Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

Wij danken Kari Huppert en Stacey Huppert voor hun expertise en hulp op het gebied van galweg cannulatie en hun laboratorium gastvrijheid. We bedanken ook Nadja Schultz en Charlotte L. Mattsson voor hun hulp bij gemeenschappelijke galweg cannulatie.
Wij danken de volgende subsidieverlenende instanties voor hun steun:
Voor werk in ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Starting Grant van Zweedse Stichtingen), European Association for the Study of the Liver (Daniel Alagille Award), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) en Vetenskapsrådet (2019-01350).
Voor werk in JK Lab: We erkennen CzechNanoLab Research Infrastructure ondersteund door MEYS CR (LM2018110). J.K. dankzij de steun van subsidie FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

Een apart project in het ERA-lab wordt gefinancierd door ModeRNA. ModeRNA had geen rol in het hier beschreven project/protocol.

Verschillende kritische stappen bepalen het succes van DUCT, van monstervoorbereiding tot de parameters van het CT-apparaat. Om de beste resultaten te bereiken, moet goed contrasterende, goed geïnjecteerde en bubbelvrije hars worden gebruikt om eenvoudige digitale verwerking met geautomatiseerde drempels mogelijk te maken om 3D-gegevens, afbeeldingen en films te verkrijgen. Met training en het volgen van dit protocol is 90% van de injecties succesvol en resulteert dit in reproduceerbare gegevens. Het is belangrijk om verse gele hars te gebruiken om het beste contrast tussen de twee geïnjecteerde systemen te bereiken. De gele hars heeft een zeer sterke radiopaciteit, terwijl de blauwe hars een niet-detecteerbare radiopaciteit heeft. Topresultaten worden behaald binnen de eerste drie maanden na het openen van een nieuwe gele harsfles. Na verloop van tijd slaat hars neer en na langere opslag (>6 maanden) zullen de gele en de groene harsen niet langer te onderscheiden zijn in CT-scans. Beelden met een slecht contrast vereisen uitgebreide en tijdrovende handmatige tracering en segmentatie van de twee systemen. Vervolgens zijn goed uitgerekte buizen onmisbaar om te passen in het gemeenschappelijke galkanaal van volwassen muizen en het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader van postnatale muizen. Het toegangspunt voor de injectie moet met zorg worden gecreëerd. Als het gemeenschappelijke galkanaal transversaal wordt opengesneden, zal het waarschijnlijk loskomen van het omliggende weefsel, waardoor een succesvolle binnenkomst van de slang wordt voorkomen. Deze stap is vooral delicaat voor postnatale muizen waarbij het gemeenschappelijke galkanaal zich terugtrekt en "opkrult" als het zich heeft losgemaakt van het omliggende weefsel, waardoor het inbrengen van de slang uiterst uitdagend is. De gemeenschappelijke galweginvoer en injectie kan enige oefening vereisen. Tijdens het voorbereiden van de slang met hars en tijdens de injectie, vermijd bubbelvorming, omdat bubbels negatieve ruimte creëren in de CT-beelden en tijdrovende handmatige correctie vereisen. Het is belangrijk om de lever zachtjes te masseren door tijdens en na de injectieprocedure met een bevochtigd wattenstaafje over het oppervlak te rollen, omdat dit een gelijkmatige harsverspreiding vergemakkelijkt. Na de voltooiing van de injectie en het verwijderen van de slang, moet de zijden hechtknoop snel en voorzichtig worden aangespannen, zodat de hars niet uit de lever stroomt voordat deze volledig polymeriseert. Voor succesvolle microCT-beeldvorming moet het monster op de juiste manier op zijn plaats worden gefixeerd met agarose en thermisch worden aangepast om bewegingsartefacten in de CT-gegevens te elimineren. De acquisitie-instellingen zijn ook van cruciaal belang, die moeten worden geoptimaliseerd om een adequate ruimtelijke resolutie te bereiken om fijne structuren op te lossen.
Technische wijzigingen in de injectieprocedure kunnen worden aangebracht om injectie bij jongere muizen te bereiken. Momenteel wordt het harsgieten van jongere muizenlevers beperkt door de beschikbaarheid van voldoende dunne buizen, waarbij PE10 de kleinste commercieel verkrijgbare buis is. Tanimizu et al. injecteerden met succes koolstofinkt in embryonale dag 17 (E17) gemeenschappelijke galwegen met behulp van glazen haarvaten11. Toekomstige testen of hars via glazen capillair kan worden geleverd, zou daarom van belang zijn. DUCT werd verder aangepast om andere buisvormige systemen te injecteren, zoals de luchtwegen en de longslagadervaculatuur van de longen9. De dubbele harsinjectie kan ook worden aangepast om te worden gebruikt met andere in de handel verkrijgbare harsen, of dit protocol kan worden gebruikt voor injecties met koolstofinkt.
