Name: mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research
Uploaded: 2021-07-12T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Bu araştırma Kanser Araştırma Vakfı / İsviçre Kanser Ligi hibesi KFS-4125-02-2017 RKD ve Ulusal Sağlık Enstitüsü tarafından EKJ'ye DK079307 hibesi ile desteklenmiştir.

1. Hücre kültürü
NOT: Steril koşullar altında hücre kullanımı gerçekleştirin.
<ol><li>İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC' ler) alt kültürü<ol>
<li>75 cm2 şişeyi kollajen (5 μg/cm2)(sıçan kuyruğu) ile gece boyunca (AÇIK) oda sıcaklığında (RT) veya 37 °C'de 2-3 saat kaplayın, suyla durulayın ve şişenin kurumasını bekleyin.</li>
		<li>Glutamin (1x = 2 mM), antibiyotik-antimikotik çözelti (AA; 100 μg/mL streptomisin) ile deste...

2D hücre kültürleri ile karşılaştırıldığında, devrimci 3D küresel kültür teknolojisi, bir organın mikroçevresini, hücre-hücre etkileşimlerini ve ilaç yanıtlarını in vitroolarak yeniden oluşturmak için daha iyi ve daha güçlü bir araçtır. Bu, meme kanseri araştırmaları için çok hücreli (epitel ve endotel) hücre çizgilerinden sferoid oluşumunu tanımlayan ilk protokoldür. Bu protokol, sferoidlerin 5 güne kadar küresel 3D büyümesini sağlar ve parafin gömme, bölümleme v...

