Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

Wir danken Kari Huppert und Stacey Huppert für ihre Expertise und Hilfe bei der Gallengangskanülierung und ihre Laborgastfreundschaft. Wir danken auch Nadja Schultz und Charlotte L. Mattsson für ihre Hilfe bei der gemeinsamen Gallengangskanüle.
Wir danken den folgenden Bewilligungsagenturen für ihre Unterstützung:
Für Arbeiten im ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Swedish Foundations' Starting Grant), European Association for the Study of the Liver (Daniel Alagille Award), Swedish Heart-Lung Foundation (20170723) und Vetenskapsrådet (2019-01350).
Für die Arbeit im JK Lab: Wir erkennen die von MEYS CR (LM2018110) unterstützte Forschungsinfrastruktur des CzechNanoLab an. J.K. dank der Unterstützung des Zuschusses FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

Ein separates Projekt im ERA-Labor wird von ModeRNA finanziert. ModeRNA spielte in dem hier beschriebenen Projekt/Protokoll keine Rolle.

Mehrere kritische Schritte bestimmen den DUCT-Erfolg, von der Probenvorbereitung bis zu den Parametern des CT-Geräts. Um die besten Ergebnisse zu erzielen, sollte gut kontrastreiches, gut injiziertes und blasenfreies Harz verwendet werden, um eine einfache digitale Verarbeitung mit automatisierter Schwelle zu ermöglichen, um 3D-Daten, Bilder und Filme zu erhalten. Mit Training und nach diesem Protokoll sind 90% der Injektionen erfolgreich und führen zu reproduzierbaren Daten. Es ist wichtig, frisches gelbes Harz zu verwenden, um den besten Kontrast zwischen den beiden injizierten Systemen zu erzielen. Das gelbe Harz hat eine sehr starke Radiopacität, während das blaue Harz eine nicht nachweisbare Radiopace aufweist. Top-Ergebnisse werden innerhalb der ersten drei Monate nach dem Öffnen einer neuen gelben Harzflasche erzielt. Mit der Zeit fällt das Harz aus, und nach längerer Lagerung (>6 Monate) sind das gelbe und das grüne Harz in CT-Scans nicht mehr unterscheidbar. Bilder mit schlechtem Kontrast erfordern eine umfangreiche und zeitaufwändige manuelle Nachverfolgung und Segmentierung der beiden Systeme. Als nächstes sind gut gedehnte Schläuche unerlässlich, um in den gemeinsamen Gallengang erwachsener Mäuse und den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader von postnatalen Mäusen zu passen. Der Einstiegspunkt für die Injektion muss mit Sorgfalt erstellt werden. Wenn der gemeinsame Gallengang transversal aufgeschnitten wird, löst er sich wahrscheinlich vom umgebenden Gewebe und verhindert ein erfolgreiches Eindringen des Schlauches. Dieser Schritt ist besonders heikel für postnatale Mäuse, bei denen sich der gemeinsame Gallengang zurückzieht und "zusammenrollt", wenn er sich von seinem umgebenden Gewebe gelöst hat, was das Einführen des Schlauches extrem schwierig macht. Der gemeinsame Gallengangseintritt und die Injektion können etwas Übung erfordern. Vermeiden Sie bei der Vorbereitung des Schlauches mit Harz und während der gesamten Injektion die Bildung von Blasen, da Blasen negative Räume in den CT-Bildern schaffen und eine zeitaufwändige manuelle Korrektur erfordern. Es ist wichtig, die Leber sanft zu massieren, indem sie während und nach dem Injektionsverfahren mit einem benetzten Wattestäbchen über die Oberfläche rollt, da dies eine gleichmäßige Harzausbreitung erleichtert. Nach Abschluss der Injektion und Entfernung des Schlauches muss der Seidennahtknoten schnell und vorsichtig angezogen werden, damit das Harz nicht aus der Leber fließt, bevor es vollständig polymerisiert. Für eine erfolgreiche microCT-Bildgebung muss die Probe ordnungsgemäß mit Agarose fixiert und thermisch angepasst werden, um Bewegungsartefakte in den CT-Daten zu eliminieren. Von zentraler Bedeutung sind auch die Erfassungseinstellungen, die optimiert werden sollten, um eine ausreichende räumliche Auflösung zu erreichen, um feine Strukturen aufzulösen.
Technische Modifikationen am Injektionsverfahren können vorgenommen werden, um eine Injektion bei jüngeren Mäusen zu erreichen. Derzeit ist das Harzgießen jüngerer Mauslebern durch die Verfügbarkeit von ausreichend dünnen Schläuchen begrenzt, wobei PE10 der kleinste kommerziell erhältliche Schlauch ist. Tanimizu et al. injizierten erfolgreich Kohlenstofftinte in den gemeinsamen Gallengang des embryonalen Tages 17 (E17) unter Verwendung von Glaskapillaren11. Zukünftige Tests, ob Harz über Glaskapillaren abgegeben werden kann, wären daher von Interesse. DUCT wurde weiter angepasst, um andere röhrenförmige Systeme wie die Atemwege und das Gefäßsystem der Lungenarterie zu injizieren9. Die Doppelharzinjektion könnte auch modifiziert werden, um mit anderen kommerziell erhältlichen Harzen verwendet zu werden, oder dieses Protokoll könnte für Injektionen mit Kohlenstofftinte verwendet werden.
Einer der wichtigsten limitierenden Faktoren der DUCT-Pipeline ist die Harzviskosität. DUCT kann nur zum Harzguss von Rohrstrukturen oberhalb eines Durchmessers von 5 μm verwendet werden. In diesem Datensatz konnte das Harz Rohre mit dem kleinsten Durchmesser von 5 μm9 durchdringen. Diese Größenbeschränkung schließt die Analyse von feinen Ductules und kleinen Kapillaren aus. Um die DUCT-Pipeline weiter zu kleineren Gefäßen voranzutreiben, sollten andere kommerziell erhältliche Harze getestet werden, oder die Entwicklung neuer niedrigviskoser röntgenopaker Mittel kann die Lumendurchdringung verbessern.
In Hankeova et al.9 wurde DUCT mit zwei anderen häufig verwendeten Techniken verglichen, doppelten Kohlenstofftinteninjektionen, gefolgt von Gewebereinigung und Standardfotografie, und iDISCO+ mit Färbung der Blutgefäße mit Alpha-Glattmuskelzellaktin und Gallengängen mit Cytokeratin 7, gefolgt von 3D-Bildgebung9. DUCT übertraf die beiden anderen Methoden in Bezug auf die duale Analyse (die für iDISCO+ aufgrund der hohen Leberautofluoreszenz eine Herausforderung darstellte), die 3D-Bildgebung und quantifizierung (nicht möglich mit Kohlenstofftinteninjektion) und die Lumenisierung (DUCT liefert Daten für die interne Lumenarchitektur und die Systemperfusion). Wie oben erwähnt, ist die Haupteinschränkung von DUCT die minimale Lumengröße, die injiziert und analysiert werden kann (5 μm Grenze), ein Parameter, bei dem sowohl die Kohlenstofftinjektion als auch iDISCO+ besser abgeschnitten haben. DUCT ist dem Einzelsystem-Harzguss3,5,6 überlegen, da es die Analyse jedes injizierten Systems separat ermöglicht und auch eine duale 3D-Untersuchung ermöglicht, um die architektonische Beziehung zwischen den beiden Systemen zu untersuchen.
DUCT kann angewendet werden, um zwei beliebige röhrenförmige Netzwerke in 3D zu untersuchen. Als Prinzipnachweis wurde DUCT verwendet, um das Gallen- und Pfortadersystem der Leber sowie das Gefäßsystem der Lungenarterien und der Atemwege in der Lunge zu visualisieren9. Die intrahepatischen Gallengänge entwickeln sich neben der Pfortader, und die Pfortader bietet eine strukturelle Schablone und ein Signalzentrum, das das Wachstum und die Differenzierung des Gallenbaums reguliert12. In Hankeova et al.9 untersuchte DUCT die Gallenregeneration in einem Mausmodell für die humane Kinderkrankheit Alagille-Syndrom. DUCT enthüllte bisher nicht berichtete architektonische Mechanismen, die das Gallensystem verwendete, um ein wildtypähnliches Volumen zu erreichen9. Die Alagille-Syndrom-Mäuse verwendeten zwei verschiedene Strategien: (1) in den hilaren und zentralen Regionen der Leber vergrößerte das Gallensystem seine Verzweigung und (2) in der Leberperipherie waren die de novo-erzeugten Gallengänge sehr gewunden. Diese beiden Faktoren kombinierten sich, um trotz der abnormalen Architektur ein nahezu normales Gallensystemvolumen zu erhalten. Darüber hinaus erkannte DUCT eine abnormale Verzweigung des Gallengangs, die unabhängig von der Verzweigung der Pfortader und den Gallengängen auftrat, die Verbindungsbrücken zwischen zwei Pfortadern bildeten9. Diese Phänotypen wären im Einzelharzguss unmöglich nachzuweisen und könnten in histologischen 2D-Abschnitten als Gallengangsproliferation fehlinterpretiert werden. DUCT liefert somit Daten, die die 3D-Architektur zweier röhrenförmiger Netzwerke auf der gesamten Organ- oder Lappenebene beschreiben, mit der Möglichkeit einer qualitativen und eingehenden quantitativen Analyse. DUCT könnte ein neuer Standard für postnatale Leberentwicklungs- und Leberregenerationsanalysen in verschiedenen Tiermodellen sein.

