Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

نشكر كاري هوبرت وستايسي هوبرت على خبرتهما ومساعدتهما فيما يتعلق بتكهن القناة الصفراوية وضيافتهما المختبرية. نشكر أيضا ناديا شولتز وشارلوت ل. ماتسون لمساعدتهما في قنية الصفراوية المشتركة.
نشكر وكالات المنح التالية على دعمها:
للعمل في مختبر ERA: معهد كارولينسكا (2-560/2015-280)، ستوكهولم لانس لاندستينغ (CIMED (2-538/2014-29))، راجنر سو 6- مؤسسة stiftelse (منحة البداية للمؤسسات السويدية)، والرابطة الأوروبية لدراسة الكبد (جائزة دانيال ألاغيل)، والمؤسسة السويدية للقلب والرئة (20170723)، وفيتينسكابسراديت (2019-01350).
للعمل في مختبر JK: نحن نعترف CzechNanoLab البنية التحتية للبحوث بدعم من MEYS CR (LM2018110). ج. ك. بفضل دعم منحة FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

يتم تمويل مشروع منفصل في مختبر ERA من قبل ModeRNA. لم يكن ل ModeRNA أي دور في المشروع / البروتوكول الموصوف هنا.

تحدد عدة خطوات هامة نجاح DUCT، بدءا من إعداد العينة إلى معلمات جهاز CT. لتحقيق أفضل النتائج، يجب استخدام الراتنج المتناقض جيدا والمحقن جيدا والخالي من الفقاعات للسماح للمعالجة الرقمية المباشرة مع العتبة التلقائية للحصول على البيانات والصور والأفلام ثلاثية الأبعاد. مع التدريب واتباع هذا البروتوكول، 90٪ من الحقن ناجحة وتؤدي إلى بيانات قابلة للاستنساخ. من المهم استخدام الراتنج الأصفر الطازج لتحقيق أفضل تباين بين النظامين المحقونين. الراتنج الأصفر لديه تعتيم إشعاعي قوي جدا، في حين أن الراتنج الأزرق لديه تعتيم إشعاعي لا يمكن اكتشافه. يتم تحقيق أفضل النتائج خلال الأشهر الثلاثة الأولى بعد فتح زجاجة راتنج صفراء جديدة. مع مرور الوقت، والراتنج يعجل، وبعد تخزين أطول (>6 أشهر)، والراتنجات الأصفر والأخضر لم يعد يمكن تمييزها في الأشعة المقطعية. وتستلزم الصور ذات التباين الضعيف التتبع اليدوي الشامل والمستهلك للوقت وتجزئة النظامين. بعد ذلك ، لا غنى عن الأنابيب الممتدة جيدا لتناسب القناة الصفراوية الشائعة للفئران البالغة والقناة الصفراوية الشائعة وعروق البوابة للفئران بعد الولادة. يجب إنشاء نقطة الدخول للحقن بعناية. إذا تم قطع القناة الصفراوية الشائعة بشكل عرضي ، فمن المرجح أن تنفصل عن الأنسجة المحيطة ، مما يمنع الدخول الناجح للأنابيب. هذه الخطوة حساسة بشكل خاص للفئران بعد الولادة التي تتراجع فيها القناة الصفراوية الشائعة و "تجعيد الشعر" إذا انفصلت عن الأنسجة المحيطة بها ، مما يجعل إدخال الأنابيب صعبا للغاية. قد يتطلب دخول القناة الصفراوية الشائعة وحقنها بعض الممارسة. أثناء إعداد الأنابيب مع الراتنج وطوال الحقن ، وتجنب تشكيل فقاعة كما فقاعات خلق مساحة سلبية في الصور CT وتتطلب تصحيح يدوي تستغرق وقتا طويلا. من المهم تدليك الكبد بلطف عن طريق التدحرج على سطحه بمسحة قطنية مبللة أثناء وبعد إجراء الحقن لأن هذا يسهل حتى انتشار الراتنج. بعد الانتهاء من حقن وإزالة الأنابيب ، يجب تشديد عقدة خياطة الحرير بسرعة وبعناية ، لذلك لا يتدفق الراتنج من الكبد قبل أن يبوليمر تماما. من أجل التصوير الناجح بالأشعة المقطعية الدقيقة، يجب إصلاح العينة بشكل صحيح في مكانها مع الآغاروز وتكييفها حراريا للقضاء على القطع الأثرية للحركة في بيانات CT. وتكاد تكون إعدادات الاقتناء ذات أهمية رئيسية، وينبغي تحسينها إلى أقصى حد للوصول إلى دقة مكانية كافية لحل الهياكل الدقيقة.