Een van de belangrijkste beperkende factoren van de DUCT-pijplijn is de viscositeit van de hars. DUCT kan alleen worden gebruikt voor het gieten van hars van buisvormige structuren boven een diameter van 5 μm. In deze dataset kon de hars buizen binnendringen met de kleinste diameter van 5 μm9. Deze groottebeperking sluit de analyse van fijne ductules en kleine haarvaten uit. Om de DUCT-pijpleiding verder te ontwikkelen naar vaten van kleiner kaliber, moeten andere commercieel verkrijgbare harsen worden getest, of de ontwikkeling van nieuwe radiopaquemiddelen met lage viscositeit kan de lumenpenetratie verbeteren.
In Hankeova et al.9 werd DUCT vergeleken met twee andere veelgebruikte technieken, dubbele koolstofinktinjecties gevolgd door weefselverwijdering en standaardfotografie, en iDISCO+ met kleuring van de bloedvaten met alfa-gladde spiercelactine en galwegen met cytokeratine 7, gevolgd door 3D-beeldvorming9. DUCT presteerde beter dan de andere twee methoden in termen van dubbele analyse (wat een uitdaging was voor iDISCO + vanwege hoge leverautofluorescentie), 3D-beeldvorming en kwantificering (niet mogelijk met koolstofinktinjectie) en lumenisatie (DUCT levert gegevens voor de interne lumenarchitectuur en systeemperfusie). Zoals hierboven vermeld, is de belangrijkste beperking van DUCT de minimale lumengrootte die kan worden geïnjecteerd en geanalyseerd (limiet van 5 μm), een parameter waarin zowel koolstofinktinjectie als iDISCO + beter presteerden. DUCT is superieur aan harsgieten met één systeem3,5,6 omdat het analyse van elk geïnjecteerd systeem afzonderlijk mogelijk maakt en ook dubbel 3D-onderzoek mogelijk maakt om de architecturale relatie tussen de twee systemen te bestuderen.
DUCT kan worden toegepast om twee buisvormige netwerken in 3D te bestuderen. Als proof of principle werd DUCT gebruikt om de leverbiliaire en poortadersystemen en de longslagader vasculatuur en luchtwegen in de longen te visualiseren9. De intrahepatische galwegen ontwikkelen zich naast de poortader en de poortader biedt een structureel sjabloon en signaleringscentrum dat de groei en differentiatie van de galboom reguleert12. In Hankeova et al.9 onderzocht DUCT galregeneratie in een muismodel voor de menselijke pediatrische ziekte Alagille-syndroom. DUCT onthulde niet eerder gerapporteerde architecturale mechanismen die het galsysteem gebruikte om een wild-type-achtig volume te bereiken9. De Alagille-syndroommuizen gebruikten twee verschillende strategieën: (1) in de hilarische en centrale regio's van de lever verhoogde het galsysteem zijn vertakking en (2) in de leverrand waren de de novo gegenereerde galwegen zeer kronkelig. Deze twee factoren samen leverden een bijna normaal galsysteemvolume op, ondanks de abnormale architectuur. Bovendien detecteerde DUCT abnormale galkanaalvertakkingen die onafhankelijk van poortadervertakkingen optraden en galwegen die verbindingsbruggen vormden tussen twee poortaders9. Deze fenotypen zouden onmogelijk te detecteren zijn in enkelharsgieten en zouden verkeerd kunnen worden geïnterpreteerd in 2D histologische secties als galwegproliferatie. DUCT levert dus gegevens die de 3D-architectuur van twee buisvormige netwerken op het hele orgaan- of kwabniveau beschrijven met de mogelijkheid van kwalitatieve en diepgaande kwantitatieve analyse. DUCT zou een nieuwe standaard kunnen zijn voor postnatale leverontwikkeling en leverregeneratieanalyses in verschillende diermodellen.

Orgelharsgieten is een techniek die teruggaat tot de 17e eeuw1. Een van de eerste voorbeelden van modern harsgieten werd uitgevoerd op de menselijke lever van een autopsie. Intrahepatische galwegen werden gevuld met een contrastmiddel gemengd met gelatine, gevolgd door beeldvorming met een röntgen-CT-scan2. Het doel van de DUCT-techniek is om twee buisvormige hars-gegoten netwerken in combinatie in 3D te visualiseren, digitaliseren en analyseren.
