Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por la subvención KFS-4125-02-2017 de la Fundación para la Investigación del Cáncer / Liga Suiza del Cáncer y la subvención DK079307 del Instituto Nacional de Salud a EKJ.

1. Cultivo celular
NOTA: Realizar el manejo celular en condiciones estériles.
<ol><li>Subcultivo de células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)<ol>
<li>Cubra 75 cm2 matraces con colágeno (5 μg/cm2) (cola de rata) durante la noche (ON) a temperatura ambiente (RT) o 2-3 h a 37 °C, enjuague con agua y deje que el matraz se seque.</li>
		<li>Cultivar HUVEC en medio de crecimiento (EBM-2, Medio Basal Endotelial-2) suplementado con glutamina (1x = 2 mM), so...

En comparación con los cultivos celulares 2D, la revolucionaria tecnología de cultivo de esferoides 3D es una herramienta mejor y más poderosa para reconstruir el microambiente de un órgano, las interacciones célula-célula y las respuestas a los medicamentos in vitro. Este es el primer protocolo que describe la formación de esferoides a partir de líneas celulares multicelulares (epiteliales y endoteliales) para la investigación del cáncer de mama. Este protocolo garantiza el crecimiento esferoidal en 3...

El uso de animales para experimentos tiene limitaciones. Los estudios en animales no pueden imitar con precisión la progresión de la enfermedad en humanos, y los animales y los humanos no tienen respuestas idénticas a los patógenos. Además, las restricciones en la experimentación con animales debido a las preocupaciones por el sufrimiento animal y los problemas éticos1,2 restringen cada vez más los programas de investigación. In vitro se han desarrollado ampliamente sistemas para eludir el uso de animales; además, el uso de células humanas ha hecho in vitro modelos más relevantes para la investigación fisiopatológica y terapéutica. Los cultivos celulares monocapa convencionales (2D) son ampliamente utilizados porque imitan los tejidos humanos hasta cierto punto. Sin embargo, los monocultivos 2D no logran imitar los órganos humanos, y los monocultivos 2D no pueden simular el complejo microambiente de los órganos originales e imitar el in vivo situación3,4,5,6. Además, en cultivos celulares monocapa, los tratamientos farmacológicos podrían destruir / dañar fácilmente todas las células. Es importante destacar que algunas de estas limitaciones se pueden superar cambiando a cultivos celulares tridimensionales (3D) multicapa.7,8. De hecho, se ha demostrado que los modelos de cultivo 3D reflejan mejor la estructura celular, el diseño y la función de las células en los tejidos primarios. Estos cultivos 3D se pueden formar utilizando una variedad de líneas celulares, similares a un órgano funcional. De hecho, hay dos modelos de culturas 3D. Un modelo produce esferoides de células agregadas que forman grupos y los reorganizan en esferas (modelos sin andamios). El segundo produce organoides, que tienen una estructura más compleja y consisten en combinaciones de múltiples células específicas de órganos, que se consideran como una versión en miniatura de los órganos.9,10. Debido a esto, los sistemas de cultivo 3D representan una tecnología innovadora con muchas aplicaciones biológicas y clínicas. Por lo tanto, los esferoides y organoides tienen numerosas aplicaciones para el modelado de enfermedades y estudios relacionados con la medicina regenerativa, la detección de drogas y los estudios toxicológicos.6,11,12,13,14,15. Los esferoides cancerígenos, derivados de la tecnología 3D, recrean la morfología y el fenotipo de los tipos de células relevantes, imitan el in vivo microambiente tumoral y modelar las vías de comunicación y señalización de las células que están operativas durante el desarrollo del tumor16,17,18. Además, para mejorar la comprensión de la biología del cáncer, los esferoides/organoides tumorales también se pueden usar para identificar una posible terapia contra el cáncer específica del paciente (personalizada) y evaluar su eficacia, toxicidad y efectos a largo plazo.19,20,21,22. Los esferoides han abierto oportunidades prominentes para investigar la fisiopatología, el modelado de enfermedades y la detección de fármacos debido a su capacidad para preservar la arquitectura de tejidos celulares y tridimensionales, la capacidad de imitar la in vivo situación, y las interacciones célula-célula. Sin embargo, también se deben ser conscientes de las limitaciones de este sistema, como la falta de componente vascular / sistémico, sistema inmunológico o nervioso funcional, y el sistema representa un enfoque reduccionista en comparación con los modelos animales. De hecho, a diferencia de los modelos animales, las estructuras 3D proporcionan solo una aproximación de la biología dentro de un cuerpo humano. Comprender las limitaciones del método 3D puede ayudar a los investigadores a diseñar procesos más refinados y válidos para producir esferoides que representen mejor un órgano a mayor escala.23,24,25.