يمكن إجراء تعديلات تقنية على إجراء الحقن لتحقيق الحقن في الفئران الأصغر سنا. حاليا، يتم تقييد الصب الراتنج من كبد الماوس الأصغر سنا من خلال توافر أنابيب رقيقة بما فيه الكفاية، مع PE10 كونها أصغر الأنابيب المتاحة تجاريا. Tanimizu وآخرون حقن بنجاح حبر الكربون في اليوم الجنيني 17 (E17) القناة الصفراوية المشتركة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية11. ولذلك فإن الاختبار المستقبلي لما إذا كان يمكن توصيل الراتنج عن طريق الشعيرات الدموية الزجاجية سيكون ذا أهمية. تم تكييف DUCT كذلك لحقن الأنظمة الأنبوبية الأخرى مثل الشعب الهوائية ورئة الشريان الوعائي للرئتين9. ويمكن أيضا تعديل حقن الراتنج المزدوج لاستخدامه مع راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو يمكن استخدام هذا البروتوكول للحقن بحبر الكربون.
أحد العوامل الرئيسية المقيدة لخط أنابيب DUCT هو لزوجة الراتنج. DUCT يمكن أن تستخدم فقط لصب الراتنج من الهياكل أنبوبي فوق قطر 5 ميكرومتر. في مجموعة البيانات هذه، يمكن للراتنج اختراق أنابيب ذات قطر أصغر يبلغ 5 ميكرومتر9. هذا الحد من الحجم يحول دون تحليل القناة الدقيقة والشعيرات الدموية الصغيرة. ولمواصلة دفع خط أنابيب DUCT إلى سفن أصغر حجما، ينبغي اختبار راتنجات أخرى متاحة تجاريا، أو قد يؤدي تطوير عوامل جديدة منخفضة اللزوجة للرواية الراديوية إلى تحسين اختراق التجويف.
في Hankeova et al.9 ، تمت مقارنة DUCT بتقنيات أخرى شائعة الاستخدام ، حقن حبر الكربون المزدوج تليها إزالة الأنسجة والتصوير القياسي ، و iDISCO + مع تلطيخ الأوعية الدموية مع خلايا العضلات ألفا الملساء أكتين والقنوات الصفراوية مع cytokeratin 7 ، تليها التصوير ثلاثي الأبعاد9. تفوقت DUCT على الطريقتين الأخريين من حيث التحليل المزدوج (الذي كان تحديا ل iDISCO + بسبب ارتفاع نسبة التفلور الذاتي للكبد) والتصوير ثلاثي الأبعاد والتحديد الكمي (غير ممكن مع حقن حبر الكربون) والتجويف (توفر DUCT بيانات لبنية التجويف الداخلية وتشويش النظام). كما ذكر أعلاه، فإن القيد الرئيسي ل DUCT هو الحد الأدنى لحجم التجويف الذي يمكن حقنه وتحليله (حد 5 ميكرومتر)، وهي معلمة كان فيها أداء كل من حقن حبر الكربون وiDISCO+ أفضل. قناة متفوقة على نظام واحد الصب الراتنج3،5،6 لأنه يسمح تحليل كل نظام حقن على حدة، ويسهل أيضا التحقيق 3D مزدوجة لدراسة العلاقة المعمارية بين النظامين.
يمكن تطبيق DUCT لدراسة أي شبكتين أنبوبيتين في 3D. كدليل على المبدأ ، تم استخدام DUCT لتصور نظم الكبد الصفراوية والوريد البوابي وشرايين الشريان الرئوي والشعب الهوائية في lung9. تتطور القنوات الصفراوية داخل الرحم بجوار الوريد البوابي ، ويوفر وريد البوابة قالبا هيكليا ومركز إشارات ينظم نمو وتمايز الشجرة الصفراوية12. في هانكوفا وآخرون.9، استكشف DUCT التجديد الصفراوي في نموذج فأر لمرض الأطفال البشري متلازمة ألاجيل. كشفت DUCT عن آليات معمارية لم يتم الإبلاغ عنها من قبل أن النظام الصفراوي يستخدم لتحقيق حجم يشبه النوع البري9. استخدمت فئران متلازمة ألاجيل استراتيجيتين مختلفتين: (1) في المناطق الهلالية والوسطى من الكبد ، زاد النظام الصفراوي من تفريعه ، و (2) في محيط الكبد ، كانت القنوات الصفراوية التي تم إنشاؤها بواسطة دي نوفو ملتوية للغاية. هذان العاملان معا لتسفر عن حجم نظام الصفراوية شبه العادية، على الرغم من الهندسة المعمارية غير طبيعية. وعلاوة على ذلك، اكتشفت DUCT تفريع القناة الصفراوية غير الطبيعية التي حدثت بشكل مستقل عن تفريع الوريد البوابي والقنوات الصفراوية التي تشكل الجسور بين اثنين من الأوردة البوابة9. هذه الأنماط الظاهرية سيكون من المستحيل الكشف عنها في الصب الراتنج واحد ويمكن أن يساء تفسيرها في أقسام الهسولوجية 2D وانتشار القناة الصفراوية. وبالتالي توفر DUCT بيانات تصف البنية ثلاثية الأبعاد لشبكتين أنبوبيتين على مستوى الجهاز أو الفص بأكمله مع إمكانية التحليل الكمي النوعي والمتعمق. يمكن أن تكون DUCT معيارا جديدا لتطوير الكبد بعد الولادة وتحليلات تجديد الكبد في نماذج حيوانية مختلفة.

