Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research at JoVE.com

Это исследование было поддержано грантом Фонда исследований рака / Швейцарской онкологической лиги KFS-4125-02-2017 для RKD и грантом Национального института здравоохранения DK079307 для EKJ.

1. Клеточная культура
ПРИМЕЧАНИЕ: Проводить обработку клеток в стерильных условиях.
<ol><li>Субкультура эндотелиальных клеток пупочных вен человека (HUVECs)<ol>
<li>Покрыть 75см2 колбы коллагеном (5 мкг/см2) (крысиный хвост) на ночь (ON) при комнатной температуре (RT) или 2-3 ч при 37 ?...

По сравнению с 2D-клеточными культурами, революционная технология 3D-сфероидных культур является лучшим и более мощным инструментом для реконструкции микросреды органа, клеточных взаимодействий и реакций на лекарства in vitro. Это первый протокол, описывающий образование сфероидов и?...

Использование животных для экспериментов имеет ограничения. Исследования на животных не могут точно имитировать прогрессирование заболевания у людей, а животные и люди не имеют одинаковых реакций на патогены. Кроме того, ограничения в экспериментах на животных из-за опасений по поводу страданий животных и этических проблем1,2 все больше ограничивают исследовательские программы. In vitro системы были широко разработаны для обхода использования животных; более того, использование человеческих клеток сделало in vitro модели, более актуальные для патофизиологического и терапевтического исследования. Обычные монослойные (2D) клеточные культуры широко используются, потому что они в некоторой степени имитируют ткани человека. Однако 2D-монокультуры не могут имитировать человеческие органы, а 2D-монокультуры не могут имитировать сложное микроокружение исходных органов и имитировать in vivo ситуация3,4,5,6. Кроме того, в монослойных клеточных культурах медикаментозное лечение может легко уничтожить / повредить все клетки. Важно отметить, что некоторые из этих ограничений могут быть преодолены путем перехода на многослойные трехмерные (3D) клеточные культуры.7,8. Фактически, было показано, что модели 3D-культур лучше отражают клеточную структуру, расположение и функцию клеток в первичных тканях. Эти 3D-культуры могут быть сформированы с использованием различных клеточных линий, похожих на функциональный орган. Действительно, существует две модели 3D-культур. Одна модель производит сфероиды агрегированных клеток, которые образуют кластеры и реорганизуют их в сферы (модели без каркасов). Второй дает органоиды, которые имеют более сложную структуру и состоят из комбинаций множественных орган-специфических клеток, которые рассматриваются как миниатюрная версия органов.9,10. Благодаря этому системы 3D-культур представляют собой инновационную технологию со многими биологическими и клиническими применениями. Таким образом, сфероиды и органоиды имеют многочисленные применения для моделирования заболеваний и исследований, связанных с регенеративной медициной, скринингом лекарств и токсикологическими исследованиями.6,11,12,13,14,15. Канцерогенные сфероиды, полученные из 3D-технологии, воссоздают морфологию и фенотип соответствующих типов клеток, имитируют in vivo микроокружение опухоли и моделирование клеточных коммуникаций и сигнальных путей, которые функционируют во время развития опухоли16,17,18. Кроме того, чтобы улучшить понимание биологии рака, сфероиды / органоиды опухоли также могут быть использованы для идентификации потенциальной специфической для пациента противораковой терапии (персонализированной) и оценки ее эффективности, токсичности и долгосрочных эффектов.19,20,21,22. Сфероиды открыли выдающиеся возможности для исследования патофизиологии, моделирования заболеваний и скрининга лекарств из-за их способности сохранять клеточную и трехмерную тканевую архитектуру, способности имитировать in vivo ситуация и клеточно-клеточные взаимодействия. Тем не менее, необходимо также знать об ограничениях этой системы, таких как отсутствие сосудистого / системного компонента, функциональной иммунной или нервной системы, и система представляет собой редукционистский подход по сравнению с животными моделями. Действительно, в отличие от животных моделей, 3D-структуры обеспечивают лишь приближение биологии в человеческом теле. Понимание ограничений 3D-метода может помочь исследователям разработать более совершенные и валидные процессы для получения сфероидов, которые лучше представляют орган в большем масштабе.23,24,25.
Рак является основной причиной смерти во всем мире, а рак молочной железы является наиболее распространенным раком у женщин26,27,28лет. Чтобы имитировать сложное микроокружение рака молочной железы, сфероиды рака молочной железы следует культивировать с использованием клеток, которые играют заметную роль в опухолях молочной железы, то есть эпителиальных клеток, эндотелиальных клеток, фибробластов и / или иммунных клеток. Кроме того, для сфероида, представляющего рак молочной железы, также следует учитывать экспрессию рецепторов женских гормонов (рецепторов эстрогена / прогестерона), способность сохранять гистологический статус опухоли пациента и способность имитировать ответ на терапию. Исследования показали, что 3D кокультурные системы имеют клеточную организацию, аналогичную таковой первичной ткани in vivo,обладают способностью реагировать в режиме реального времени на раздражители и имеют функциональные андрогенные рецепторы29,30,31,32. Следовательно, подобный подход может быть полезен для имитации опухоли молочной железы in vitro. Целью текущего протокола является установление нового метода генерации сфероидов рака молочной железы. Этот метод использует эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7 (увековеченная клеточная линия эпителиальных клеток человека) и сосудистые эндотелиальные клетки (HUVECs) или лимфатические эндотелиальные клетки (HMVEC-DNeo) для создания модели, которая имитирует или близко отражает взаимодействия между этими клетками в опухоли. Хотя MCF-7 (эстроген-чувствительные) и эндотелиальные клетки были использованы для разработки сфероидов в настоящем исследовании, другие клетки, такие как фибробласты, которые составляют ~ 80% массы опухоли молочной железы, также могут быть объединены в будущем, чтобы лучше представлять и имитировать опухоль молочной железы.