Organharzguss ist eine Technik, die bis ins 17. Jahrhundert zurückreicht1. Eines der ersten Beispiele für modernen Harzguss wurde an der menschlichen Leber aus einer Autopsie durchgeführt. Intrahepatische Gallengänge wurden mit einem mit Gelatine gemischten Kontrastmittel gefüllt, gefolgt von einer Bildgebung mit einem Röntgen-CT-Scan2. Ziel der DUCT-Technik ist es, zwei röhrenförmige harzgegossene Netzwerke im Tandem in 3D zu visualisieren, zu digitalisieren und zu analysieren.
DUCT basiert auf dem umfangreichen vorhandenen Wissen über den Einzelsystem-Leberharzguss3,4,5,6,7,8 und erstreckt sich auf die gleichzeitige 3D-Visualisierung und -Analyse zweier Systeme9. DUCT erweiterte den Einzelharzguss zum Doppelharzguss, indem zwei röntgenopake Harze unterschiedlichen Kontrasts gemischt und diese Harze in zwei verschiedene Netzwerke injiziert wurden, insbesondere in den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader. DUCT kann bereits am postnatalen Tag 15 bei jungen postnatalen Mäusen mit reproduzierbaren Ergebnissen angewendet werden (P15). Im Vergleich zu mikroskopiebasierten Bildgebungsverfahren besteht der Hauptvorteil darin, dass DUCT schneller und antikörperfrei ist und die Autofluoreszenz des Lebergewebes die Bildgebung nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus liefert DUCT quantitative Daten, die den Lumenisierungsstatus, den Innendurchmesser, die Netzwerkkonnektivität und die Perfusion beschreiben. Die Unterscheidung zwischen dem Vorhandensein lumenbildender Zellen und ihrer de facto Morphogenese zu Röhren ist für die Analyse von Organen, in denen duktuläre Zellen vorhanden sind, aber keine Röhren bilden, wie dies beim Alagille-Syndrom der Fall sein kann10, unerlässlich. Der Hauptnachteil von DUCT ist die begrenzte Durchdringung des Harzes, das viskos ist und nicht in Rohre mit einem kleinen Kaliber (<5 μm) eindringt. DUCT kann für jede tubuläre Struktur nach Bestimmung des Injektionseintrittspunkts angewendet werden, wie z. B. das arterielle und venöse Kreislaufsystem, die Atemwege, den extrahepatischen Gallengang oder die Lymphgefäße. Es könnte somit die Analyse der gesamten Organarchitektur anderer Gewebe wie Lunge und Bauchspeicheldrüse erleichtern.
MicroCT-segmentierte Bilder können mit handelsüblicher Bildgebungssoftware wie ImageJ oder benutzerdefinierten Pipelines (z. B. MATLAB) verarbeitet werden. Die harzingespritzte Leber kann qualitativ auf Netzwerkausdehnung und Konnektivität oder quantitativ auf Volumen, Länge, Verzweigung, Tortuosität eines einzelnen Systems und die Wechselwirkung zwischen zwei Systemen wie dem Abstand zwischen zwei Systemen oder der Zweigpunktabhängigkeit analysiert werden (verzweigt sich System 1 in der Nähe von System 2?). Die DUCT-Pipeline, die Harzinjektion, microCT-Scanning und CT-Datensegmentierung umfasst, kombiniert mit einer detaillierten quantitativen Analyse der architektonischen Mechanismen zweier röhrenförmiger Systeme, könnte einen Standard für die Analyse der gesamten Leber in Tiermodellen darstellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