صب راتنج الجهاز هو تقنية يعود تاريخها إلى القرن السابع عشر1. تم إجراء أحد الأمثلة الأولى على صب الراتنج الحديث على الكبد البشري من تشريح الجثة. امتلأت القنوات الصفراوية داخل الدماغ بعامل تباين ممزوج بالجيلاتين، يليه التصوير بالأشعة المقطعية بالأشعة السينية 2. والهدف من تقنية DUCT هو تصور ورقمنة وتحليل شبكتين أنبوبيتين من الراتنج المصبوب ، جنبا إلى جنب ، في 3D.
ويستند DUCT على المعرفة القائمة واسعة من الصب راتنج الكبد نظام واحد3,4,5,6,7,8 ويمتد إلى التصور 3D في وقت واحد وتحليل نظامين9. قناة متقدمة الصب راتنج واحد لمضاعفة الصب الراتنج عن طريق خلط اثنين من راتنجات الراديوباك من تباين مختلف وحقن هذه الراتنجات في شبكتين مختلفتين، وتحديدا القناة الصفراوية المشتركة والوريد البوابة. يمكن تطبيق DUCT على الفئران الصغيرة بعد الولادة مع نتائج قابلة للاستنساخ في وقت مبكر من يوم ما بعد الولادة 15 (P15). بالمقارنة مع تقنيات التصوير المستندة إلى المجهر ، فإن الميزة الرئيسية هي أن DUCT أسرع وخالية من الأجسام المضادة ، ولا تتداخل الفلورة الذاتية لأنسجة الكبد مع التصوير. علاوة على ذلك ، توفر DUCT بيانات كمية تصف حالة التجويف والقطر الداخلي واتصال الشبكة والتشويش. التمييز بين وجود الخلايا تشكيل التجويف ومورفوجينيس بحكم الأمر الواقع في أنابيب أمر ضروري لتحليل الأعضاء التي الخلايا اللاصقة موجودة ولكن لا تشكل أنابيب، كما يمكن أن يكون الحال في متلازمة ألاجيل10. العيب الرئيسي من DUCT هو اختراق محدود من الراتنج، وهو لزج ولا يدخل أنابيب مع عيار صغير (<5 ميكرومتر). يمكن تطبيق DUCT على أي هيكل أنبوبي بعد تحديد نقطة دخول الحقن ، مثل الأنظمة الدموية الشريانية والنووية ، أو الشعب الهوائية ، أو القناة الصفراوية خارج الهيباتية ، أو الأوعية اللمفاوية. وبالتالي يمكن أن تسهل تحليل بنية الجهاز كله من الأنسجة الأخرى مثل الرئتين والبنكرياس.
يمكن معالجة الصور المجزأة MicroCT باستخدام برامج التصوير المتاحة تجاريا ، مثل ImageJ ، أو خطوط الأنابيب المكتوبة خصيصا (على سبيل المثال ، MATLAB). يمكن تحليل الكبد الذي يتم حقنه بالراتنج نوعيا لتوسيع الشبكة والاتصال بها أو كميا لحجم نظام واحد وطوله وتفريعاه وتوركتوسيتيه والتفاعل بين نظامين مثل المسافة بين نظامين أو تبعية نقطة الفرع (هل يتفرع النظام 1 بالقرب من النظام 2 المتفرع؟). خط أنابيب DUCT يشمل حقن الراتنج، ومسح microCT، وتجزئة بيانات CT، جنبا إلى جنب مع تحليل كمي مفصل للآليات المعمارية من نظامين أنبوبي، يمكن أن توفر معيارا لتحليل الكبد كله في النماذج الحيوانية.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