Существует несколько методов образования сфероидов, таких как: 1) метод висячих капель, который использует гравитацию33,34; 2) метод магнитной левитации, использующий магнитные наночастицы, подвергающиеся воздействию внешнего магнита35,и 3) сфероидный микропластинчатый метод, который выполняется путем посева клеток на пластины с низким креплением36,37. На основе существующих методов, в которых используется только один тип клеток, настоящий протокол был оптимизирован с использованием эпителиальных и эндотелиальных клеток для лучшей имитации условий роста опухолей рака молочной железы in vivo38,39,40,41. Этот метод может быть легко достигнут в лаборатории при низких затратах и с минимальными требованиями к оборудованию. Основываясь на потребностях / целях лаборатории, были использованы различные подходы для формирования сфероидов и получения соответствующего клеточного материала из этих сфероидов. В этом контексте для анализа ДНК, РНК или белка 3D-сфероиды производятся путем совместного культивирования эндотелиальных и эпителиальных клеток методом висячей капли. Однако для функциональных исследований, например, для мониторинга роста клеток после короткой интерферирующей (siRNA) трансфекции и/или гормональной терапии, сфероиды генерируются с использованием U-нижних пластин.
Целью данного технического протокола является предоставление подробного пошагового описания 1) формирования сфероидов многоклеточного типа рака молочной железы, 2) подготовки образцов для гистологического окрашивания и 3) сбора клеток для экстракции РНК, ДНК и белков. Для формирования сфероидов используется как недорогой метод подвесных капель, так и более дорогие U-образные пластины. Здесь представлен протокол подготовки (фиксации) сфероидов к разделению и последующему иммуноокрашиванию маркерами для оценки пролиферации клеток, апоптоза и распределения эпителиальных и эндотелиальных клеток внутри сфероида. Кроме того, этот протокол показывает полный пошаговый анализ гистологических данных с использованием программного обеспечения ImageJ. Интерпретация биологических данных варьируется в зависимости от типа эксперимента и используемых антител. Секционирование фиксированных сфероидов и последующее окрашивание срезов выполнялось обычной лабораторией патологии (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Рак молочной железы является основной причиной смертности у женщин. Рост клеток рака молочной железы и их последующее метастазирование является ключевым фактором его прогрессирования. Хотя механизмы, участвующие в стимулировании роста рака молочной железы, интенсивно изучались с использованием монокультур клеток рака молочной железы, таких как клетки MCF-7, вклад других типов клеток, таких как сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки, которые тесно участвуют в росте опухоли, не был глубоко изучен. Клеточно-клеточное взаимодействие играет ключевую роль в росте и прогрессировании опухоли. Неоангиогенез, или развитие сосудов, необходим для роста опухоли, тогда как лимфатическая система служит порталом для миграции раковых клеток и последующего метастазирования. Недавние исследования свидетельствуют о том, что сосудистые и лимфатические эндотелиальные клетки могут значительно влиять на рост раковых клеток. Эти наблюдения подразумевают необходимость разработки моделей in vitro, которые более реалистично отражали бы процессы роста рака молочной железы in vivo. Кроме того, ограничения в исследованиях на животных требуют разработки моделей ex vivo, чтобы лучше прояснить задействованные механизмы.
В этой статье описывается развитие сфероидов рака молочной железы, состоящих как из клеток рака молочной железы (эстроген-рецептор-положительные клетки MCF-7), так и сосудистых и /или лимфатических эндотелиальных клеток. Протокол описывает подробный пошаговый подход к созданию двухэлементных сфероидов с использованием двух разных подходов: висячие капли (золотой стандарт и дешевизна) и 96-луночные U-образные нижние пластины (дорогие). Приведены подробные инструкции о том, как деликатно подобрать сформированные сфероиды для мониторинга роста путем микроскопических размеров и оценки жизнеспособности с использованием окрашивания мертвых и живых клеток. Кроме того, очерчены процедуры фиксации сфероидов для сечения и окрашивания специфическими для роста антителами для дифференциации паттернов роста в сфероидах. Дополнительно приведены подробности получения сфероидов с трансфектированными клетками и методы извлечения РНК для молекулярного анализа. В заключение, в этой статье приведены подробные инструкции по подготовке многоклеточных сфероидов для исследования рака молочной железы.