Die Leber ist das größte innere Organ bei Menschen und Mäusen, und eine hohe Autofluoreszenz stellt eine große Herausforderung für die Beurteilung der dreidimensionalen (3D) Architektur des Organs auf der Ebene des gesamten Organs dar. Die Leberarchitektur zeichnet sich durch mehrere verzweigte lumenisierte Strukturen aus, die mit Harz gefüllt werden können, einschließlich Gefäß- und Gallenbäumen, wodurch ein stark stereotypes Muster im ansonsten hepatozytenreichen Parenchym entsteht. Dieses Protokoll beschreibt die Pipeline für die Durchführung der Doppelharzguss-Mikrocomputertomographie oder "DUCT". DUCT beinhaltet die Injektion der Pfortader und des gemeinsamen Gallengangs mit zwei verschiedenen röntgenopaken Kunstharzen, gefolgt von einer Gewebefixierung. Die Qualitätskontrolle durch Die Reinigung eines Lappens oder der gesamten Leber mit einem optischen Clearing-Mittel ermöglicht ein Vorab-Screening von entsprechend injizierten Proben. Im zweiten Teil der DUCT-Pipeline kann ein Lappen oder die gesamte Leber für Mikro-Computertomographie (microCT) -Scans, (halb-)automatisierte Segmentierung und 3D-Rendering der portalvenösen und biliären Netzwerke verwendet werden. MicroCT führt zu 3D-Koordinatendaten für die beiden Harze, die sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Analyse der beiden Systeme und ihrer räumlichen Beziehung ermöglichen. DUCT kann auf postnatale und erwachsene Mausleber angewendet werden und kann weiter auf andere tubuläre Netzwerke ausgedehnt werden, beispielsweise auf vaskuläre Netzwerke und Atemwege in der Lunge.