DUCT is gebaseerd op de uitgebreide bestaande kennis van single-system leverharsgieten3,4,5,6,7,8 en strekt zich uit tot gelijktijdige 3D-visualisatie en analyse van twee systemen9. DUCT geavanceerde single resin casting naar double resin casting door twee radiopaque harsen van verschillend contrast te mengen en deze harsen in twee verschillende netwerken te injecteren, met name het gemeenschappelijke galkanaal en de poortader. DUCT kan worden toegepast op jonge postnatale muizen met reproduceerbare resultaten al op postnatale dag 15 (P15). In vergelijking met op microscopie gebaseerde beeldvormingstechnieken is het belangrijkste voordeel dat DUCT sneller, antilichaamvrij is en leverweefselautofluorescentie de beeldvorming niet verstoort. Verder biedt DUCT kwantitatieve gegevens die de lumenisatiestatus, interne diameter, netwerkconnectiviteit en perfusie beschrijven. Onderscheid maken tussen de aanwezigheid van lumenvormende cellen en hun de facto morfogenese in buizen is essentieel voor het analyseren van organen waarin ductulaire cellen aanwezig zijn maar geen buizen vormen, zoals het geval kan zijn bij het syndroom van Alagille10. Het grootste nadeel van DUCT is de beperkte penetratie van de hars, die stroperig is en niet in buizen met een klein kaliber (<5 μm) komt. DUCT kan worden toegepast voor elke buisvormige structuur na het bepalen van het injectie-ingangspunt, zoals de arteriële en veneuze bloedsomloop, luchtwegen, de extrahepatische galwegen of lymfevaten. Het zou dus de analyse van de hele orgaanarchitectuur van andere weefsels zoals longen en pancreas kunnen vergemakkelijken.
MicroCT-gesegmenteerde afbeeldingen kunnen worden verwerkt met behulp van in de handel verkrijgbare beeldvormingssoftware, zoals ImageJ, of op maat geschreven pijplijnen (bijv. MATLAB). De harsgeïnjecteerde lever kan kwalitatief worden geanalyseerd voor netwerkuitbreiding en connectiviteit of kwantitatief voor volume, lengte, vertakking, tortuositeit van een enkel systeem en de interactie tussen twee systemen, zoals de afstand tussen twee systemen, of branchpoint-afhankelijkheid (vertakt systeem 1 zich in de nabijheid van systeem 2-vertakking?). De DUCT-pijplijn met harsinjectie, microCT-scanning en CT-gegevenssegmentatie, gecombineerd met gedetailleerde kwantitatieve analyse van architecturale mechanismen van twee buisvormige systemen, zou een standaard kunnen bieden voor volledige leveranalyse in diermodellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

De lever is het grootste interne orgaan bij mensen en muizen, en hoge autofluorescentie vormt een belangrijke uitdaging voor het beoordelen van de driedimensionale (3D) architectuur van het orgaan op het niveau van het hele orgaan. Leverarchitectuur wordt gekenmerkt door meerdere vertakkende lumenstructuren, die kunnen worden gevuld met hars, waaronder vasculaire en galbomen, waardoor een zeer stereotiep patroon ontstaat in het anders hepatocytrijke parenchym. Dit protocol beschrijft de pijplijn voor het uitvoeren van microcomputertomografie met dubbele harsgiet, of "DUCT". DUCT omvat het injecteren van de poortader en de gemeenschappelijke galwegen met twee verschillende radiopaque kunstharsen, gevolgd door weefselfixatie. Kwaliteitscontrole door één kwab, of de hele lever, te zuiveren met een optisch clearingmiddel, maakt pre-screening van geschikte geïnjecteerde monsters mogelijk. In het tweede deel van de DUCT-pijplijn kan een kwab of de hele lever worden gebruikt voor micro-computertomografie (microCT) scanning, (semi-)geautomatiseerde segmentatie en 3D-rendering van de portale veneuze en galwegen. MicroCT resulteert in 3D-coördinatengegevens voor de twee harsen die zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van de twee systemen en hun ruimtelijke relatie mogelijk maken. DUCT kan worden toegepast op postnatale en volwassen muizenlever en kan verder worden uitgebreid naar andere buisvormige netwerken, bijvoorbeeld vasculaire netwerken en luchtwegen in de longen.

Wat te doen Succesvolle dubbele harsinjectie wordt bereikt wanneer zowel de intrahepatische galwegen als de poortader vasculatuur goed gevuld zijn. Als een kwaliteitscontrolestap maakt het opruimen van één kwab (bijvoorbeeld de linker laterale kwab) verificatie van een succesvolle injectie mogelijk, gevolgd door beeldvorming van interessante lobben. De optisch geklaarde kwab kan later worden gescand met behulp van microCT; daarom is het mogelijk om de hele lever optisch te zuiveren. In goed geïnjecteerde muizenlever moet de poortader vasculatuur worden gevuld met hars totdat de leverrand en hars zichtbaar moeten zijn in zijtakken (figuur 4), en deze architectuur wordt getrouw samengevat in microCT gescande en gesegmenteerde gegevens. Verder moeten goed geïnjecteerde intrahepatische galwegen zichtbaar zijn naast de hoofdportaaladertakken die zich bijna tot aan de periferie uitstrekken, en hars moet zichtbaar zijn in de belangrijkste zijtakken. Als de controlekwab de kwaliteitscontrolestap doorstaat, kunnen de betreffende lobben (inclusief de optisch gewiste) worden gescand met microCT. Het resultaat van de gesegmenteerde gegevens van een goed geïnjecteerde lever wordt getoond voor een P15-muis (figuur 4A,B) en een volwassen muis (figuur 4C,D).