El cáncer es la principal causa de muerte en todo el mundo, y el cáncer de mama es el cáncer más común en las mujeres26,27,28. Para imitar el complejo microambiente del cáncer de mama, los esferoides del cáncer de mama deben cultivarse utilizando células que desempeñan un papel destacado en los tumores de mama, es decir, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos y / o células inmunes. Además, para un esferoide que representa el cáncer de mama, también se debe considerar la expresión de los receptores de hormonas femeninas (receptores de estrógeno / progesterona), la capacidad de conservar el estado histológico tumoral del paciente y la capacidad de imitar la respuesta a la terapia. Los estudios han demostrado que los sistemas de cocultivo 3D tienen una organización celular similar a la del tejido primario in vivo,tienen la capacidad de reaccionar en tiempo real a los estímulos y tienen receptores andrógenos funcionales29,30,31,32. Por lo tanto, un enfoque similar podría ser útil para imitar un tumor de mama in vitro. El propósito del protocolo actual es establecer un nuevo método de generación de esferoides de cáncer de mama. Este método utiliza células MCF-7 con receptores de estrógeno positivos (una línea celular humana inmortalizada de células epiteliales) y células endoteliales vasculares (HUVEC) o células endoteliales linfáticas (HMVEC-DNeo) para crear un modelo que imita o refleja de cerca las interacciones entre estas células dentro de un tumor. Aunque MCF-7 (sensible al estrógeno) y las células endoteliales se han utilizado para desarrollar esferoides en el presente estudio, otras células como los fibroblastos que representan ~ 80% de la masa tumoral de mama, también podrían combinarse en el futuro para representar e imitar mejor el tumor de mama.
Existen varios métodos para formar esferoides, tales como: 1) el método de gotas colgantes que emplea la gravedad33,34; 2) el método de levitación magnética que utiliza nanopartículas magnéticas expuestas a un imán externo35,y 3) el método de microplaca esferoide que se realiza mediante la siembra de células en placas de baja unión36,37. Sobre la base de los métodos existentes, que utilizan un solo tipo de célula, el presente protocolo se ha optimizado utilizando células epiteliales y endoteliales para imitar mejor las condiciones de crecimiento de los tumores de cáncer de mama in vivo38,39,40,41. Este método se puede lograr fácilmente en el laboratorio a un bajo costo y con requisitos mínimos de equipo. Sobre la base de la necesidad / objetivos del laboratorio, se utilizaron diferentes enfoques para formar esferoides y obtener material celular relevante a partir de estos esferoides. En este contexto, para el análisis de ADN, ARN o proteínas, los esferoides 3D se producen mediante el cocultivo de células endoteliales y epiteliales con el método de gota colgante. Sin embargo, para estudios funcionales, por ejemplo, para monitorear el crecimiento celular después de una transfección de interferencia corta (siRNA) y / o tratamiento hormonal, los esferoides se generan utilizando placas de fondo en U.
El propósito de este protocolo técnico es proporcionar una descripción detallada paso a paso para 1) la formación de esferoides de tipo multicelular del cáncer de mama, 2) la preparación de muestras para la tinción histológica y 3) la recolección de células para la extracción de ARN, ADN y proteínas. Tanto el método de gota colgante de bajo costo como las placas de fondo en U más caras se utilizan para formar esferoides. Aquí, se proporciona un protocolo para preparar (fijar) esferoides para el seccionamiento y la posterior inmunotinción con marcadores para evaluar la proliferación celular, la apoptosis y la distribución de las células epiteliales y endoteliales dentro de un esferoide. Además, este protocolo muestra un análisis completo paso a paso de los datos histológicos utilizando el software ImageJ. La interpretación de los datos biológicos varía según el tipo de experimento y los anticuerpos utilizados. El seccionamiento de esferoides fijos y la posterior tinción de las secciones fue realizado por un laboratorio de patología de rutina (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