Was ist zu tun Eine erfolgreiche Doppelharzeninjektion wird erreicht, wenn sowohl die intrahepatischen Gallengänge als auch das Gefäßsystem der Pfortader gut gefüllt sind. Als Qualitätskontrollschritt ermöglicht die Reinigung eines Lappens (z. B. des linken lateralen Lappens) die Überprüfung einer erfolgreichen Injektion, gefolgt von der Bildgebung von Lappen von Interesse. Der optisch gereinigte Lappen kann später mit microCT gescannt werden; Somit ist es möglich, die gesamte Leber optisch zu reinigen. In gut injizierter Mausleber sollte das Gefäßsystem der Pfortader mit Harz gefüllt werden, bis die Leberperipherie und das Harz in Seitenästen sichtbar sein sollten (Abbildung 4), und diese Architektur wird in gescannten und segmentierten microCT-Daten getreu rekapituliert. Darüber hinaus sollten gut injizierte intrahepatische Gallengänge neben den Hauptästen der Pfortader sichtbar sein, die sich fast bis zur Peripherie erstrecken, und Harz sollte in den wichtigsten Seitenästen sichtbar sein. Wenn der Kontrolllappen den Qualitätskontrollschritt besteht, können die Lappen von Interesse (einschließlich des optisch abgefertigten) mit microCT gescannt werden. Das Ergebnis der segmentierten Daten aus einer gut injizierten Leber ist für eine P15-Maus (Abbildung 4A,B) und eine erwachsene Maus (Abbildung 4C,D) dargestellt.
Was nicht zu tun ist Intaktes Lebergewebe ist Voraussetzung für eine erfolgreiche Injektion. Seien Sie besonders vorsichtig, wenn Sie die Bauchhöhle und das Zwerchfell schneiden, um das Lebergewebe nicht versehentlich zu nicken. Wenn die Leber während dieses Eingriffs physisch geschädigt wird, tritt das Harz während der Injektion der Pfortader sehr wahrscheinlich aus (Abbildung 5A). Es ist nicht möglich, eine gute Injektion des Gefäßsystems zu erreichen, wenn die Leber körperlich geschädigt ist.
Einer der häufigsten Fehler ist die Unterfüllung der Leber mit Harz, was zu Herausforderungen bei der Visualisierung oder Analyse führen kann. Eine der Ursachen für die Unterfüllung des Systems ist eine vorzeitige Harzhärtung in der Nadel oder der Schlauchspitze, bevor die Injektion abgeschlossen ist (Abbildung 5B, blaue Pfeilspitzen, Klammern zeigen große Blasen). Eine gute Praxis ist es, einen Injektionssatz pro Tier zu verwenden und schnell zu arbeiten, nachdem das Härter dem Harz zugesetzt wurde. Wenn das Harz während der Injektion aushärtet (was durch ein halbgefülltes System beobachtet werden kann, hier veranschaulicht mit einem halb gefüllten Portalvenengefäß), entfernen Sie den Schlauch, schneiden Sie die Spitze des Schlauches ab (immer diagonal, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen) und drücken Sie den Kolben. Wenn das Harz wieder zu tropfen beginnt, setzen Sie den Schlauch vorsichtig wieder ein und sichern Sie ihn mit der Naht. Wenn das Harz in der Nadel ausgehärtet ist, ersetzen Sie den Schlauch vollständig, füllen Sie ihn mit Harz (vermeiden Sie Blasen), führen Sie den Schlauch vorsichtig wieder ein und befestigen Sie ihn mit der Naht. Es kann schwierig sein, den Schlauch zu ersetzen, insbesondere bei jungen postnatalen Mäusen <P30, da das Gewebe zerbrechlicher ist. Eine weitere Ursache für eine schlechte Harzfüllung des Gefäßsystems der Pfortader kann eine unzureichende transkardiale Perfusion sein (Abbildung 5C, blaue Pfeilspitzen bezeichnen Blut, das in terminalen Ästen sichtbar ist). Dies kann beobachtet werden, wenn die Spitzen der Gefäße mit Blut anstelle von Harz gefüllt sind. Um dies zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Pfortader (außerhalb der Leber) vor der Injektion kein Blut enthält. Die dritte Ursache für eine untergefüllte Leber ist, wenn der Schlauch zu tief in die Leber eingeführt wird und in einen Ast in Richtung eines der Lappen eintritt. Um dies zu verhindern, führen Sie den Schlauch mindestens 0,5 cm vom Eingang in die Leber ein.
Umgekehrt werden eines oder beide Systeme mit Harz überfüllt (Abbildung 5D). Es ist notwendig, die Leber während der Injektion visuell zu überwachen. Das Gießen von Gallensystemen mit Harz ist eine größere Herausforderung als das Gießen von Pfortaderharz, da harzgefüllte Kanäle auf der Leberoberfläche nur schwach sichtbar sind und es schwierig ist zu beurteilen, wann das System fast voll ist und wann es gestoppt werden muss. Wenn kleine gelbe Harzpunkte auf der Leberoberfläche erscheinen (Abbildung 2Ci, blaue Pfeilspitze), ist dies ein Zeichen dafür, dass das Gallensystem vollständig gefüllt ist und das Harz aus den Kanälen austritt. Kleinere Harzleckagen können während der microCT-Datensegmentierung manuell korrigiert werden (Abbildung 5D, rechte Panels).