Hayvanların deneyler için kullanılmasının sınırlamaları vardır. Hayvan çalışmaları insanlarda hastalığın ilerlemesini doğru bir şekilde taklit edemez ve hayvanlar ve insanlar patojenlere aynı yanıtlara sahip değildir. Ayrıca, hayvan acılarına ve etik sorunlara yönelik endişeler nedeniyle hayvan deneylerindeki kısıtlamalar1,2 araştırma programlarını giderek kısıtlar. In vitro hayvanların kullanımını atlatmak için yaygın olarak geliştirilmiştir; ayrıca, insan hücrelerinin kullanımı in vitro patofizyolojik ve terapötik araştırma için daha uygun modeller. Konvansiyonel monolayer (2D) hücre kültürleri, insan dokularını bir dereceye kadar taklit ettikleri için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, 2B monokültürler insan organlarını taklit edemez ve 2B monokültürler orijinal organların karmaşık mikroçevresini simüle edemez ve in vivo durum3,4,5,6. Ek olarak, monolayer hücre kültürlerinde, ilaç tedavileri tüm hücreleri kolayca yok edebilir / zarar verebilir. Daha da önemlisi, bu sınırlamaların bazıları çok katmanlı üç boyutlu (3D) hücre kültürlerine geçerek aşılabilir7,8. Aslında, 3D kültür modellerinin birincil dokulardaki hücrelerin hücresel yapısını, düzenini ve işlevini daha iyi yansıttığı gösterilmiştir. Bu 3D kültürler, işlevsel bir organa benzer şekilde çeşitli hücre çizgileri kullanılarak oluşturulabilir. Gerçekten de, 3D kültürlerin iki modeli vardır. Bir model, kümeler oluşturan ve bunları kürelere (iskelesiz modeller) yeniden düzenlenen agrega hücrelerin küresellerini üretir. İkincisi, daha karmaşık bir yapıya sahip olan ve organların minyatür bir versiyonu olarak kabul edilen birden fazla organa özgü hücrenin kombinasyonlarından oluşan organoidleri verir.9,10. Bu nedenle, 3D kültür sistemleri birçok biyolojik ve klinik uygulama ile yenilikçi bir teknolojiyi temsil eder. Bu nedenle, sferoidler ve organoidler rejeneratif tıp, ilaç taraması ve toksikolojik çalışmalarla ilgili hastalık modelleme ve çalışmaları için çok sayıda uygulamaya sahiptir.6,11,12,13,14,15. 3D teknolojisinden türetilen kanserojen küreseller, ilgili hücre tiplerinin morfolojisini ve fenotipini yeniden oluşturmak, in vivo tümör mikroçevrİmİ ve tümör gelişimi sırasında çalışır durumda olan model hücre iletişimi ve sinyal yolları16,17,18. Ek olarak, kanser biyolojisi anlayışını geliştirmek için tümör sferoidleri/organoidleri, potansiyel bir hastaya özgü kanser önleyici tedaviyi (kişiselleştirilmiş) tanımlamak ve etkinliğini, toksisitesini ve uzun vadeli etkilerini değerlendirmek için de kullanılabilir.19,20,21,22. Küreseller, hücresel ve üç boyutlu doku mimarisini koruma yetenekleri, in vivo durumu ve hücre-hücre etkileşimleri. Bununla birlikte, damar / sistemik bileşen eksikliği, fonksiyonel bağışıklık veya sinir sistemi gibi bu sistemin sınırlamalarının da farkında olmak gerekir ve sistem hayvan modellerine kıyasla indirgemeci bir yaklaşımı temsil eder. Gerçekten de, hayvan modellerinin aksine, 3D yapılar bir insan vücudundaki biyolojinin sadece bir yaklaşıkını sağlar. 3D yönteminin sınırlamalarını anlamak, araştırmacıların bir organı daha büyük ölçekte daha iyi temsil eden küreseller üretmek için daha rafine ve geçerli süreçler tasarlamalarına yardımcı olabilir23,24,25.
Kanser dünya çapında önde gelen ölüm nedenidir ve meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir26,27,28. Meme kanserinin karmaşık mikroçevresini taklit etmek için meme kanseri sferoidleri meme tümörlerinde, yani epitel hücrelerinde, endotel hücrelerinde, fibroblastlarda ve/veya bağışıklık hücrelerinde önemli rol oynayan hücreler kullanılarak kültürlenmelidir. Ayrıca, meme kanserini temsil eden bir sferoid için, kadın hormon reseptörlerinin (östrojen/ progesteron reseptörleri), hasta tümör histolojik durumunu koruma yeteneği ve tedaviye yanıtı taklit etme yeteneği de göz önünde bulundurulmalıdır. Çalışmalar, 3D ortak kültür sistemlerinin birincil doku in vivo'nunkinebenzer bir hücresel kuruluşa sahip olduğunu, uyaranlara gerçek zamanlı tepki verme yeteneğine sahip olduğunu ve fonksiyonel androjen reseptörlerine sahip olduğunu göstermiştir29,30,31,32. Bu nedenle, benzer bir yaklaşım bir meme tümörü in vitrotaklit yararlı olabilir. Mevcut protokolün amacı meme kanseri sferoidleri üretmek için yeni bir yöntem oluşturmaktır. Bu yöntem, bir tümör içindeki bu hücreler arasındaki etkileşimleri taklit eden veya yakından yansıtan bir model oluşturmak için östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücrelerini (epitel hücrelerinin ölümsüzleştirilmiş bir insan hücresi hattı) ve vasküler endotel hücrelerini (HUVEC'ler) veya lenfatik endotel hücrelerini (HMVEC-DNeo) kullanır. McF-7 (östrojene duyarlı) ve endotel hücreleri bu çalışmada sferoid geliştirmek için kullanılmış olsa da, meme tümörü kitlesinin ~%80'ini temsil eden fibroblastlar gibi diğer hücreler de gelecekte meme tümörünü daha iyi temsil etmek ve taklit etmek için birleştirilebilir.
Sferoid oluşturmak için aşağıdakiler gibi çeşitli yöntemler vardır: 1) yerçekimini kullanan asılı damlacık yöntemi33,34; 2) harici bir mıknatısa maruz kalan manyetik nanopartikülleri kullanan manyetik kaldırma yöntemi35ve 3) düşük ekli plakalarda tohumlama hücreleri tarafından gerçekleştirilen küresel mikro plaka yöntemi36,37. Sadece bir hücre tipi kullanan mevcut yöntemlere dayanarak, mevcut protokol, memekanseri tümörlerinin büyüme koşullarını daha iyi taklit etmek için epitel ve endotel hücreleri kullanılarak optimize edilmiştir38,39,40,41. Bu yöntem laboratuvarda düşük maliyetle ve minimum ekipman gereksinimi ile kolayca elde edilebilir. Laboratuvarın ihtiyacına/hedeflerine göre, sferoid oluşturmak ve bu sferoidlerden ilgili hücresel materyali kazanmak için farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Bu bağlamda, DNA, RNA veya protein analizi için, 3D sferoidler, sarkan damla yöntemi ile endotel ve epitel hücrelerinin birlikte kült ederek üretilir. Bununla birlikte, fonksiyonel çalışmalar için, örneğin, kısa müdahale (siRNA) transfeksiyon ve / veya hormon tedavisinden sonra hücre büyümesini izlemek için, küreseller U-alt plakaları kullanılarak üretilir.
Bu teknik protokolün amacı, 1) meme kanseri çok hücreli tip sferoidlerin oluşturulması, 2) histolojik lekelenme için örneklerin hazırlanması ve 3) RNA, DNA ve proteinlerin çıkarılması için hücrelerin toplanması için ayrıntılı bir adım adım açıklama sağlamaktır. Hem ucuz asma bırakma yöntemi hem de daha pahalı U-alt plakalar sferoid oluşturmak için kullanılır. Burada, hücre çoğalmasını, apoptoz ve epitel ve endotel hücrelerinin bir küresel hücre içinde dağılımını değerlendirmek için sferoidlerin kesit ve sonraki immünostaining için hazırlanması (sabitlenerek) için bir protokol sağlanmaktadır. Ayrıca, bu protokol ImageJ yazılımını kullanarak histolojik verilerin tam bir adım adım analizini gösterir. Biyolojik verilerin yorumlanması, deneyin türüne ve kullanılan antikorlara bağlı olarak değişir. Sabit sferoidlerin bölümlenerek yapılması ve daha sonra bölümlerin boyanma işlemi rutin bir patoloji laboratuvarı tarafından gerçekleştirildi (Sophistolab: info@sophistolab.ch)