الكبد هو أكبر عضو داخلي في البشر والفئران ، وارتفاع السيارات الفلورسينس يمثل تحديا كبيرا لتقييم الهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد (3D) للجهاز على مستوى الجهاز كله. تتميز بنية الكبد بهياكل متفرعة متعددة ، والتي يمكن ملؤها بالراتنج ، بما في ذلك الأشجار الوعائية والبيليارية ، مما يؤسس لنمط نمطي للغاية في parenchyma الغنية بالخلايا الكبدية. يصف هذا البروتوكول خط أنابيب لإجراء التصوير المقطعي الدقيق للراتنج المزدوج، أو "DUCT". DUCT ينطوي على حقن الوريد البوابة والقناة الصفراوية المشتركة مع اثنين من الراتنجات الاصطناعية المشعة المختلفة، تليها تثبيت الأنسجة. مراقبة الجودة عن طريق إزالة فص واحد، أو الكبد بأكمله، مع عامل المقاصة البصرية، يسمح للفحص المسبق للعينات حقن مناسب. في الجزء الثاني من خط أنابيب DUCT ، يمكن استخدام الفص أو الكبد بأكمله لمسح التصوير المقطعي المصغر (microCT) ، (شبه) التقسيم الآلي ، وتقديم ثلاثي الأبعاد للشبكات الوريدية والقبيلية للبوابة. ينتج عن MicroCT بيانات تنسيق ثلاثية الأبعاد للراتنجين تسمح بإجراء تحليل نوعي وكمي للنظم وعلاقتهما المكانية. يمكن تطبيق DUCT على كبد الفأر بعد الولادة والبالغين ويمكن توسيعه إلى شبكات أنبوبية أخرى ، على سبيل المثال ، شبكات الأوعية الدموية والخطوط الجوية في الرئتين.

Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

الراتنج المزدوج الصب التصوير المقطعي المصغر، أو DUCT، تمكن التصور والرقمنة، وتجزئة نظامين أنبوبي في وقت واحد لتسهيل تحليل 3D من بنية الجهاز. DUCT يجمع بين حقن الجسم الحي السابق من اثنين من راتنجات المشعة تليها المسح المقطعي المحوسبة الدقيقة وتجزئة البيانات الطبوغرافية.