Wenn der Injektionsdruck zu hoch ist, kann dies dazu führen, dass Gefäße oder Kanäle reißen (Abbildung 5E), wodurch die Behälter- oder Kanalarchitektur irreversibel beschädigt wird. Die Leber ist nicht für microCT-Scans oder -Analysen geeignet. Um eine Überfüllung des Harzes zu vermeiden, optimieren Sie in jedem Mausmodell das richtige Volumen und den richtigen Druck für die Injektion. Bei der Arbeit mit Mäusen, die mit einer toxischen Ernährung, genetischer Veränderung oder Leberschädigung, die das Gallen- oder Venensystem betrifft, oder Lebersteifigkeit konfrontiert wurden, müssen der Injektionsdruck und das Injektionsvolumen möglicherweise angepasst werden, da volumen- und druckverträglicher Druck sich von den Wildtypmäusen unterscheiden können. Dieses Protokoll beschreibt die manuelle Einspritzung der beiden Systeme, aber es ist möglich, die Spritze an eine Pumpe anzuschließen, um den Einspritzdruck zu standardisieren. Blasen sind ein weiteres sehr häufiges Injektionsartefakt, das zu einer spärlichen Füllung der röhrenförmigen Netzwerke führt (Abbildung 5F-H, blaue Pfeilspitzen). Um Blasenbildung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spritze und der Schlauch keine Blasen enthalten, vollständig mit Harz gefüllt sind und das Harz vor der Injektion von der Spitze des Schlauches tropft. Kleine Blasen, die als negative Bereiche auf den microCT-Daten erscheinen, können während der Nachbearbeitungsschritte manuell korrigiert werden, obwohl dies mühsam ist.
Frisch ist das Beste Die Verwendung von frischem gelbem Harz ist ein entscheidender Faktor, der den Kontrast der beiden Harze und die microCT-Datensegmentierung erheblich beeinflusst. Wenn das frisch geöffnete Harz verwendet wird (Abbildung 6A), besteht ein deutlicher Kontrastunterschied zwischen den gelben harzeinjizgespritzten Gallengängen (hellweiß) und den grünen harzinjizgespritzten Pfortadern (hellgrau). Leber, die mit frischem Harz injiziert wird, kann leicht mit automatisierter globaler Schwelle verarbeitet werden. Bei längerer Lagerung fällt das Harz aus und der Kontrast nimmt ab. Nach 3 Monaten Lagerung kann der Kontrast noch ausreichen, um die Pfortader vom Gallengang zu unterscheiden (Abbildung 6B), aber die Ausfällung beeinflusst die Vermischung der beiden Harze, was als heterogene Opazität in der gefüllten Pfortader sichtbar ist (Abb. 6B, blaue Pfeilspitzen). Heterogener Kontrast wirkt sich negativ auf die automatisierte Schwelle aus und erfordert manuelle Korrekturen, was die Bearbeitungszeit erhöht. Ist das Harz älter als sechs Monate, hat sich der Kontrast bis zu einem Punkt abgebaut, an dem es nicht möglich ist, den gelb injizierten Gallengang allein anhand ihres Kontrastes von der grün injizierten Pfortader zu unterscheiden (Abbildung 6C). In diesem Fall müssen der Gallengang und die Pfortader manuell basierend auf ihrem Durchmesser und ihrer Position im Hilarbereich segmentiert und manuell durch die gesamten microCT-Daten verfolgt werden. Dieses Verfahren ist äußerst zeitaufwendig und wird am besten vermieden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> Abbildung 1: Injektionsset für Harzguss. (A) Injektionsset Nr. 1 besteht aus einer 30 G Nadel und einem PE10-Schlauch, der ~30 cm lang ist. Das Injektionsset #2 besteht aus einer 23 G Nadel und einem PE50-Schlauch mit einer Länge von ~30 cm. (B) Die Spitze des Schlauches wird in einem Winkel gestreckt und geschnitten, um eine abgeschrägte Spitze zu erzeugen. Das Lineal in A und B ist ein Zentimeterlineal mit großen Schritten von 1 cm, Zwischenschritten von 5 mm und kleinen Schritten von 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> Abbildung 2: Flussdiagramm des Doppelharzgusses. (A) Schematische Darstellung des mausinen venösen Kreislaufsystems und des Herzens mit hervorgehobenem rechten Vorhof, der vor der Durchblutung weggeschnitten werden sollte, und des linken Ventrikels, in den die Nadel zur Perfusion eingeführt werden sollte, um das Blut aus dem Kreislaufsystem zu waschen. Die untere Hohlvene sollte unter den Nieren durchtrennt werden, um den Gefäßdruck zu entlasten. (B) Flussdiagramm für die Injektion von Gallengangsharz. (i) Zoombild von (A) mit der Darstellung, wo der IVC durchtrennt werden soll. (ii) Bild, das den gemeinsamen Gallengang (gelbe gepunktete Linie) von der Leber-Hilar-Region bis zum Schließmuskel von Oddi (schwarze Pfeilspitzen) darstellt, mit Nahtfaden unter dem gereinigten gemeinsamen Gallengang. (iii) Geeignete Position für losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang. (iv) Die gelbe gepunktete Linie und die schwarzen Pfeilspitzen beschriften den Schließmuskel von Oddi und zeigen den schrägen Winkel für den Schnitt und wie die Öffnung nach dem schrägen Winkelschnitt aussehen soll. (v) Schematische Darstellung der Orientierung der PE10-Rohrfasenöffnung (nach oben) beim Einsetzen. vi) Aussehen des eingespritzten gelben Harzes; Harz sollte den lose gebundenen Knoten leicht passieren. IVC, untere Hohlvene; CBD, gemeinsamer Gallengang. (C) Flussdiagramm zur Injektion von Pfortaderharz. (i) Die grün gepunktete Linie markiert die Pfortader aus der Hilarregion. Die blauen Pfeilspitzen beschriften das überfüllte Gallensystem. (ii) Geeignete Stelle für losen Überhandknoten um die Pfortader. (iii) Schematische