfáticas. O protocolo descreve uma abordagem detalhada passo a passo na criação de esferoides de células duplas usando duas abordagens diferentes, queda suspensa (padrão ouro e barato) e placas de fundo U de 96 poços (caras). Instruções aprofundadas são fornecidas para como captar delicadamente os esferoides formados para monitorar o crescimento através do dimensionamento microscópico e avaliando a viabilidade usando manchas de células mortas e vivas. Além disso, são delineados procedimentos para fixação dos esferoides para secção e coloração com anticorpos específicos para o crescimento para diferenciar padrões de crescimento em esferoides. Além disso, são fornecidos detalhes para a preparação de esferoides com células transfectadas e métodos para extrair RNA para análise molecular. Em conclusão, este artigo fornece instruções aprofundadas para a preparação de esferoides multicelulares para a pesquisa do câncer de mama.

O modelo de esferoides usando coculturas epiteliais e endoteliais é necessário para imitar de perto as condições in vivo dos tumores mamários para experimentos in vitro. O esquema na Figura 1 retrata o protocolo para formar esferoides com células epiteliais de câncer de mama e células endoteliais vasculares ou linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula é semeada separadamente em um prato redondo de 3,5 cm e tratada com estimuladores/i...

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O crosstalk entre células epiteliais mamárias e células endoteliais contribui importantemente para a progressão do câncer de mama, crescimento do tumor e metástase. Neste estudo, os esferoides foram feitos a partir de células cancerígenas de mama juntamente com células endoteliais vasculares e/ou linfáticas e demonstram sua aplicabilidade como um sistema in vitro para pesquisa de câncer de mama.