Wat niet te doen Intact leverweefsel is een voorwaarde voor een succesvolle injectie. Wees extra voorzichtig bij het doorsnijden van de buikholte en het middenrif om niet per ongeluk het leverweefsel te snijden. Als er tijdens deze procedure fysieke schade aan de lever is, is de kans groot dat de hars uitlekt tijdens de injectie van de poortader (figuur 5A). Het is niet mogelijk om een goede injectie van het vasculaire systeem te bereiken als de lever fysiek beschadigd is.
Een van de meest voorkomende fouten is het ondervullen van de lever met hars, wat kan leiden tot uitdagingen voor visualisatie of analyse. Een van de oorzaken voor ondervulling van het systeem is voortijdig verharden van hars in de naald of de punt van de slang voordat de injectie is voltooid (figuur 5B, blauwe pijlpunten, beugels tonen grote bellen). Een goede gewoonte is om één injectieset per dier te gebruiken en snel te werken nadat het uithardingsmiddel aan de hars is toegevoegd. Als de hars uithardt tijdens de injectie (wat kan worden waargenomen door een half gevuld systeem, hier geïllustreerd met een half gevulde poortader vasculatuur) verwijder dan de slang, snijd de punt van de buis (altijd diagonaal om een afgeschuinde punt te creëren) en duw op de zuiger. Als de hars weer begint te druppelen, breng dan voorzichtig de slang opnieuw in en zet deze vast met de hechtdraad. Als de hars in de naald is uitgehard, vervang dan de slang volledig, vul deze met hars (vermijd bubbels), plaats de slang voorzichtig opnieuw en zet deze vast met de hechting. Het kan een uitdaging zijn om de slang te vervangen, vooral bij jonge postnatale muizen <P30, omdat het weefsel kwetsbaarder is. Een andere oorzaak van slechte harsvulling van portalader vasculatuur kan onvoldoende transcardiale perfusie zijn (figuur 5C, blauwe pijlpunten duiden op bloed dat zichtbaar is in terminale takken). Dit kan worden waargenomen wanneer de uiteinden van de bloedvaten zijn gevuld met bloed in plaats van hars. Om dit te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de poortader (buiten de lever) vóór de injectie geen bloed bevat. De derde oorzaak van ondergevulde lever is wanneer de slang te diep in de lever wordt ingebracht en een tak naar een van de lobben binnendringt. Om dit te voorkomen, plaatst u de slang op minimaal 0,5 cm van de ingang naar de lever.
Omgekeerd raken één of beide systemen overvol met hars (figuur 5D). Het is noodzakelijk om de lever visueel te controleren tijdens de injectie. Galsysteemgieten met hars is uitdagender dan portaaladerharsgieten, omdat met hars gevulde kanalen slechts vaag zichtbaar zijn op het leveroppervlak en het moeilijk is om te beoordelen wanneer het systeem bijna vol is en wanneer moet worden gestopt. Wanneer kleine gele harsstippen op het leveroppervlak verschijnen (figuur 2Ci, blauwe pijlpunt), is dit een teken dat het galsysteem volledig is gevuld en de hars uit de kanalen begint te lekken. Kleine harslekkage kan handmatig worden gecorrigeerd tijdens microCT-gegevenssegmentatie (figuur 5D, rechterpanelen).
Als de injectiedruk te hoog is, kan dit ertoe leiden dat vaten of kanalen scheuren (figuur 5E), waardoor de vat- of kanaalarchitectuur onomkeerbaar wordt beschadigd. De lever zal niet geschikt zijn voor microCT-scanning of -analyse. Om overvulling van hars te voorkomen, optimaliseert u het juiste volume en de juiste druk die worden gebruikt voor injectie in elk muismodel. Bij het werken met muizen die zijn uitgedaagd met een toxisch dieet, genetische modificatie of leverbeschadiging die de gal- of veneuze systemen beïnvloedt, of leverstijfheid, moeten de injectiedruk en het volume mogelijk worden aangepast omdat het toegestane volume en de druk kunnen verschillen van de muizen van het wilde type. Dit protocol beschrijft de handmatige injectie van de twee systemen, maar het is mogelijk om de spuit aan te sluiten op een pomp om de injectiedruk te standaardiseren. Bubbels zijn een ander veel voorkomend injectieartefact dat leidt tot schaarse vulling van de buisvormige netwerken (figuur 5F-H, blauwe pijlpunten). Om bubbelvorming te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de spuit en de slang geen bubbels bevatten, volledig gevuld zijn met hars en dat de hars vóór de injectie uit de punt van de slang druppelt. Kleine bubbels die als negatieve gebieden op de microCT-gegevens verschijnen, kunnen handmatig worden gecorrigeerd tijdens nabewerkingsstappen, hoewel dit bewerkelijk is.