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100 mm &#215; 20 mm tissue-culture treated culture dishes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 x 10 mm Tissue Culture Dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Serological Pipet, Polystyrene, Individually Packed, Sterile</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>357543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Version: 13.0.1 (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic Antimycotic Solution (100&#215;)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A5955</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17783</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD31 (cluster of differentiation 31)</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>131M-95</td>
			<td>monoclonal mouse ab clone JC70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CellTracker Green CMFDA (5-chloromethylfluorescein diacetate)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CK8/18 (cytokeratins 8 and 18)</td>
			<td>DBS</td>
			<td>Mob189-05</td>
			<td>monoclonal mouse ab, clone 5D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CKX41 Inverted Microscope</td>
			<td>Olympus Life Science</td>
			<td></td>
			<td>Olympus DP27 digital camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cleaved Caspase 3</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9661L</td>
			<td>polyclonal rabbit ab</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen (rat tail)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11 179 179 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter ISOTON II Diluent</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>844 80 11</td>
			<td>Diluent II</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coulter Z1, Cell Counter</td>
			<td>Coulter Electronics, Luton, UK</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dehydrated Culture Media: Noble Agar</td>
			<td>BD Difco</td>
			<td>BD 214220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EBM-2 Endothelial Cell Growth Basal Medium-2</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>190860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium homodimer</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>46043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum (FCS)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH30070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum Charcoal Stripped (FCS sf)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>SH3006803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX Supplement (100x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HUVEC &#8211; Human Umbilical Vein Endothelial Cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-2517</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>National Institute of Health, USA</td>
			<td></td>
			<td>Wayne Rasband 
			Version: 1.52a (64-bit)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ki67</td>
			<td>Cell Marque</td>
			<td>275R-16</td>
			<td>monoclonal rabbit ab, clone SP6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Histocore Multicut Rotary Microtome</td>
			<td></td>
			<td>149MULTI0C1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Serum Growth Supplement Kit (LSGS Kit)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>S003K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 cells &#8211; human breast adenocarcinoma cell line</td>
			<td>Clinic for Gynecology, University Hospital Zurich</td>
			<td></td>
			<td>Provived from Dr Andr&#232; Fedier obtained from ATCC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunclon Sphera 96U-well plate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>174925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate-buffered saline (PBS) 1x</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>23225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lysis Buffer</td>
			<td>Cell Signaling, Danvers, USA</td>
			<td>9803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-RNA Miniprep Kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1055</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA Lysis Buffer</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>R1060-1-100</td>
			<td>Contents in Quick-RNA Miniprep Kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotina 46R Centrifuge</td>
			<td>Hettich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Round-Bottom Polystyrene Tubes, 5 mL</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Bandelin electronics, Berlin, DE</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tecan Infinite series M200 microplate reader</td>
			<td>Tecan, Salzburg, AU</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Culture Flasks 75</td>
			<td>TPP</td>
			<td>90076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3924</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammary epithelial and endothelial cell spheroids as a potential functional in vitro model for breast cancer research