Darstellung der Fasenöffnung (nach oben) beim Einsetzen. iv) Aussehen der Leber bei Injektion von grünem Harz und gelbem Harz; Beachten Sie das harzgefüllte Blutgefäß in der Leberperipherie. PV, Pfortader. Abbildung 2A wurde mit Biorender.com erstellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> Abbildung 3: Mikro-CT-Datenverarbeitung in Volumengrafiksoftware. (A) Oberflächenbestimmung, (i) überschätzter Isowert (aktuelle Vorschau der Auswahl ist in gelber Farbe dargestellt), (ii) unterschätzter Isowert, (iii) optimale Auswahl des Isowertes zur richtigen Oberflächenbestimmung von Pfortader und Gallengängen. (B) Aufteilung des interessierenden Bereichs (ROI), der durch Oberflächenbestimmung erstellt wird, (i) Setzen Sie den Wert im Dialogfenster so hoch, dass nur ein Segment (das größte) übrig bleibt, (ii) in gelben Rahmen werden die kleineren (ausgeschlossenen) Partikel angezeigt. (C) Oberflächenglättung der Daten, (i) Glättungsfunktion befindet sich im linken Bereich, (ii) Einstellung der Glättungsstärke auf 1 (max. 2) und Erstellung eines neuen geglätteten ROI, (iii) geglättete Daten. (D) Trennung einzelner röhrenförmiger Systeme, (i) in der Oberflächenbestimmungsfunktion den Isowert so einstellen, dass nur das Gallensystem in die Auswahl einbezogen wird (die aktuelle Vorschau der Auswahl wird in gelber Farbe angezeigt), (ii) den ROI beider Systeme und den ROI nur des Gallensystems markieren und den ROI des Gallensystems vom ROI beider Systeme subtrahieren, iii) Vena portal in grau dargestellt, das Gallensystem grün dargestellt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> Abbildung 4: Gut injizierte Gallengangs- (BD) und Pfortader- (PV)-Systeme. (A) Optisch gereinigter rechter medialer Lappen (RML) der leber nach dem 15. Tag (P15), injiziert mit zwei Harzen in die beiden Systeme. Maßstabsbalken 1 mm. (B) 3D-Rendering von P15 RML gezeigt in (A) Darstellung der Pfortader-Vaskulatur in Weiß und des Gallensystems in Grün. Maßstabsleiste 1 mm. (C) Optisch gereinigtes RML von erwachsener Leber, injiziert mit zwei Harzen in die beiden Systeme. Maßstabsbalken 1 mm. (D) 3D-Rendering von RML für Erwachsene, dargestellt in (C) Darstellung des Gefäßsystems der Pfortader in Weiß und des Gallensystems in Grün. H = Hilar, P = Peripherie. Maßstabsleiste 1 mm. Die Paneele A, B, D werden mit Genehmigung von Hankeova et al.9 angepasst. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> Abbildung 5: Häufige Herausforderungen bei Doppeltharz-Leberinjektionen. (A) Das Bild zeigt eine Leber, die während der anfänglichen Öffnung der Bauchhöhle versehentlich eingenickt wurde und das Harz durch den Schnitt austritt (blaue Pfeilspitze). (B) Schlecht injiziertes Pfortadersystem aufgrund von Harzhärtung. Blaue Pfeilspitzen kennzeichnen leere Terminalzweige und rote Klammern kennzeichnen große Blasen. Schuppenbalken 1 mm. (C) Schlecht injiziertes Pfortadersystem aufgrund einer schlechten transkardialen Perfusion. Blaue Pfeilspitzen beschriften Blut, das in den Terminalzweigen sichtbar ist. Mensurstab 1 mm. (D) Überfülltes Gallensystem, das sich in isolierten Harzkugeln manifestiert. Die linken Felder zeigen die optisch gereinigte Leber und die rechten Felder zeigen das gerenderte 3D-microCT-Bild. Die blau gepunkteten Umrisse stellen Zoom-In-Bereiche dar. Die schwarzen Pfeilspitzen markieren einen Teil der Leber, der während der optischen Reinigung nach dem microCT-Scannen beschädigt wurde. Skalenbalken 1 mm. (E) Hoher Druck während der Harzinjektion kann zu einem Bruch der Pfortader führen (das Tier in diesem Panel trägt eine Jag1H268Q-Mutation), die durch blaue Pfeilspitzen gekennzeichnet ist. Mensurbalken 1 mm. (F) Blasen im Harz während der Pfortaderinjektion (blaue Pfeilspitzen) und (G) Gallensysteminjektion (blaue Pfeilspitze), Mensur 1 mm. (H) MicroCT-Scan von Blasen (blaue Pfeilspitze), schlecht gefüllten Terminalzweigen (rote Klammern) und Harzleckage (gelbe Pfeilspitze), Mensur 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> Abbildung 6: Differentieller Harzkontrast. (A) Frisch geöffnetes gelbes Harz erzeugt einen ausreichenden Kontrast, um harzgespritzte Pfortader (grau) und Gallengänge (weiß) zu unterscheiden. (B) Eine dreimonatige Lagerung von gelbem Harz führt zu einer Ausfällung des Harzes, was zu einer heterogenen Opazität führt (grau-weiße Pfortader, blaue Pfeilspitze). (C) Eine längere Lagerung (>6 Monate) von gelbem Harz verringert den Kontrast zwischen der Pfortader (grau) und den Gallengängen (grau). Maßstabsleiste 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Die Doppelharzguss-Mikrocomputertomographie (DUCT) ermöglicht die Visualisierung, Digitalisierung und Segmentierung von zwei röhrenförmigen Systemen gleichzeitig, um die 3D-Analyse der Organarchitektur zu erleichtern. DUCT kombiniert die Ex-vivo-Injektion von zwei röntgenopaken Harzen, gefolgt von Mikro-Computertomographie-Scanning und Segmentierung der tomographischen Daten.