Vers is het beste Het gebruik van verse gele hars is een cruciale factor, die het contrast van de twee harsen en de microCT-gegevenssegmentatie aanzienlijk beïnvloedt. Wanneer de vers geopende hars wordt gebruikt (figuur 6A) is er een duidelijk verschil in contrast tussen de gele hars geïnjecteerde galkanalen (helder wit) en de groene hars geïnjecteerde poortaders (heldergrijs). Lever die wordt geïnjecteerd met verse hars wordt gemakkelijk verwerkt met behulp van geautomatiseerde globale drempels. Bij langdurige opslag slaat de hars neer en neemt het contrast af. Na 3 maanden opslag kan het contrast nog steeds voldoende zijn om de poortader van de galweg te onderscheiden (figuur 6B), maar neerslag beïnvloedt de vermenging van de twee harsen, wat zichtbaar is als een heterogene opaciteit in de gevulde poortader (fig. 6B, blauwe pijlpunten). Heterogeen contrast heeft een negatieve invloed op de geautomatiseerde drempelvorming en vereist handmatige correcties, waardoor de verwerkingstijd toeneemt. Als de hars ouder is dan zes maanden, is het contrast afgenomen tot een punt waarop het niet mogelijk is om het geel geïnjecteerde galkanaal te onderscheiden van de groen geïnjecteerde poortader op basis van hun contrast alleen (figuur 6C). In dit geval moeten de galweg en de poortader handmatig worden gesegmenteerd op basis van hun diameter en positie in het hilargebied en handmatig worden gevolgd door de volledige microCT-gegevens. Deze procedure is uiterst tijdrovend en kan het beste worden vermeden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> Figuur 1: Injectieset voor harsgieten. (A) Injectieset #1 bestaat uit een naald van 30 G en een PE10-slang van ~ 30 cm lang. Injectieset #2 bestaat uit een naald van 23 G en een PE50-slang van ~ 30 cm lang. (B) De punt van de buis wordt uitgerekt en onder een hoek gesneden om een afgeschuinde punt te creëren. De liniaal in A en B is een centimeterliniaal, met grote stappen van 1 cm, tussenstappen van 5 mm en kleine stappen van 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> Figuur 2: Dubbel hars gietstroomschema. (A) Schema met de muriene veneuze bloedsomloop en het hart met gemarkeerde rechteratrium, die vóór de perfusie moet worden weggesneden, en de linker ventrikel waarin de naald moet worden ingebracht voor perfusie om het bloed uit de bloedsomloop weg te spoelen. De inferieure vena cava moet onder de nieren worden doorgesneden om de vasculaire druk te verlichten. (B) Stroomschema voor de injectie van galweghars. (i) Zoomafbeelding van (A) die aangeeft waar de IVC moet worden gescheiden. (ii) Afbeelding van het gemeenschappelijke galkanaal (gele stippellijn) van het leverarische gebied naar de sluitspier van Oddi (zwarte pijlpunten), met hechtdraad onder het vrijgemaakte gemeenschappelijke galkanaal. (iii) Geschikte positie voor losse bovenhandse knoop rond gemeenschappelijke galwegen. iv) De gele stippellijn en zwarte pijlpunten labelen de sluitspier van Oddi, waarbij de schuine hoek voor incisie wordt aangegeven en hoe de opening eruit moet zien na de schuine hoekincisie. v) Schema dat de oriëntatie van de schuine opening van de PE10-buis (naar boven) bij het inbrengen aangeeft. vi) uiterlijk van gele hars die wordt geïnjecteerd; hars moet gemakkelijk de losjes gebonden knoop passeren. IVC, inferieure vena cava; CBD, gemeenschappelijke galwegen. (C) Stroomschema voor de injectie van portaaladerhars. (i) De groene stippellijn markeert de poortader van het hilargebied. De blauwe pijlpunten labelen het overvolle galsysteem. (ii) Geschikte locatie voor losse overhandse knoop rond portaalader. iii) Schematische weergave van de schuine opening (naar boven) bij het inbrengen. iv) Uiterlijk van lever bij injectie van groene hars en gele hars; let op het met hars gevulde bloedvat in de leverrand. PV, portaalader. Figuur 2A is gemaakt met Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> Figuur 3: Micro CT-gegevensverwerking in volumegrafische software. (A) Oppervlaktebepaling, (i) overschatte isowaarde (huidige preview van selectie wordt weergegeven in gele kleur), (ii) onderschatte isowaarde, (iii) optimale