DUCT: الصب الراتنج المزدوج تليها التصوير المقطعي المحوسبة الدقيقة لتحليل الكبد 3D

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

تسمح لنا هذه الطريقة بتحليل تصور وقياس بنية أنظمة الأوعية الدموية والبيليارية في الكبد ثلاثي الأبعاد. يمكننا الآن فهم أفضل للجوانب المكانية لأمراض الكبد والتجديد. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أنها لا تعتمد على وجود أجسام مضادة أو تصوير مضان.كما يسمح بالتصور المباشر للشبكات التي يتم تجويفها بشكل صحيح. هذه الطريقة مناسبة لتحليل الأنظمة الأنبوبية ، وبالتالي فإن أبحاث الأوعية الدموية والقنوات الصفراوية والشعب الهوائية هي مناطق مثالية. استخدمنا DUCT لفهم التغيرات الهيكلية المتعلقة بالتجديد الصفراوي.قبل حقن الراتنج في النظام الصفراوي للفأر ، ابدأ في تحريك الأمعاء والبنكرياس إلى الجانب الأيسر من الماوس ، باستخدام مسحة قطنية مبللة ب PBS لفضح القناة الصفراوية الشائعة وعروق البوابة. ثم جعل شق عرضية صغيرة في الوريد الأجوف أدنى. الوجه الجانب البطني من الكبد نحو القلب لفضح السطح الحشوي ومنطقة مرح، وتحديد موقع القناة الصفراوية المشتركة التي تمتد من منطقة مرح عبر البنكرياس، وإلى الأمعاء في العضلة العاصرة من أودي.استخدم ملقط مستقيم لمسح منطقة الأنسجة المحيطة بها من حوالي خمسة ملليمترات من القناة الصفراوية المشتركة. ثم، عن طريق وضع خيط خياطة الحرير تحت القناة الصفراوية المشتركة، ربط عقدة فضفاضة فوق حول القناة الصفراوية المشتركة. عقد مقص الربيع شقة ضد القناة الصفراوية المشتركة لجعل شق مائل إلى القناة الصفراوية المشتركة في المكان الذي تدخل القناة الصفراوية المشتركة البنكرياس والأمعاء بجوار العضلة العاصرة من أودي.بعد ذلك، اخلطي ملليلتر واحد من الراتنج الأصفر مع 50 ميكرولتر من عامل المعالجة MV، واملأ حقنة لوير ملليلتر واحدة بخليط عامل معالجة الراتنج. ربط حقنة مليئة مع مجموعة أنابيب واحدة، واضغط على المكبس لملء الأنابيب حتى خليط وكيل علاج الراتنج يقطر من غيض من الأنابيب. استخدم ملقط لتقويم المنطقة المحيطة بشق القناة الصفراوية المشتركة.قبل إدخال الأنابيب في الفتحة في القناة الصفراوية المشتركة مع أطول حافة من طرف مشطوف إلى أسفل نحو الجانب الظهري من القناة الصفراوية. ثم تشديد عقدة الخيط الحرير لتأمين الأنابيب داخل القناة الصفراوية المشتركة. بعد حقن الراتنج في القناة الصفراوية المشتركة ، لاحظ المرارة فصوص الكبد الفردية.تدليك الكبد مع مسحة القطن PBS الرطب للمساعدة في نشر الراتنج على قدم المساواة. سوف تكون فروع محطة القنوات الصفراوية المملوءة بالراتنج مرئية بشكل ضعيف على سطح الكبد. توقف عن حقن الراتنج عندما تظهر نقاط الراتنج على سطح الكبد أو عندما يتم الوفاء بالمقاومة.ثم إزالة الأنابيب عن طريق الانسحاب من القناة الصفراوية المشتركة وتشديد بسرعة عقدة الحرير باستخدام ملقط لمنع الراتنج من التسرب. قطع نهايات فضفاضة من خياطة الحرير، حتى أنها لا تتداخل مع حقن الوريد البوابة. قبل حقن الراتنج في الوريد المدخلي، قم بمسح الوريد البوابي من الأنسجة المحيطة به حوالي سنتيمترين من دخوله إلى الكبد، باستخدام ملقط مستقيم.ثم ضع الخيط خياطة الحرير تحت منطقة تطهير الوريد البوابة لربط عقدة فضفاضة overhand. في الوريد المدخلي البعيدة إلى الكبد، وجعل شق طولي قبل ربط العقدة. بعد ذلك، قم بإعداد خليط عامل معالجة الراتنج الأخضر في الحقنة وملء الأنابيب بالخليط كما هو موضح سابقا.استخدم ملقط لتقويم الوريد المدخلي عن طريق سحب الأنسجة المحيطة نحو جانب الذيل قبل إدخال الأنابيب بأطول حافة من الطرف المفلح نحو الجانب الظهري للوعاء. شد الخيط الحريري لتأمين الأنابيب في الوريد المدخل. بعد حقن الراتنج في الوريد البوابة، ومراقبة الأوعية الدموية ملء مع الراتنج، وتدليك الكبد مع مسحة القطن PBS الرطب للمساعدة في نشر الراتنج.عندما يتم تعبئة جميع الأوعية الدموية، وسحب الأنابيب من الوريد البوابة، وتشديد بسرعة عقدة الحرير باستخدام ملقط لمنع الراتنج من التسرب. بالنسبة للتصوير المقطعي المحوسب الدقيق أو مسح MicroCT للكبد المفرغ من الماوس ، ضع فص الكبد الوسطي الأيمن في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر ، وملء الأنبوب بهلام agarose بنسبة 1٪ إلى ما يقرب من ثلث الحجم الإجمالي للأنبوب لتقليل حركة العينة غير المرغوب فيها أثناء قياس MicroCT. قم بتركيب الأنبوب المخروطي 15 ملليلتر مع العينة في مرحلة الدوران لجهاز CT.