DUCT: Doppelharzguss mit anschließender Mikro-Computertomographie zur 3D-Leberanalyse

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Diese Methode ermöglicht es uns, die Architektur der Lebergefäß- und Gallensysteme in 3D zu analysieren, zu visualisieren und zu quantifizieren. Wir können jetzt die räumlichen Aspekte von Lebererkrankungen und Regeneration besser verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht auf die Existenz von Antikörpern oder Fluoreszenzbildgebung angewiesen ist.Es ermöglicht auch eine direkte Visualisierung, welche Netzwerke richtig lumenisiert sind. Diese Methode eignet sich für die Analyse von röhrenförmigen Systemen, daher sind die Erforschung von Blutgefäßen, Gallengängen und Atemwegen ideale Bereiche. Wir haben DUCT verwendet, um die strukturellen Veränderungen im Zusammenhang mit der Gallenregeneration zu verstehen.Bevor Sie Harz in das Gallensystem der Maus injizieren, beginnen Sie, den Darm und die Bauchspeicheldrüse auf die linke Seite der Maus zu bewegen, indem Sie ein mit PBS benetztes Wattestäbchen verwenden, um den gemeinsamen Gallengang und die Pfortader freizulegen. Dann machen Sie einen kleinen transversalen Schnitt in der unteren Hohlvene. Drehen Sie die ventrale Seite der Leber in Richtung Herz, um die viszerale Oberfläche und die Hilarregion freizulegen, und lokalisieren Sie den gemeinsamen Gallengang, der von der Hilarregion über die Bauchspeicheldrüse und in den Darm am Schließmuskel von Oddi verläuft.Verwenden Sie die gerade Pinzette, um den umgebenden Gewebebereich von etwa fünf Millimetern vom gemeinsamen Gallengang zu entfernen. Dann, indem Sie einen Seidennahtfaden unter den gemeinsamen Gallengang legen, binden Sie einen losen Überhandknoten um den gemeinsamen Gallengang. Halten Sie die Federschere flach gegen den gemeinsamen Gallengang, um einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang an der Stelle zu machen, an der der gemeinsame Gallengang neben dem Schließmuskel von Oddi in die Bauchspeicheldrüse und den Darm gelangt.Als nächstes mischen Sie einen Milliliter des gelben Harzes mit 50 Mikrolitern des MV-Härters und füllen sie eine Ein-Milliliter-Luer-Spritze mit der Harzhärtermischung. Verbinden Sie die gefüllte Spritze mit dem ersten Schlauchset und drücken Sie den Kolben, um den Schlauch zu füllen, bis die Harzhärtemittelmischung von der Spitze des Schlauches tropft. Verwenden Sie die Pinzette, um den Bereich um den gemeinsamen Gallengangsschnitt zu begradigen.Vor dem Einführen des Schlauches in die Öffnung im gemeinsamen Gallengang mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze nach unten zur dorsalen Seite des Gallengangs. Ziehen Sie dann den Seidenfadenknoten fest, um den Schlauch im gemeinsamen Gallengang zu sichern. Nachdem Sie das Harz in den gemeinsamen Gallengang injiziert haben, beobachten Sie die Gallenblase und die einzelnen Leberlappen.Massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz gleichmäßig zu verteilen. Harzgefüllte Gallengänge Terminaläste werden an der Leberoberfläche schwach sichtbar sein. Hören Sie auf, das Harz zu injizieren, wenn Harzpunkte an der Oberfläche der Leber erscheinen oder wenn widerstanden wird.Entfernen Sie dann den Schlauch, indem Sie ihn aus dem gemeinsamen Gallengang herausziehen und den Seidenknoten schnell mit einer Pinzette festziehen, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Schneiden Sie die losen Enden der Seidennaht ab, damit sie die Injektion der Pfortader nicht beeinträchtigen. Bevor Sie das Harz in die Pfortader injizieren, entfernen Sie die Pfortader mit einer geraden Pinzette etwa zwei Zentimeter vor ihrem Eintritt in die Leber aus ihrem umgebenden Gewebe.Legen Sie dann den Seidennahtfaden unter den geräumten Bereich der Pfortader, um einen losen Überhandknoten zu binden. Machen Sie in der Pfortader distal zur Leber einen Längsschnitt, bevor Sie den Knoten binden. Als nächstes bereiten Sie die grüne Harzhärtermischung in der Spritze vor und füllen Sie den Schlauch wie zuvor gezeigt mit der Mischung.Verwenden Sie die Pinzette, um die Pfortader zu begradigen, indem Sie das umgebende Gewebe zur Schwanzseite ziehen, bevor Sie den Schlauch mit der längsten Kante der abgeschrägten Spitze in Richtung der Dorsalseite des Gefäßes einführen. Ziehen Sie den Seidenfaden fest, um den Schlauch in der Pfortader zu sichern. Nachdem Sie das Harz in die Pfortader injiziert haben, beobachten Sie, wie sich die Blutgefäße mit Harz füllen, und massieren Sie die Leber mit einem PBS-benetzten Wattestäbchen, um das Harz zu verteilen.Wenn alle Blutgefäße gefüllt sind, ziehen Sie den Schlauch aus der Pfortader heraus und ziehen Sie den Seidenknoten schnell mit einer Pinzzange fest, um zu verhindern, dass das Harz austritt. Für die Mikrocomputertomographie oder den MicroCT-Scan der von der Maus zerlegten Leber legen Sie den rechten medialen Leberlappen in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und füllen Sie das Röhrchen mit 1% Agarosegel auf etwa zwei Drittel des Gesamtvolumens des Röhrchens, um unerwünschte Probenbewegungen während der MicroCT-Messung zu minimieren. Montieren Sie das konische 15-Milliliter-Rohr mit der Probe auf der Rotationsstufe eines CT-Geräts.Lassen Sie das Rohr mindestens eine Stunde lang thermisch an die Messkammer anpassen. Wenn die Probe thermisch angepasst ist, zentrieren Sie sie im Sichtfeld oder Sichtfeld und optimieren Sie dann die Entfernungen der Quellprobe und des Probendetektors oder SSD und SDD, um eine ausreichende Voxelauflösung zu erreichen. Sobald die Parameter eingestellt sind, starten Sie eine CT-Messung.Verwenden Sie eine spezielle tomographische Rekonstruktionssoftware, um die CT-Daten zu rekonstruieren. Um die CT-Daten zu analysieren, laden Sie die Dateien, indem Sie Datei, Import und Befehl auswählen. Verwenden Sie die Oberflächenbestimmungsfunktion auf der