selectie van isowaarde voor een goede oppervlaktebepaling van poortader en galwegen. (B) Het splitsen van het interessegebied (ROI) gecreëerd door oppervlaktebepaling, (i) stel de waarde in het dialoogvenster hoog genoeg in dat er slechts één segment (het grootste) overblijft, (ii) in gele frames worden de kleinere (uitgesloten) deeltjes weergegeven. (C) Oppervlakteafvlakking van de gegevens, (i) afvlakkingsfunctie bevindt zich in het linkerdeelvenster, (ii) stel de afvlakkingssterkte in op 1 (max. 2) en creëer nieuwe vloeiende ROI, (iii) afgevlakte gegevens. (D) Scheiding van individuele buisvormige systemen, (i) in oppervlaktebepalingsfunctie de isowaarde zo instellen dat alleen het galsysteem bij de selectie wordt opgenomen (het huidige voorbeeld van de selectie wordt in gele kleur weergegeven), (ii) markeer de ROI van beide systemen en roi van alleen het galsysteem en trek de ROI van het galsysteem af van de ROI van beide systemen, iii) Portaalader in grijs weergegeven, de galwegen in groen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> Figuur 4: Goed geïnjecteerde galweg (BD) en portalader (PV) systemen. (A) Optisch geklaarde rechter mediale kwab (RML) van postnatale dag 15 (P15) lever geïnjecteerd met twee harsen in de twee systemen. Schaalbalk 1 mm. (B) 3D-weergave van P15 RML weergegeven in (A) met weergave van portaaladervaculaire in wit en galsysteem in groen. Schaalbalk 1 mm. (C) Optisch geklaarde RML van volwassen lever geïnjecteerd met twee harsen in de twee systemen. Schaalbalk 1 mm. (D) 3D-weergave van volwassen RML weergegeven in (C) met weergave van portaaladervaculaire in wit en galsysteem in groen. H = hilar, P = perifeer. Schaalbalk 1 mm. Panelen A, B, D zijn aangepast met toestemming van Hankeova et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> Figuur 5: Veelvoorkomende uitdagingen van leverinjecties met dubbele hars. (A) De afbeelding toont een lever die per ongeluk werd geknepen tijdens de eerste opening van de buikholte en de hars lekt door de snede (blauwe pijlpunt). (B) Slecht geïnjecteerd poortadersysteem als gevolg van harsverharding. Blauwe pijlpunten labelen lege terminaltakken en rode haakjes labelen grote bubbels. Schaalbalk 1 mm. (C) Slecht geïnjecteerd poortadersysteem als gevolg van slechte transcardiale perfusie. Blauwe pijlpunten labelen bloed dat zichtbaar is in de terminale takken. Schaalbalk 1 mm. (D) Overgevuld galsysteem gemanifesteerd door geïsoleerde bolletjes hars. De linkerpanelen tonen de optisch geklaarde lever en de rechterpanelen tonen het 3D microCT-gerenderde beeld. De blauwe stippellijnen geven zoomgebieden weer. De zwarte pijlpunten labelen een deel van de lever dat beschadigd is geraakt tijdens het optisch opruimen na microCT-scanning. Schaalbalk 1 mm. (E) Hoge druk tijdens harsinjectie kan scheuring van de poortader veroorzaken (het dier in dit paneel draagt een Jag1H268Q-mutatie), gemarkeerd door blauwe pijlpunten. Schaalbalk 1 mm. (F) Bellen in de hars tijdens poortaderinjectie (blauwe pijlpunten) en (G) galweginjectie (blauwe pijlpunt), schaalbalk 1 mm. (H) MicroCT-scan van bellen (blauwe pijlpunt), slecht gevulde eindtakken (rode haakjes) en harslekkage (gele pijlpunt), schaalbalk 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> Figuur 6: Differentieel harscontrast. (A) Vers geopende gele hars genereert voldoende contrast om hars geïnjecteerde poortader (grijs) en galwegen (wit) te onderscheiden. (B) Drie maanden opslag van gele hars leidt tot neerslag van de hars, wat resulteert in heterogene opaciteit (grijswitte poortader, blauwe pijlpunt). (C) Langdurige opslag (>6 maanden) van gele hars vermindert het contrast tussen de poortader (grijs) en galwegen (grijs). Schaalbalk 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Dubbelharsgieten micro-computertomografie, of DUCT, maakt visualisatie, digitalisering en segmentatie van twee buisvormige systemen tegelijkertijd mogelijk om 3D-analyse van orgelarchitectuur te vergemakkelijken. DUCT combineert ex vivo injectie van twee radiopaqueharsen gevolgd door micro-computertomografiescanning en segmentatie van de tomografische gegevens.