El cáncer de mama es la principal causa de mortalidad en las mujeres. El crecimiento de las células de cáncer de mama y su posterior metástasis es un factor clave para su progresión. Aunque los mecanismos implicados en la promoción del crecimiento del cáncer de mama se han estudiado intensamente utilizando monocultivos de células de cáncer de mama como las células MCF-7, no se ha investigado en profundidad la contribución de otros tipos de células, como las células endoteliales vasculares y linfáticas que están íntimamente implicadas en el crecimiento tumoral. La interacción célula-célula juega un papel clave en el crecimiento y la progresión del tumor. La neoangiogénesis, o el desarrollo de vasos, es esencial para el crecimiento tumoral, mientras que el sistema linfático sirve como un portal para la migración de células cancerosas y la metástasis posterior. Estudios recientes proporcionan evidencia de que las células endoteliales vasculares y linfáticas pueden influir significativamente en el crecimiento de las células cancerosas. Estas observaciones implican la necesidad de desarrollar modelos in vitro que reflejen de manera más realista los procesos de crecimiento del cáncer de mama in vivo. Además, las restricciones en la investigación con animales requieren el desarrollo de modelos ex vivo para dilucidar mejor los mecanismos involucrados.
Este artículo describe el desarrollo de esferoides de cáncer de mama compuestos tanto por células de cáncer de mama (células MCF-7 con receptor de estrógeno positivo) como por células endoteliales vasculares y/o linfáticas. El protocolo describe un enfoque detallado paso a paso en la creación de esferoides de doble celda utilizando dos enfoques diferentes, gota colgante (estándar de oro y barato) y placas de fondo en U de 96 pocillos (caro). Se proporcionan instrucciones detalladas sobre cómo recoger delicadamente los esferoides formados para monitorear el crecimiento mediante el dimensionamiento microscópico y la evaluación de la viabilidad utilizando la tinción de células muertas y vivas. Además, se delinean procedimientos para fijar los esferoides para seccionar y teñir con anticuerpos específicos del crecimiento para diferenciar los patrones de crecimiento en los esferoides. Además, se proporcionan detalles para preparar esferoides con células transfectadas y métodos para extraer ARN para análisis molecular. En conclusión, este artículo proporciona instrucciones detalladas para preparar esferoides multicelulares para la investigación del cáncer de mama.

El modelo de esferoides que utiliza cocultivos epiteliales y endoteliales es necesario para imitar de cerca las condiciones in vivo de los tumores de mama para experimentos in vitro. El esquema de la Figura 1 representa el protocolo para formar esferoides con células epiteliales de cáncer de mama y células endoteliales vasculares o linfáticas(Figura 1). Cada tipo de célula se siembra por separado en un plato redondo de 3,5 cm y se trata co...

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La diafonía entre las células epiteliales mamarias y las células endoteliales contribuye de manera importante a la progresión del cáncer de mama, el crecimiento tumoral y la metástasis. En este estudio, los esferoides se han hecho de células de cáncer de mama junto con células endoteliales vasculares y / o linfáticas y demuestran su aplicabilidad como un sistema in vitro para la investigación del cáncer de mama.

Esferoides epiteliales y endoteliales mamarios como un modelo funcional potencial in vitro para la investigación del cáncer de mama