السماح للأنبوب بالتكيف حراريا مع غرفة القياس لمدة ساعة واحدة على الأقل. عندما يتم تكييفها حراريا العينة، مركز في مجال الرؤية أو FOV، ثم تحسين العينة المصدر ومسافات كاشف العينة، أو SSD وSDD للوصول إلى دقة voxel كافية. بمجرد تعيين المعلمات، ابدأ قياس CT.استخدم برنامج مخصص لإعادة البناء المقطعي لإعادة بناء بيانات التصوير المقطعي. لتحليل بيانات CT تحميل الملفات عن طريق تحديد الملف والاستيراد والأمر. استخدم وظيفة تحديد السطح على اللوحة العلوية لتقسيم الراتنج في البيانات باستخدام العتبات العالمية.في إطار الحوار، حدد قيمة العتبة مع تقييم الرسم البياني عن طريق تعيين موضع خط النظائر الأحمر لتقسيم السفن المملوءة بالراتنج فقط. على اللوحة اليسرى، حدد الوحدة النمطية إنشاء عائد الاستثمار من حجم أو CAD أو شبكة لإنشاء منطقة اهتمام أو عائد الاستثمار من السفن المليئة الراتنج. في إطار الحوار، استخدم الخيار إنشاء ROIs من الصلبة لتحديد وتأكيد اسم وحدة التخزين المعالجة.القضاء على تجزئة خاطئة من مجموعات الضوضاء في المنطقة الخلفية من هذا العائد على الاستثمار. ضع علامة على عائد الاستثمار على اللوحة اليمنى بالنقر بزر الماوس الأيمن وتحديد عائد الاستثمار المقسم للوحدة النمطية. في إطار الحوار، قم بتعيين المعلمة voxel الحد الأدنى لحجم لاستبعاد جميع جزيئات الضوضاء.قيمة المعلمة هي التجربة والبيانات التابعة، والأمثل لكل عينة لتحليلها. على اللوحة اليسرى استخدام وحدة تنعيم لخلق سلس ومستمر وصلب أقنعة القناة دون التحف، مثل وجود فقاعات الهواء أو تسرب الراتنج في تكلفة الراتنج عائد الاستثمار. إنشاء عائد استثمار منفصل كما هو موضح من قبل للنظام مليئة الراتنج أكثر absorptive مثل الراتنج الأصفر المستخدمة لحقن القناة الصفراوية المشتركة مع قيم كثافة أعلى في البيانات CT.علامة والراتنج قناع عائد الاستثمار الجديد عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن قبل تحديد طرح ROIs، ومن ثم طرح عائد الاستثمار الجديد من ROI قناع الراتنج لإنشاء عائد استثمار جديد للنظام أنبوبي المتبقية. تصدير ROIs الناتجة عن كلا النظامين أنبوبي في أشكال مختلفة استنادا إلى المراجع المشغل للمعالجة اللاحقة في برامج مختلفة. مزيد من معالجة ROIs الناتجة في برنامج رسومات وحدة التخزين لتصدير التصور النهائي في شكل صورة أو فيديو.في هذه الدراسة، تم تحقيق حقنة ناجحة مزدوجة الراتنج مع القنوات الصفراوية داخل الهيباتية مملوءة جيدا، وبوابة الوريد الأوعية الدموية. يوضح التحليل التمثيلي نتيجة البيانات المجزأة من كبد تم حقنه جيدا لفأر P15 ، وفأر بالغ حيث يكون الراتنج مرئيا في الفروع الجانبية. في المثال النموذجي للحقن غير الناجح ، أدى الضرر البدني للكبد أثناء العملية الجراحية إلى تسرب الراتنج.أيضا تصلب سابق لأوانه من الراتنج في الإبرة أو غيض من الأنابيب قبل الحقن، وعدم كفاية التشوه عبر القلب تسبب النظام تحت ملء. ويمكن تصحيح التسرب الطفيف للراتنج يدويا أثناء تجزئة بيانات MicroCT. يمكن أن يؤدي ارتفاع ضغط الحقن إلى تمزق الأوعية أو القنوات ، وإلحاق ضرر لا رجعة فيه ببنية الأوعية أو القناة.بالإضافة إلى ذلك ، كانت الفقاعات قطعة أثرية حقن شائعة جدا أخرى أدت إلى ملء متناثرة من الشبكات الأنبوبية. عند استخدام الراتنج الطازج، لوحظ اختلاف واضح في التباين بين القنوات الصفراء التي تحقن بالراتنج والأوردة البوابية الخضراء التي تحقنها الراتنج. بعد ثلاثة أشهر من التخزين ، كان التباين كافيا لتمييز الوريد البوابي عن القناة الصفراوية.ومع ذلك ، فإن هطول الأمطار أثرت خلط الراتنجات اثنين ، والتي كانت مرئية باعتبارها التعتيم غير متجانسة في الوريد بوابة مليئة. عندما كان الراتنج أقدم من ستة أشهر ، تدهور التباين إلى درجة أنه لم يكن من الممكن التمييز بين القناة الصفراء المحقونة من الوريد البوابي الذي يتم حقنه باللون الأخضر ، استنادا إلى تباينها وحده. من المهم إجراء شق مائل في القناة الصفراوية الشائعة.وإلا سيكون من الصعب جدا إدراج الأنابيب. تقنية DUCT تنير آليات معمارية جديدة للتجديد الصفراوي في نموذج ذي صلة سريريا مع ميزات متميزة في مناطق الفص الهلالي والمحيطي.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