DUCT: Double Resin Casting gevolgd door Micro-Computed Tomography voor 3D Leveranalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Deze methode stelt ons in staat om de architectuur van levervaat- en galsystemen in 3D te analyseren, visualiseren en kwantificeren. We kunnen nu de ruimtelijke aspecten van leverziekte en regeneratie beter begrijpen. Het belangrijkste voordeel van deze techniek is dat het niet afhankelijk is van het bestaan van antilichamen of fluorescentiebeeldvorming.Het maakt ook directe visualisatie mogelijk van welke netwerken goed lumen zijn. Deze methode is geschikt voor de analyse van buisvormige systemen, vandaar dat onderzoek van bloedvaten, galwegen en luchtwegen ideale gebieden zijn. We gebruikten DUCT om de structurele veranderingen met betrekking tot galregeneratie te begrijpen.Voordat u hars in het galsysteem van de muis injecteert, begint u de darm en pancreas naar de linkerkant van de muis te verplaatsen, met behulp van een wattenstaafje bevochtigd met PBS om de gemeenschappelijke galwegen en poortader bloot te leggen. Maak vervolgens een kleine transversale incisie in de inferieure vena cava. Draai de ventrale kant van de lever naar het hart om het viscerale oppervlak en het hilarische gebied bloot te leggen en lokaliseer het gemeenschappelijke galkanaal dat loopt van het hilarische gebied over de pancreas en in de darm bij de sluitspier van Oddi.Gebruik de rechte tang om het omliggende weefselgebied van ongeveer vijf millimeter van het gemeenschappelijke galkanaal te verwijderen. Bind vervolgens, door een zijden hechtdraad onder het gemeenschappelijke galkanaal te plaatsen, een losse bovenhandse knoop rond het gemeenschappelijke galkanaal. Houd de veerschaar plat tegen het gemeenschappelijke galkanaal om een schuine incisie te maken naar het gemeenschappelijke galkanaal op de plek waar het gemeenschappelijke galkanaal de pancreas en darm binnenkomt naast de sluitspier van Oddi.Meng vervolgens een milliliter van de gele hars met 50 microliter van het MV-uithardingsmiddel en vul een luerspuit van één milliliter met het mengsel van het harsuithardingsmiddel. Sluit de gevulde spuit aan op de slangenset één en druk op de zuiger om de slang te vullen totdat het mengsel van harsuithardingsmiddel uit de punt van de slang druppelt. Gebruik de tang om het gebied rond de gemeenschappelijke galwegincisie recht te trekken.Voordat de slang in de opening in het gemeenschappelijke galkanaal wordt ingebracht met de langste rand van de afgeschuinde punt naar beneden naar de dorsale kant van het galkanaal. Span vervolgens de zijden draadknoop aan om de slang in het gemeenschappelijke galkanaal vast te zetten. Na het injecteren van de hars in het gemeenschappelijke galkanaal, observeer de galblaas en de individuele leverlobben.Masseer de lever met een pbs-bevochtigd wattenstaafje om de hars gelijkmatig te verspreiden. Met hars gevulde galwegen terminale takken zullen vaag zichtbaar zijn aan het leveroppervlak. Stop met het injecteren van de hars wanneer er stippen hars verschijnen aan het oppervlak van de lever of wanneer weerstand wordt bereikt.Verwijder vervolgens de slang door uit het gemeenschappelijke galkanaal te trekken en draai de zijden knoop snel aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Snijd de losse uiteinden van de zijden hechtdraad, zodat ze de poortaderinjectie niet verstoren. Voordat u de hars in de poortader injecteert, verwijdert u de poortader uit het omliggende weefsel op ongeveer twee centimeter van de binnenkomst in de lever, met behulp van een rechte tang.Plaats vervolgens de zijden hechtdraad onder het vrijgemaakte gebied van de poortader om een losse bovenhandse knoop te binden. Maak in de poortader distale naar de lever een longitudinale incisie voordat u de knoop bindt. Bereid vervolgens het mengsel van het groene harsuithardingsmiddel in de spuit en vul de slang met het mengsel zoals eerder is aangetoond.Gebruik de tang om de poortader recht te trekken door het omliggende weefsel naar de staartzijde te trekken voordat u de slang met de langste rand van de afgeschuinde punt naar de dorsale kant van het vat brengt. Span de zijden draad aan om de slang in de poortader vast te zetten. Na het injecteren van de hars in de poortader, observeer je de bloedvaten die zich vullen met hars en masseer je de lever met een PBS-bevochtigd wattenstaafje om de hars te helpen verspreiden.Wanneer alle bloedvaten gevuld zijn, trekt u de slang uit de poortader en spant u snel de zijden knoop aan met een tang om te voorkomen dat de hars eruit lekt. Voor micro-computertomografie of MicroCT-scan van de ontleedde lever van de muis, plaats de rechter mediale leverkwab in een conische buis van 15 milliliter en vul de buis met 1% agarosegel tot ongeveer twee derde van het totale volume van de buis om ongewenste monsterbewegingen tijdens MicroCT-meting te minimaliseren. Monteer de conische buis van 15 milliliter met het monster op de rotatietrap van een CT-apparaat.Laat de buis zich gedurende ten minste één uur thermisch aanpassen aan de meetkamer. Wanneer het monster thermisch is aangepast, centreert u het in het gezichtsveld of FOV en optimaliseert u vervolgens de afstanden van het bronmonster en de monsterdetector, of SSD en SDD om voldoende voxelresolutie te bereiken. Zodra de parameters zijn ingesteld, start u een CT-meting.Gebruik speciale tomografische reconstructiesoftware om de CT-gegevens te reconstrueren. Als u de CT-gegevens wilt analyseren, laadt u de bestanden door bestand, import en opdracht te selecteren. Gebruik de oppervlaktebepalingsfunctie op het bovenpaneel om de hars in de gegevens te