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Los esferoides de células de cáncer de mama descritos en este documento permitirán a los investigadores investigar los mecanismos moleculares de las interacciones de las células endoteliales de las células cancerosas que están involucradas en la proliferación y metástasis de las células cancerosas. La principal ventaja de este modelo 3D es que proporciona una disposición celular más realista que mejora la fiabilidad de las inferencias con respecto a la fisiopatología y el tratamiento del cáncer de mama. Demostrando el procedimiento estará Giovanna Azzarito, una estudiante de doctorado de mi laboratorio.Comience tratando o transfectando las células chapadas durante 24 horas, o según lo desee. Para identificar la distribución celular en esferoides, lave las células con un mililitro de Hanks'Balanced Salt Solution o HBSS, que contiene calcio y magnesio y permanezca en HUVEC utilizando 0,5 microgramos por mililitro de colorante azul. Y células MCF-7 que utilizan 0,5 colorantes verdes micromolares diluidos en el medio de crecimiento.Coloque la placa en una incubadora de 37 grados Celsius y cinco por ciento de CO2 durante 30 a 40 minutos. Lave las células con un mililitro de HBSS sin calcio y magnesio. Luego agregue un mililitro de reactivo de desprendimiento enzimático, que es 0.25% tripsina para HUVEC y 0.5% viajes en cuatro MCF-7 a cada plato marrón usando una pipeta P1000.Elija cada tipo de célula por separado en un tubo de poliestireno inferior redondo de cinco mililitros y agregue un mililitro de suero fetal de pantorrilla al 10% o medio FCS utilizando una pipeta P1000 para detener la reacción enzimática. Luego centrifugue las suspensiones celulares a 250 veces G durante cinco minutos. Aspire cuidadosamente el sobrenadante y suspenda las células en un mililitro de medio libre de esteroides.Utilice 100 microlitros de cada suspensión celular diluida con 10 mililitros de diluyente 2 para determinar el número total de células. Encienda la máquina y enjuague presionando los botones de función e inicio, con la solución diluyente 2 en un vial de contador celular. Use la configuración como cuatro y presione start para medir el espacio en blanco con una solución fresca de Diluent 2.Cambie el vial de centelleo con 100 microlitros de suspensión celular en 10 mililitros de solución de Diluent 2. Utilice configurar como cuatro y pulse start para medir las muestras. Anote el número de celdas por mililitro en la pantalla digital, luego prepare cinco mililitros de cada suspensión celular y mézclelos para obtener un volumen final de 10 mililitros en una proporción de uno a uno, utilizando pipeta de repetición manual para pipetear 100 microlitros de la suspensión celular en cada pozo de la placa de fondo en U de 96 pocillos.Coloque la placa en una incubadora en condiciones estándar de cultivo de tejidos y verifique si hay una formación de esferoides después de 48 horas. Tome fotografías de estos esferoides a un aumento de 40 X utilizando un microscopio estéreo de contraste de fase o fluorescencia. Para preparar el cultivo de gota colgante mezclar las suspensiones celulares en una proporción de uno a uno para obtener un volumen final de dos mililitros.Use una pipeta P20 para ver la mezcla celular en forma de gotas de 15 microlitros en el cable invertido de una placa de Petri de 10 centímetros. Invierta la tapa con las gotas y agregue cinco mililitros de medio base EBM-2 en la parte inferior del plato para evitar la evaporación de las gotas. Recolecte aproximadamente 50 esferoides en un tubo de 1.5 mililitros con la punta intestinal de una pipeta de microlitro P200.Deje que se asienten en el fondo del tubo por gravedad y luego deseche el sobrenadante. Arregle estos esferoides con 500 microlitros de 4% PFA durante una hora a temperatura ambiente. Hervir la solución de Nobel Algor al 2% en PBS usando una placa caliente con un revuelo magnético durante tres a cinco minutos para disolver el polvo auguroso por completo y enfriarlo a unos 60 grados centígrados.Retire el PFA con una pipeta P1000, lave estos esferoides con 500 microlitros de PBS y deje que se sedimenten. Una vez asentado, deseche el sobrenadante, pipete cuidadosamente 600 microlitros de solución de ágora en el tubo de 1,5 mililitros con esferoides y coloque el tubo inmediatamente en una centrífuga con un rotor horizontal a 177 veces G durante dos minutos. Agregue una cuerda corta en el medio de la Solución Agro para quitar fácilmente el tapón del tubo.Solidifique el tapón Agros sobre hielo, o a cuatro grados Celsius agregue 500 microlitros de PBS en el tubo de 1.5 mililitros para evitar que se seque el pellet. Adquirir imágenes de secciones esferoides usando un microscopio estereoscópico. Calcule la cantidad de solución necesaria para agregar 10 microlitros por pocillo de una mezcla de alam de calcio y homodímeros de etidio diluidos usando EBM-2 en una proporción de uno a 50.Agregue la mezcla de tinción a los esferoides y coloque la placa en la incubadora bajo el estándar, las condiciones de cultivo de tejidos durante 30 a 60 minutos. Adquiera imágenes con un aumento de 40 X utilizando el microscopio estereoscópico de fluorescencia. En las placas del fondo en U se observó la formación de esferoides 48 horas después de la siembra de siete células MCF.Sin embargo, la formación de esferoides no se observó en el caso de las células endoteliales o linfáticas. La siembra del MCF siete más células endoteliales o MCF siete más células linfáticas en una proporción de uno a uno también resultó en la formación de esferoides. Se registró un crecimiento secuencial dependiente del tiempo del esferoide MCF siete que osciló entre 24 y 120 horas.El tamaño de los esferoides aumentó de alrededor de 100 micrómetros a alrededor de 200 micrómetros durante cinco días. Con una mayor tasa de crecimiento observada en los esferoides tratados con el estimulador del crecimiento. La estructura de los esferoides y la forma de sus células no mostraron anomalías después de la transfección con oligonucleótidos de control en presencia de lipofectamina.Las células que expresan su marcador proliferativo Ki-67 se distribuyeron homogéneamente en estos esferoides. Escindido a caspasa tres tinciones de estos esferoides mostraron células apáticas después de cuatro días de cultivo. El estudio de las células en estos esferoides con CD-31 y Ki-67 reveló que el 55% de las células son epiteliales, el 45% son endoteliales y el 25% de las células están proliferando.Para evaluar el porcentaje de células vivas y muertas, los esferoides de cuatro días de edad se tiñeron con calcio Aam y etidio-homodímero. Un esferoide recién pensado también tinción de células muertas y vivas reveló que los esferoides son muy sensibles a las condiciones de congelación. Al seguir su protocolo, asegúrese de que se utilicen células sanas para mezclar afrodita Otra cosa a recordar sería evitar dañar estas afroditas durante la tapa DP para obtener una buena sección también asegurante para paladar la afrodita antes de que el across polimerize.Este modelo podría mejorarse aún más mediante la inclusión de otras células, como los fibroblastos involucrados en la progresión del tumor y su uso para evaluar la eficacia de los agentes terapéuticos dirigidos a un crecimiento del cáncer.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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Trasplante de células epiteliales de rata mamaria en la almohadilla de grasa blanca interescapular

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Trasplante ortotópico de tumores de mama como modelos preclínicos para el cáncer de mama

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

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Evaluación In Vitro de la Transformación Oncogénica en Células Epiteliales Mamarias Humanas

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

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Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...