Meme kanseri kadınlarda mortalitenin önde gelen nedenidir. Meme kanseri hücrelerinin büyümesi ve sonraki metastazları ilerlemesi için önemli bir faktördür. McF-7 hücreleri gibi meme kanseri hücrelerinin monokültürleri kullanılarak meme kanseri büyümesini teşvik eden mekanizmalar yoğun bir şekilde çalışılmış olsa da tümör büyümesinde yakından yer alan damar ve lenfatik endotel hücreleri gibi diğer hücre tiplerinin katkısı derinlemesine araştırılmamıştır. Hücre-hücre etkileşimi tümör büyümesinde ve ilerlemesinde kilit rol oynar. Neoangiogenez veya damarların gelişimi tümör büyümesi için gereklidir, lenfatik sistem ise kanser hücre göçü ve sonraki metastaz için bir portal görevi görür. Son çalışmalar, vasküler ve lenfatik endotel hücrelerinin kanser hücre büyümesini önemli ölçüde etkileyebileceğine dair kanıtlar sürmektedir. Bu gözlemler, meme kanseri büyüme süreçlerini daha gerçekçi bir şekilde yansıtacak in vitro modeller geliştirmeye ihtiyaç olduğunu ima ediyor vivo. Ayrıca, hayvan araştırmalarındaki kısıtlamalar, ilgili mekanizmaları daha iyi aydınlatmak için ex vivo modellerinin geliştirilmesini gerektirir.
Bu makalede hem meme kanseri hücrelerinden (östrojen reseptörü pozitif MCF-7 hücreleri) hem de vasküler ve/veya lenfatik endotel hücrelerinden oluşan meme kanseri sferoidlerinin gelişimi açıklanmaktadır. Protokol, asılı damla (altın standart ve ucuz) ve 96 kuyulu U-alt plakalar (pahalı) olmak üzere iki farklı yaklaşım kullanarak çift hücreli küreseller oluşturmada ayrıntılı bir adım adım yaklaşımı açıklar. Mikroskobik boyutlandırma ve ölü ve canlı hücre boyama kullanarak canlılığı değerlendirerek büyümeyi izlemek için oluşturulan küresellerin hassas bir şekilde nasıl toplanacağınız için derinlemesine talimatlar sağlanmıştır. Ayrıca, sferoidlerdeki büyüme modellerini ayırt etmek için büyümeye özgü antikorlarla kesitleme ve boyama için küreseloidleri düzeltme prosedürleri deliner. Ek olarak, transfected hücreli sferoidlerin hazırlanmasına yönelik ayrıntılar ve moleküler analiz için RNA çıkarma yöntemleri sağlanmaktadır. Sonuç olarak, bu makale meme kanseri araştırmaları için çok hücreli sferoidler hazırlamak için derinlemesine talimatlar sunmaktadır.