segmenteren met behulp van globale drempelwaarden.Bepaal in het dialoogvenster de drempelwaarde met de histogramevaluatie door de positie van de rode isowaardelijn in te stellen om alleen de met hars gevulde vaten te segmenteren. Selecteer in het linkerdeelvenster de module ROI maken van volume of CAD of mesh om een interessegebied of ROI van de met hars gevulde vaten te maken. Gebruik in het dialoogvenster de optie ROM's maken van effen om de naam van het verwerkte volume te selecteren en te bevestigen.Elimineer foutieve segmentatie van ruisclusters in het achtergrondgebied van deze ROI. Markeer de ROI in het rechterdeelvenster door met de rechtermuisknop te klikken en de ROI van modulesplitsing te selecteren. Stel in het dialoogvenster de minimale volumeproxelparameter in om alle ruisdeeltjes uit te sluiten.De parameterwaarde is experiment- en gegevensafhankelijk en geoptimaliseerd voor elk te analyseren monster. Gebruik op het linkerpaneel de afvlakkingsmodule om gladde, continue en solide kanaalmaskers te maken zonder artefacten, zoals de aanwezigheid van luchtbellen of harslekkage in de ROI van de harskosten. Creëer een afzonderlijke ROI zoals eerder beschreven voor het systeem gevuld met de meer absorberende hars zoals de gele hars die wordt gebruikt voor de gemeenschappelijke galweginjectie met hogere intensiteitswaarden in de CT-gegevens.Markeer en harsmasker de nieuwe ROI door met de rechtermuisknop te klikken voordat u URI's aftrekt en vervolgens de nieuwe ROI van de ROI van het harsmasker aftrekt om een nieuwe ROI voor het resterende buisvormige systeem te creëren. Exporteer de resulterende ROI's voor beide buissystemen in verschillende formaten op basis van operatorreferenties voor latere verwerking in verschillende software. Verwerk verder de resulterende ROI's in een volumegrafische software om de uiteindelijke visualisatie in de vorm van een afbeelding of een video te exporteren.In deze studie werd een succesvolle dubbele harsinjectie bereikt met goed gevulde intrahepatische galwegen en portale ader vasculatuur. De representatieve analyse illustreert het resultaat van de gesegmenteerde gegevens van een goed geïnjecteerde lever voor een P15-muis en een volwassen muis waar hars zichtbaar is in de zijtakken. In het typische voorbeeld van mislukte injectie resulteerde fysieke schade aan de lever tijdens de chirurgische ingreep in het lekken van de hars.Ook de voortijdige verharding van de hars in de naald of de punt van de slang vóór de injectie en de onvoldoende transcardiale perfusie veroorzaakten ondervulling van het systeem. De kleine harslekkage kan handmatig worden gecorrigeerd tijdens MicroCT-gegevenssegmentatie. Hoge injectiedruk kan vaten of kanalen scheuren en het vat of de kanaalarchitectuur onomkeerbaar beschadigen.Bovendien waren de bubbels een ander veel voorkomend injectieartefact dat leidde tot de schaarse vulling van de buisvormige netwerken. Wanneer vers geopende hars werd gebruikt, werd een duidelijk verschil waargenomen in het contrast tussen de gele hars geïnjecteerde galkanalen en groene hars geïnjecteerde poortaders. Na drie maanden opslag was het contrast voldoende om de poortader te onderscheiden van de galgang.De neerslag beïnvloedde echter het mengen van de twee harsen, wat zichtbaar was als een heterogene opaciteit in de gevulde poortader. Wanneer de hars ouder was dan zes maanden, daalde het contrast tot een punt waarop het onhaalbaar was om het geel geïnjecteerde galkanaal te onderscheiden van de groen geïnjecteerde poortader, alleen al op basis van hun contrast. Het is cruciaal om een schuine incisie te maken in de gemeenschappelijke galwegen.Anders zal het erg moeilijk zijn om de slang in te brengen. De DUCT-techniek verlicht nieuwe architecturale mechanismen van galregeneratie in een klinisch relevant model met duidelijke kenmerken in de hilaire en perifere kwabgebieden.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Retrograde Perfusie en vullen van Muis coronaire bloedvaten als voorbereiding op Micro Computed Tomography Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensionale kunstharsproducten en beeldvorming van de muis Portal Vein of Intrahepatische Bile Duct System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotische Drug Delivery voor ischemische achterpoten en perfusie van vaatstelsel met Microfil voor Micro-Computed Tomography Imaging

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Beoordeling van de levensvatbaarheid van menselijk vet Injectie in Naakt Muizen met Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Bile-duct Ligatie in Muizen: Inductie van Inflammatoire leverschade en Fibrosis door Obstructive Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Met behulp van micro-computertomografie voor de evaluatie van de ontwikkeling van tumoren en follow-up van de respons op de behandeling in een muismodel van longkanker

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Gecombineerde nabij-infrarood Fluorescent Imaging en Micro-computertomografie voor het direct visualiseren Cerebral Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

Testen van acetylcholine gevolgd door adenosine voor invasieve diagnose van coronaire vasomotorische stoornissen

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Weefselvoorbereidingstechnieken voor contrastverbeterde microcomputertomografie beeldvorming van grote hartmodellen bij zoogdieren met chronische ziekte

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Evaluatie van de microarchitectuur van het trabeculaire bot in een muismodel met osteoporose

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...