Модель сфероидов с использованием эпителиальных и эндотелиальных кокультур необходима для точной имитации in vivo состояний опухолей молочной железы для экспериментов in vitro. Схема на фиг.1 изображает протокол формирования сфероидов с эпителиальными клетками ра...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research (Video) | JoVE

Перекрестные помехи между эпителиальными клетками молочной железы и эндотелиальными клетками в значительной степени способствуют прогрессированию рака молочной железы, росту опухоли и метастазированию. В этом исследовании сфероиды были изготовлены из клеток рака молочной железы вместе с сосудистыми и / или лимфатическими эндотелиальными клетками и демонстрируют их применимость в качестве системы in vitro для исследования рака молочной железы.

Сфероиды эпителиальных и эндотелиальных клеток молочной железы как потенциальная функциональная модель in vitro для исследований рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Сфероиды клеток рака молочной железы, описанные здесь, позволят исследователям исследовать молекулярные механизмы взаимодействия эндотелиальных клеток раковых клеток, которые участвуют в пролиферации и метастазировании раковых клеток. Основным преимуществом этой 3D-модели является то, что она обеспечивает более реалистичное клеточное расположение, что повышает надежность выводов относительно патофизиологии и лечения рака молочной железы. Продемонстрировать процедуру будет Джованна Аззарито, аспирант из моей лаборатории.Начните с обработки или трансфекции позолоченных клеток в течение 24 часов или по желанию. Для выявления клеточного распределения в сфероиде промывайте клетки одним миллилитром раствора сбалансированной соли Хэнкса или HBSS, содержащего кальций и магний, и оставайтесь в HUVECs, используя 0,5 мкг на миллилитр синего красителя. А клетки MCF-7 с помощью 0,5 микромолярного зеленого красителя разбавляют в отношении питательной среды.Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 градусов цельсия и пяти процентов CO2 на 30-40 минут. Промыть клетки одним миллилитром HBSS без кальция и магния. Затем добавляют один миллилитр ферментативного реагента отслоения, который составляет 0,25% трипсина для HUVEC и 0,5% трипов в четырех MCF-7 к каждой коричневой посуде с использованием пипетки P1000.Выберите каждый тип клеток отдельно в пятимиллилитровой полистирольной трубке с круглым дном и добавьте один миллилитр 10% фетальной икроножной сыворотки или среды FCS, используя пипетку P1000, чтобы остановить ферментативную реакцию. Затем центрифугируют клеточные суспензии в 250 раз G в течение пяти минут. Осторожно аспирируйте супернатант и подвешивайте клетки в одном миллилитре свободной от стероидов среде.Используйте 100 микролитров каждой клеточной суспензии, разбавленной 10 миллилитрами разбавителя 2, чтобы определить общее количество клеток. Включите машину и смойте, нажав кнопки функции и запуска, с раствором Разбавителя 2 во флаконе счетчика клеток. Используйте установку как четыре и нажмите start, чтобы измерить заготовку свежим раствором Разбавителя 2.Изменить сцинтилляционный флакон со 100 микролитрами клеточной суспензии на 10 миллилитров раствора разбавителя 2. Используйте настройку как четыре и нажмите кнопку пуск, чтобы измерить образцы. Обратите внимание на количество ячеек на миллилитр на цифровом дисплее, затем подготовьте пять миллилитров каждой клеточной суспензии и перемешайте их, чтобы получить конечный объем 10 миллилитров в соотношении один к одному, используя ручную повторяющуюся пипетку для пипетки из 100 микролитров клеточной суспензии в каждую скважину 96-луночной U-образной нижней пластины.Поместите пластину в инкубатор в стандартных условиях культивирования тканей и проверьте образование сфероидов через 48 часов. Фотографируйте эти сфероиды с увеличением 40 X с помощью фазового контраста или флуоресцентного стереомикроскопа. Для приготовления подвесной капельной культуры смешайте клеточные суспензии в соотношении один к одному, чтобы получить конечный объем в два миллилитра.