Epitel ve endotel ko-kültürlerini kullanan küresel modeller, in vitro deneyler için meme tümörlerinin in vivo durumlarını yakından taklit etmek için gereklidir. Şekil 1'deki şema, meme kanseri epitel hücreleri ve vasküler veya lenfatik endotel hücreleri ile küreseller oluşturma protokolünü tasvir eder (Şekil 1). Her hücre tipi ayrı ayrı 3,5 cm yuvarlak bir tabakta tohumlanır ve büyüme uyarıcıları / inhibitörleri il...

Watch this Scientific Journal Video about Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video at JoVE.com

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research Video (Video) | JoVE

Meme epitel hücreleri ve endotel hücreleri arasındaki çapraz konuşma, meme kanserinin ilerlemesine, tümör büyümesine ve metastaz yapmasına önemli ölçüde katkıda bulunur. Bu çalışmada meme kanseri hücrelerinden vasküler ve/veya lenfatik endotel hücreleri ile birlikte sferoidler yapılmış ve meme kanseri araştırmaları için in vitro sistem olarak uygulanabilirliklerini ortaya koymaktadır.

Meme Kanseri Araştırmaları için Potansiyel Fonksiyonel In vitro Model Olarak Meme Epitel ve Endotel Hücre Sferoidleri

Breast cancer is the leading cause of mortality in women. The growth of breast cancer cells and their subsequent metastasis is a key factor for its ...