Eferóides de células epiteliais e endoteliais como um modelo in vitro potencial funcional para pesquisa de câncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Os esferoides de células cancerígenas de mama descritos aqui permitirão que os pesquisadores investiguem mecanismos moleculares de interações celulares endoteliais de células cancerosas que estão envolvidas na proliferação e metástase das células cancerosas. A principal vantagem deste modelo 3D é que ele fornece um arranjo celular mais realista que melhora a confiabilidade das inferências em relação à fisiopatologia e tratamento do câncer de mama. Demonstrando o procedimento estará Giovanna Azzarito, doutoranda do meu laboratório.Comece tratando ou transfectando as células banhadas por 24 horas, ou conforme desejado. Para identificar a distribuição celular em esferoide, lave as células com um mililitro da Solução de Sal Balanceada da Hanks ou HBSS, contendo cálcio e magnésio e fique em HUVECs usando 0,5 microgramas por corante azul mililitro. E as células MCF-7 usando 0,5 mingau verde micromolar diluído no que diz respeito ao meio de crescimento.Coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de CO2 por 30 a 40 minutos. Lave as células com um mililitro de HBSS sem cálcio e magnésio. Em seguida, adicione um mililitro de re-agente de desprendimento enzimático, que é 0,25% trypsin para HUVEC e 0,5% viagens em quatro MCF-7 para cada prato marrom usando uma pipeta P1000.Eleja cada tipo de célula separadamente em um tubo de poliestireno fundo redondo de cinco mililitros, e adicione um mililitro de soro de bezerro fetal de 10% ou meio FCS usando uma pipeta P1000 para parar a reação enzimática. Em seguida, centrifufique as suspensões celulares a 250 vezes G por cinco minutos. Aspire cuidadosamente o supernatante e suspenda as células em um mililitro de meio livre de esteroides.Use 100 microlitres de cada suspensão celular diluídos com 10 mililitros de Diluent 2 para determinar o número total da célula. Ligue a máquina e lave pressionando a função e inicie os botões, com a solução Diluent 2 em um frasco de contador de células. Use configurado como quatro e pressione comece a medir o branco com nova solução Diluent 2.Altere o frasco de cintilação com 100 microliters de suspensão celular em 10 mililitros da solução Diluent 2. Use configurado como quatro e pressione comece a medir as amostras. Observe o número de células por mililitro no display digital, prepare cinco mililitros de cada suspensão celular e misture-os para obter um volume final de 10 mililitros em uma proporção de um para um, usando pipeta repetindo manual para pipetizar 100 microliters da suspensão celular em cada poço da placa inferior U de 96 poços.Coloque a placa em uma incubadora sob condições padrão de cultura tecidual e verifique se há uma formação de esferoides após 48 horas. Tire fotos deste esferoides a 40 X de ampliação usando um contraste de fase ou microscópio estéreo de fluorescência. Para preparar a cultura de queda de enforcamento misture as suspensões celulares em uma proporção de um para um para obter um volume final de dois mililitros.Use uma pipeta P20 para ver a mistura celular na forma de 15 gotas de microliter no chumbo invertido de uma placa de Petri de 10 centímetros. Inverta a tampa com as gotas e adicione cinco mililitros de meio base EBM-2 na parte inferior do prato para evitar a evaporação das gotas. Colete aproximadamente 50 esferoides em um tubo de 1,5 mililitro com uma ponta intestinal de uma pipeta de microliter P200.Deixe-os se acomodarem na parte inferior do tubo pela gravidade e depois descartem o supernatante. Fixar estes esferoides com 500 microliters de 4%PFA por uma hora em temperatura ambiente. Ferva 2% Nobel Algor Solution na PBS usando uma placa quente com uma mexida magnética por três a cinco minutos para dissolver completamente o pó augurous e resfriado até cerca de 60 graus Celsius.Remova o PFA com uma pipeta P1000, lave este esferoides com 500 microliters de PBS e deixe-os sedimentares. Uma vez instalado descarte o supernatante cuidadosamente pipeta 600 microliters de solução Agora no tubo de 1,5 mililitro com esferoides e coloque o tubo imediatamente em uma centrífuga com um rotor horizontal a 177 vezes G por dois minutos. Adicione uma corda curta no meio da Solução Agro para remover facilmente o plugue do tubo.Solidificar o plugue Agros no gelo, ou a quatro graus Celsius adicionar 500 microliters de PBS no tubo de 1,5 mililitro para evitar secar a pelota. Adquira imagens de seções esferoides usando um microscópio estéreo. Calcule a quantidade de solução necessária para adicionar 10 microliters por poço de uma mistura de aam de cálcio e homodimers de ethidium diluídos usando EBM-2 em uma proporção de um a 50.Adicione a mistura de coloração aos esferoides e coloque a placa na incubadora de acordo com o padrão, as condições de cultura tecidual por 30 a 60 minutos. Adquira imagens a 40 X de ampliação usando o microscópio estéreo de fluorescência. Em placas inferiores U, a formação de esferoides foi observada 48 horas após a semeadura de sete células mcf.No entanto, a formação de eferóides não foi observada no caso de células endoteliais ou células linfáticas. Semear as sete células endoteliais ou mcf sete mais células linfáticas na proporção um para um também resultou na formação de esferoides. O crescimento sequencial dependente do tempo de sete spheroids mcf foi registrado variando de 24 a 120 horas.O tamanho dos esferoides aumentou de cerca de 100 micrômetros para cerca de 200 micrômetros em cinco dias. Com uma taxa de crescimento aumentada observada nos esferoides tratados com o estimulador de crescimento. A estrutura dos esferoides e a forma de suas células não apresentaram anormalidades após a transfecção com oligonucleotídeos de controle na presença de Lipofectamina.As células que expressavam seu marcador proliferativo Ki-67 foram distribuídas de forma homogênea nestes esferoides. Cleave para caspase três manchas deste esferoides mostraram células apáticas após quatro dias de cultura. Estudar as células nestes esferoides com CD-31 e Ki-67 revelou que 55% das células são epiteliais 45% são endoteliais e 25% das células estão proliferando.Para avaliar a porcentagem de células vivas e mortas, os esferoides de quatro dias de idade foram manchados com aam de cálcio e ethidium-homodimer. Um esferoide recém-pensado também mancha para células mortas e vivas revelou que os esferoides são muito sensíveis a condições de congelamento. Ao seguir seu protocolo, certifique-se de que as células saudáveis sejam usadas para misturar afrodite Outra coisa a se lembrar seria evitar danificar essas afrodites durante a tampa dp para obter uma boa seção também garantir o paladar da afrodite antes do polimeriza.Esse modelo poderia ser melhorado ainda mais com a inclusão de outras células, como fibroblastos envolvidos na progressão do tumor e usá-lo para avaliar a eficácia de agentes terapêuticos visando o crescimento do câncer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

Utilizando Genómica Funcional de triagem para identificar alvos de drogas potencialmente romance em Spheroid culturas de células de câncer

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Pesquisa do câncer

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

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Procedimentos cirúrgicos e metodologia para um modelo de murina pré-clínica de<em&gt; De Novo</em&gt; Metástase do câncer mamário

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

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Transplante Ortotópico de Tumores mamários como Modelos Pré-Clínicos para o Câncer de Mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

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Avaliação In Vitro da Transformação Oncogênica em Células Epiteliais Mamárias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...