Используйте пипетку P20, чтобы увидеть клеточную смесь в виде 15 микролитровых капель на перевернутом свинце 10-сантиметровой чашки Петри. Переверните крышку с каплями и добавьте пять миллилитров базовой среды EBM-2 на дно тарелки, чтобы избежать испарения капель. Соберите около 50 сфероидов в трубку объемом 1,5 миллилитра с кишечным наконечником микролитровой пипетки P200.Позвольте им осесть на дно трубки под действием силы тяжести, а затем выбросьте супернатант. Зафиксируйте эти сфероиды с помощью 500 микролитров 4% PFA в течение одного часа при комнатной температуре. Вскипятите 2% раствор Nobel Algor в PBS, используя горячую плиту с магнитным перемешиванием в течение трех-пяти минут, чтобы полностью растворить авгурный порошок и остыть примерно до 60 градусов цельсия.Удалите PFA пипеткой P1000, промыте эти сфероиды 500 микролитрами PBS и дайте им отстояться. После оседания выбросьте супернатант аккуратно пипетку 600 микролитров раствора Agora в 1,5 миллилитровую трубку со сфероидами и поместите трубку сразу в центрифугу с горизонтальным ротором в 177 раз G на две минуты. Добавьте короткую нить в середину раствора Agro, чтобы легко извлечь пробку из трубки.Затвердьте пробку Agros на льду или при четырех градусах Цельсия добавьте 500 микролитров PBS в трубку объемом 1,5 миллилитра, чтобы избежать высыхания гранул. Получение изображений сфероидных участков с помощью стереомикроскопа. Рассчитать количество раствора необходимо для добавления 10 микролитров на лунку смеси гомодимеров кальция Aam и этидия, разбавленных с помощью EBM-2 в соотношении один к 50.Добавьте окрашивающую смесь к сфероидам и поместите пластину в инкубатор по стандарту, в условиях культивирования тканей на 30-60 минут. Получайте снимки с увеличением 40 X с помощью флуоресцентного стереомикроскопа. В U-нижних пластинах образование сфероидов наблюдалось через 48 часов после посева семи клеток MCF.Однако образование сфероидов не наблюдалось в случае эндотелиальных клеток или лимфатических клеток. Посев mcf семь плюс эндотелиальные клетки или MCF семь плюс лимфатические клетки в соотношении один к одному также привел к образованию сфероидов. Зависящий от времени последовательный рост МФУ семи сфероидов был зафиксирован в диапазоне от 24 до 120 часов.Размер сфероидов увеличился с примерно 100 микрометров до примерно 200 микрометров за пять дней. При повышенной скорости роста наблюдается у сфероидов, получавших стимулятор роста. Структура сфероидов и форма их клеток не показали аномалий после трансфекции контрольными олигонуклеотидами в присутствии липофектамина.Клетки, экспрессирующие свой пролиферативный маркер Ki-67, были распределены в этом сфероиде однородно. Расщепление до каспазы трех окрашиваний этого сфероида показало апатичные клетки после четырех дней культивирования. Изучение клеток в этих сфероидах с CD-31 и Ki-67 показало, что 55% клеток являются эпителиальными, 45% являются эндотелиальными и 25% клеток пролиферируют.Для оценки процента живых и мертвых клеток четырехдневные сфероиды окрашивали кальцием Aam и этидием-гомодимером. Недавно разработанный сфероид также окрашивает мертвые и живые клетки, который показал, что сфероиды очень чувствительны к условиям замерзания. Следуя его протоколу, убедитесь, что здоровые клетки используются для смешивания афродит Еще одна вещь, которую следует помнить, - это избегать повреждения этих афродит во время крышки DP, чтобы получить хорошие участки, также гарантирующие вкус афродиты до того, как поперечная полимеризация.Эта модель может быть дополнительно улучшена путем включения других клеток, таких как фибробласты, участвующие в прогрессировании опухоли, и использования ее для оценки эффективности терапевтических агентов, нацеленных на рост рака.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures (Video) | JoVE