Burada açıklanan meme kanseri hücre sferoidleri, araştırmacıların kanser hücrelerinin çoğalması ve metastazında yer alan kanser hücresi endotel hücre etkileşimlerinin moleküler mekanizmalarını araştırmalarına izin verecektir. Bu 3D modelin temel avantajı, meme kanserinin patofizyolojisi ve tedavisi ile ilgili çıkarımların güvenilirliğini artıran daha gerçekçi bir hücresel düzenleme sağlamasıdır. Prosedürü gösteren Giovanna Azzarito, laboratuvarımdan bir doktora öğrencisi.Kaplamalı hücreleri 24 saat boyunca veya istenildiği gibi tedavi ederek veya transfecting yaparak başlayın. Küresel hücre dağılımını tanımlamak için, hücreleri kalsiyum ve magnezyum içeren bir mililitre Hanks'Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS ile yıkayın ve mililitre mavi boya başına 0,5 mikrogram kullanarak HUVEC'lerde kalın. Ve MCF-7 hücreleri 0.5 mikromoler yeşil boya kullanarak büyüme ortamı açısından seyreltilmiş.Plakayı 30 ila 40 dakika boyunca 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2 inkübatöre yerleştirin. Hücreleri kalsiyum ve magnezyum olmadan bir mililitre HBSS ile yıkayın. Daha sonra huvec için% 0.25 trypsin ve dört MCF-7'de% 0.5 trips olan bir mililitre enzimatik müfreze re-agent ekleyin P1000 pipet kullanarak her kahverengi yemeğe.Her hücre tipini beş mililitre yuvarlak alt polistiren tüpte ayrı ayrı seçin ve enmatik reaksiyonu durdurmak için bir P1000 pipet kullanarak bir mililitre% 10 Fetal Baldır Serumu veya FCS ortamı ekleyin. Daha sonra hücre süspansiyonlarını beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüjleyin. Dikkatlice süpernatant aspirat ve steroid ücretsiz ortam bir mililitre hücreleri askıya.Toplam hücre sayısını belirlemek için 10 mililitre Seyreltici 2 ile seyreltilmiş her hücre süspansiyonunun 100 mikrolitresini kullanın. Makineyi açın ve işleve ve başlatma düğmelerini basarak, hücre sayacı şişesinde Seyreltici 2 çözeltisi ile yıkayın. Dört olarak ayarlayın ve boşluğu taze Seyreltici 2 çözeltisi ile ölçmek için başlayın.10 mililitre Diluent 2 çözeltisinde 100 mikrolitre hücre süspansiyonu ile scintillation şişesini değiştirin. Dört olarak ayarlayın ve örnekleri ölçmek için başla tuşuna basın. Dijital ekranda mililitre başına hücre sayısına dikkat edin, ardından her hücre süspansiyonunun beş mililitresini hazırlayın ve 96 kuyulu U-alt plakanın her kuyusuna 100 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetlamak için manuel tekrarlayan pipet kullanarak bire bir oranda 10 mililitrelik son bir hacim elde etmek için karıştırın.Plakayı standart doku kültürü koşullarında bir inkübatöre yerleştirin ve 48 saat sonra küresel bir oluşum olup olmadığını kontrol edin. Faz kontrastı veya floresan stereo mikroskop kullanarak 40 X büyütmede bu küresellerin fotoğraflarını çekin. Asılı bırakma kültürünü hazırlamak için hücre süspansiyonlarını bire bir oranında karıştırarak iki mililitrelik son bir hacim elde edin.Hücre karışımını 10 santimetrelik Petri kabının ters kurşununda 15 mikroliter damla şeklinde görmek için bir P20 pipet kullanın. Damlalarla kapağı ters çevirin ve damlaların buharlaşmasını önlemek için kabın altına beş mililitre EBM-2 baz orta ekleyin. P200 mikrolitre pipet ucu ile 1,5 mililitrelik bir tüpte yaklaşık 50 küresel toplayın.Yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmelerine izin verin ve ardından süpernatant atın. Bu küreselleri oda sıcaklığında bir saat boyunca% 4 PFA'nın 500 mikrolitresi ile sabitlayın. 2% Nobel Algor Çözeltisini PBS'de, uğursuz tozu tamamen çözmek ve 60 santigrat dereceye kadar soğutmak için üç ila beş dakika boyunca manyetik bir karıştırma ile sıcak bir plaka kullanarak kaynatın.PFA'yı bir P1000 pipetle çıkarın, bu küreselleri 500 mikrolitre PBS ile yıkayın ve tortulanmalarını bırakın. Yerleştikten sonra, süpernatant pipeti 600 mikrolitre Agora çözeltisini sferoidli 1,5 mililitrelik tüpe atın ve tüpü hemen iki dakika boyunca 177 kez G'de yatay rotorlu bir santrifüje yerleştirin. Fişi tüpten kolayca çıkarmak için Agro Çözümünün ortasına kısa bir dize ekleyin.Agros fişini buzda katılaştırın veya dört santigrat derecede peletin kurumasını önlemek için 1,5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre PBS ekleyin. Stereo mikroskop kullanarak küresel bölümlerin görüntülerini alın. EBM-2 kullanılarak seyreltilmiş kalsiyum Aam ve ethidyum homodimer karışımının kuyusu başına 10 mikrolitre eklemek için gerekli çözelti miktarını bir ila 50 oranında hesaplayın.Boyama karışımını küresellere ekleyin ve plakayı standart, doku kültürü koşulları altında 30 ila 60 dakika boyunca inkübatöre yerleştirin. Floresan stereo mikroskobu kullanarak 40 X büyütmede resimler elde edin. U-alt plakalarda, MCF yedi hücrenin tohumlanmadan 48 saat sonra küresel oluşum gözlendi.Ancak endotel hücreleri veya lenfatik hücreler söz konusu olduğunda sferoid oluşumu gözlenmedi. MCF yedi artı endotel hücrelerinin veya MCF yedi artı lenfatik hücrelerin bire bir oranında tohumlenmesi de küresel oluşumla sonuçlandı. MCF yedi küreselinin zamana bağlı ardışık büyümesi 24 ila 120 saat arasında kaydedildi.Küresel boyut beş gün içinde yaklaşık 100 mikrometreden yaklaşık 200 mikrometreye yükseldi. Büyüme uyarıcısı ile tedavi edilen küresellerde artan bir büyüme oranı gözlenir. Sferoidlerin yapısı ve hücrelerinin şekli Lipofectamin varlığında kontrol oligonükleotidleri ile transfeksiyondan sonra herhangi bir anormallik göstermedi.Proliferatif belirteçleri Ki-67'yi ifade eden hücreler bu küresellerde homojen olarak dağıtıldı. Cleave to caspase bu sferoidlerin üç lekesi dört günlük kültürden sonra kayıtsız hücreler gösterdi. Cd-31 ve Ki-67 ile bu sferoidlerdeki hücrelerin incelenmesi, hücrelerin%55'inin epitel% 45'inin endotel olduğunu ve hücrelerin% 25'inin çoğaldığını ortaya koydu.Canlı ve ölü hücrelerin yüzdesini değerlendirmek için dört günlük küreseller kalsiyum Aam ve ethidyum-homodimer ile boyandı. Yeni düşünülmüş bir küresel de ölü ve canlı hücreler için leke, küresellerin donma koşullarına karşı çok hassas olduğunu ortaya koydu. Protokolünü takip ederken, sağlıklı hücrelerin afrodit karıştırmak için kullanıldığından emin olun Hatırlanması gereken bir diğer şey, dp kapağı sırasında bu afroditlere zarar vermekten kaçınmak ve aynı zamanda iyi bir bölüm elde etmek için afroditlerin polimerizelerden önce damak yapmasını sağlamak olacaktır.Bu model, tümör ilerlemesine katılan fibroblastlar gibi diğer hücreler dahil edilerek ve kanser büyümesini hedefleyen terapötik ajanların etkinliğini değerlendirmek için kullanılarak daha da geliştirilebilir.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Mammary Epithelial and Endothelial Cell Spheroids as a Potential Functional In vitro Model for Breast Cancer Research