إلى الوراء الإرواء وملء الأوعية الدموية التاجية الفأر كما التحضير للتصوير المقطعي بالكمبيوتر مايكرو

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

الأبعاد 3-صب الراتنج والتصوير من الوريد البابي داخل الكبد أو ماوس نظام القناة الصفراوية

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

ناضح تسليم المخدرات إلى Hindlimbs الدماغية ونضح من الأوعية الدموية مع Microfil للمشاريع المتناهية الصغر التصوير المقطعي التصوير

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

تقييم الجدوى من الدهون الإنسان الحقن في الفئران عارية مع مايكرو-التصوير المقطعي

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

القناة الصفراوية ربط في الفئران: تحريض التهاب الكبد والتليف الإصابات التي كتبها الانسدادي ركود صفراوي

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

باستخدام التصوير المقطعي الصغيرة لتقييم التنمية الورم ومتابعة الاستجابة للعلاج في نموذج الفأر من سرطان الرئة

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

التصوير نيون المشتركة القريبة من تحت الحمراء والتصوير المقطعي مايكرو لتصور مباشرة الشلل Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

اختبار الأسيتيل كولين متبوعا بالأدينوزين للتشخيص الغازي للاضطرابات الحركية الوعائية التاجية

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

تقنيات تحضير الأنسجة للتصوير المقطعي المحوسب الجزئي المعزز بالتباين لنماذج قلب الثدييات الكبيرة المصابة بأمراض مزمنة

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

تقييم العمارة الدقيقة للعظام التربيقية في نموذج فأر هشاشة العظام

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...