Использование функциональной геномики скрининг для выявления потенциально новых целей наркотиком в сфероида культур раковых клеток

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis (Video) | JoVE

Хирургические процедуры и методология для модели доклинической мужи<em&gt; Де Ново</em&gt; Метастазы рака молочной железы

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer (Video) | JoVE

Воротной вены для инъекций модель для изучения печени метастазирования рака молочной железы

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors (Video) | JoVE

Получение Рак стволовых клеток Сферы от гинекологических и опухолей рака молочной железы

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies (Video) | JoVE

3D сфероидная модель как более физиологическая система для рака связанных фибробластов дифференциации и вторжения в vitro исследований

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model (Video) | JoVE

Изучение Тройной отрицательный рак молочной железы Использование ортотопической модели рака молочной железы

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad (Video) | JoVE

Крыса молочной эпителиальной трансплантации клеток в межлопатулярный белый жир Pad

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer (Video) | JoVE

Ортотопическая трансплантация опухолей молочной железы как доклинические модели рака молочной железы

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells (Video) | JoVE

In Vitro Оценка онкогенной трансформации в эпителиальных клетках молочной железы человека

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples (Video) | JoVE

Выделение и функциональная оценка стволовых клеток рака молочной железы человека из образцов клеток и тканей

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...