Oberseite, um das Harz in den Daten mithilfe der globalen Schwellenwerte zu segmentieren.Bestimmen Sie im Dialogfenster den Schwellenwert mit der Histogrammauswertung, indem Sie die Position der roten Isowertlinie so einstellen, dass nur die harzgefüllten Behälter segmentiert werden. Wählen Sie im linken Bereich das Modul ROI aus Volumen oder CAD oder Mesh erstellen aus, um eine Region von Interesse oder einen ROI der mit Harz gefüllten Behälter zu erstellen. Verwenden Sie im Dialogfenster die Option ROIs aus Volumenkörper erstellen, um den Namen des verarbeiteten Volumes auszuwählen und zu bestätigen.Eliminieren Sie fehlerhafte Segmentierungen von Rauschclustern im Hintergrundbereich dieses ROI. Markieren Sie den ROI im rechten Bereich, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken und den Split ROI des Moduls auswählen. Stellen Sie im Dialogfenster den Voxel-Parameter minimale Lautstärke ein, um alle Rauschpartikel auszuschließen.Der Parameterwert ist experiment- und datenabhängig und für jede zu analysierende Probe optimiert. Verwenden Sie auf der linken Seite das Glättungsmodul, um glatte, kontinuierliche und feste Kanalmasken ohne Artefakte zu erstellen, wie das Vorhandensein von Luftblasen oder Harzleckagen in den Harzkosten ROI. Erstellen Sie einen separaten ROI wie zuvor beschrieben für das System, das mit dem absorbierenderen Harz gefüllt ist, wie das gelbe Harz, das für die übliche Gallenganginjektion mit höheren Intensitätswerten in den CT-Daten verwendet wird.Markieren und maskieren Sie den neuen ROI, indem Sie mit der rechten Maustaste klicken, bevor Sie ROIs subtrahieren und dann den neuen ROI vom ROI der Harzmaske subtrahieren, um einen neuen ROI für das verbleibende Rohrsystem zu erstellen. Exportieren Sie die resultierenden ROIs für beide Rohrsysteme in verschiedenen Formaten basierend auf Bedienerreferenzen für die anschließende Verarbeitung in unterschiedlicher Software. Verarbeiten Sie die resultierenden ROIs in einer Volumengrafiksoftware weiter, um die endgültige Visualisierung in Form eines Bildes oder eines Videos zu exportieren.In dieser Studie wurde eine erfolgreiche Doppelharzinjektion mit gut gefüllten intrahepatischen Gallengängen und Pfortadergefäßen erreicht. Die repräsentative Analyse veranschaulicht das Ergebnis der segmentierten Daten einer gut injizierten Leber für eine P15-Maus und eine erwachsene Maus, bei der Harz in den Seitenästen sichtbar ist. Im typischen Beispiel einer erfolglosen Injektion führte eine körperliche Schädigung der Leber während des chirurgischen Eingriffs dazu, dass das Harz austrat.Auch die vorzeitige Aushärtung des Harzes in der Nadel oder der Spitze des Schlauches vor der Injektion und die unzureichende transkardiale Perfusion verursachten eine Systemunterfüllung. Die geringfügige Harzleckage konnte während der MicroCT-Datensegmentierung manuell korrigiert werden. Hoher Injektionsdruck könnte Gefäße oder Kanäle reißen und das Gefäß oder die Kanalarchitektur irreversibel beschädigen.Darüber hinaus waren die Blasen ein weiteres sehr häufiges Injektionsartefakt, das zur spärlichen Füllung der röhrenförmigen Netzwerke führte. Bei der Verwendung von frisch geöffnetem Harz wurde ein deutlicher Unterschied im Kontrast zwischen den gelben harzeinjizgespritzten Gallengängen und den mit grünem Harz injizierten Pfortadern beobachtet. Nach dreimonatiger Lagerung reichte der Kontrast aus, um die Pfortader vom Gallengang zu unterscheiden.Die Ausfällung wirkte sich jedoch auf die Vermischung der beiden Harze aus, was als heterogene Opazität in der gefüllten Pfortader sichtbar war. Als das Harz älter als sechs Monate war, verschlechterte sich der Kontrast bis zu einem Punkt, an dem es nicht möglich war, den gelb injizierten Gallengang allein aufgrund ihres Kontrastes von der grün injizierten Pfortader zu unterscheiden. Es ist wichtig, einen schrägen Schnitt in den gemeinsamen Gallengang zu machen.Andernfalls wird es sehr schwierig sein, den Schlauch einzuführen. Die DUCT-Technik beleuchtet neue architektonische Mechanismen der Gallenregeneration in einem klinisch relevanten Modell mit ausgeprägten Merkmalen in den Hilar- und Peripherielappenregionen.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Retrograde Perfusion und Abfüllung von Maus Koronargefäße als Vorbereitung für die Mikro-Computertomographie Imaging

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

Forschung

Medizin

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Dimensional Resin Casting und Imaging of Mouse Pfortader oder intrahepatische Gallengang-System

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Osmotic Drug Delivery zu ischämischen Hinterbeine und Perfusion von Blutgefäßen mit Microfil für Mikro-Computertomographie

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Gallengang-Ligation in Mice: Induktion von Entzündungsleber-Verletzung und Fibrose von obstruktiver Cholestase

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Mit Micro-Computertomographie-zur Beurteilung der Tumorentwicklung und Follow-up der Reaktion auf die Behandlung in einem Maus-Modell von Lungenkrebs

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Kombinierte Near-Infrarot-Fluoreszenz-Bildgebung und Mikrocomputertomographie für Direkt Visualizing Cerebral Thromboembolie

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

Testen von Acetylcholin gefolgt von Adenosin zur invasiven Diagnose von koronaren vasomotorischen Störungen

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Gewebepräparationstechniken für die kontrastverstärkte Mikro-Computertomographie-Bildgebung von Herzmodellen großer Säugetiere mit chronischen Erkrankungen

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Bewertung der trabekulären Knochenmikroarchitektur in einem Osteoporose-Mausmodell

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...