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures

Utilizing Functional Genomics Screening to Identify Potentially Novel Drug Targets in Cancer Cell Spheroid Cultures Video (Video) | JoVE

İşlevsel Genomik Tarama kullanılması Kanser Hücre Sfero Kültürleri Potansiyel Yeni İlaç Hedefleri Belirlemek İçin

The identification of functional driver events in cancer is central to furthering our understanding of cancer biology and indispensable for the discovery ...

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis

Surgical Procedures and Methodology for a Preclinical Murine Model of De Novo Mammary Cancer Metastasis Video (Video) | JoVE

Klinik Öncesi Bir Murin Modeli İçin Cerrahi Prosedürler ve Metodoloji<emDe Novo</emMeme Kanseri Metastazı

A rate-limiting aspect of transgenic mouse models of mammary adenocarcinoma is that primary tumor burden in mammary tissue typically defines study ...

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Bir Portal Ven Enjeksiyon Modeli Karaciğer Metastazı Meme Kanseri Eğitim için

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors Video (Video) | JoVE

Jinekolojik ve Meme Kanseri Tümörlerinden Kanser Kök Hücre Kürelerinin Alınması

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies Video (Video) | JoVE

Kanser Ilişkili fibroblastlar farklılaşma ve Invazyon In vitro etütler için daha fizyolojik bir sistem olarak bir 3D Küroid modeli

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model

Studying Triple Negative Breast Cancer Using Orthotopic Breast Cancer Model Video (Video) | JoVE

Ortotopik Meme Kanseri Modeli Kullanarak Üçlü Negatif Meme Kanseri Eğitimi

Triple-negative breast cancer (TNBC) is an aggressive breast cancer subtype with limited therapeutic options. When compared to patients with less ...

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad

Rat Mammary Epithelial Cell Transplantation into the Interscapular White Fat Pad Video (Video) | JoVE

Interscapular Beyaz Yağ Ped içine Rat Mammary Epitel Hücre Nakli

As early as the 1970s, researchers have successfully transplanted mammary epithelial cells into the interscapular white fat pad of rats. Grafting mammary ...

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer

Orthotopic Transplantation of Breast Tumors as Preclinical Models for Breast Cancer Video (Video) | JoVE

Meme Kanseri için Preklinik Modeller Olarak Meme Tümörlerinin Ortopedik Transplantasyonu

Preclinical models that faithfully recapitulate tumor heterogeneity and therapeutic response are critical for translational breast cancer research. ...

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells

In Vitro Evaluation of Oncogenic Transformation in Human Mammary Epithelial Cells Video (Video) | JoVE

İnsan Meme Epitel Hücrelerinde Onkojenik Dönüşümün İn Vitro Değerlendirilmesi

Tumorigenesis is a multi-step process in which cells acquire capabilities&#160;that allow their growth, survival, and dissemination under hostile ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples Video (Video) | JoVE

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...