Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

אנו מודים לקארי הופרט וסטייסי הופרט על המומחיות והעזרה שלהם בנוגע לצינורות המרה והאירוח במעבדה שלהם. אנו מודים גם לנדיה שולץ ושרלוט ל. מאטסון על עזרתן בצינור צינור המרה המשותף.
אנו מודים לסוכנויות הענק הבאות על תמיכתן:
לעבודה במעבדת ERA: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), שטוקהולם לאנס לנדסטינג (CIMED (2-538/2014-29)), רגנאר סודרברגס סטיפלסה (מענק ההתחלה של הקרן השבדית), האגודה האירופית לחקר הכבד (פרס דניאל אלגיל), קרן הלב-לונג השבדית (20170723) ו-Vetenskapsrådet (2019-01350).
לעבודה במעבדת JK: אנו מכירים בתשתית המחקר CzechNanoLab הנתמכת על ידי MEYS CR (LM2018110). J.K. הודות לתמיכתו של מענק FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

פרויקט נפרד במעבדת ERA ממומן על ידי ModeRNA. ל- ModeRNA לא היה תפקיד בפרוייקט/פרוטוקול המתוארים כאן.

מספר שלבים קריטיים קובעים הצלחה DUCT, מהכנה לדוגמה לפרמטרים של התקן CT. כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר, יש להשתמש בשרף מנוגד היטב, מוזרק היטב וללא בועות כדי לאפשר עיבוד דיגיטלי פשוט עם סף אוטומטי כדי להשיג נתונים תלת-ממדיים, תמונות וסרטים. עם אימון ועקבות פרוטוקול זה, 90% של זריקות מוצלחות וכתוצאה מכך נתונים לשחזור. חשוב להשתמש שרף צהוב טרי כדי להשיג את הניגוד הטוב ביותר בין שתי מערכות מוזרק. לשרף הצהוב יש רדיו-תחלואה חזקה מאוד, בעוד שלשרף הכחול יש רדיו-תחלואה בלתי ניתנת לגילוי. התוצאות המובילות מושגות בשלושת החודשים הראשונים לאחר פתיחת בקבוק שרף צהוב חדש. עם הזמן, שרף מזרז, ולאחר אחסון ארוך יותר (>6 חודשים), את השרף הצהוב והירוק כבר לא יהיה להבחין בסריקות CT. תמונות עם ניגודיות לקויה מחייבות מעקב ידני נרחב וגוזל זמן רב וסגמנטציה של שתי המערכות. הבא, צינורות מתוחים היטב הוא הכרחי כדי להתאים לתוך צינור המרה המשותף של עכברים בוגרים צינור מרה משותף וריד פורטל של עכברים לאחר ה לידתי. נקודת הכניסה של הזריקה חייבת להיווצר בזהירות. אם צינור המרה המשותף נחתך לרוחב, סביר להניח שהוא יתנתק מהרקמה שמסביב, ולמנוע כניסה מוצלחת של הצינורות. שלב זה עדין במיוחד לעכברים לאחר הלידה שבה צינור המרה המשותף נסוג ו"מתכרבל "אם הוא התנתק מהרקמה הסובבת אותו, מה שהופך את החדרת הצינורות למאתגרת ביותר. הכניסה הנפוצה צינור המרה והזרקה עשוי לדרוש קצת תרגול. בעת הכנת הצינורות עם שרף ולאורך כל ההזרקה, הימנע היווצרות בועה כמו בועות ייצרו מרחב שלילי בתמונות CT ודורשים זמן רב תיקון ידני. חשוב לעסות בעדינות את הכבד על ידי גלגול על פני השטח שלו עם צמר גפן רטוב במהלך ואחרי הליך ההזרקה כמו זה מקל אפילו שרף מתפשט. לאחר השלמת הזרקה והסרת הצינורות, יש להדק את קשר תפר המשי במהירות ובזהירות, כך שהשרף אינו זורם מהכבד לפני שהוא מתמלא לחלוטין. עבור הדמיית microCT מוצלחת, המדגם חייב להיות קבוע כראוי במקום עם agarose ו מותאם תרמית כדי לחסל ממצאי תנועה בנתוני CT. הגדרות הרכישה הן גם בעלי חשיבות מרכזית, אשר צריך להיות אופטימיזציה כדי להגיע לפתרון מרחבי הולם כדי לפתור מבנים בסדר.
שינויים טכניים בהליך ההזרקה ניתן לבצע כדי להשיג הזרקה בעכברים צעירים. נכון לעכשיו, יציקת שרף של כבדי עכבר צעירים מוגבלת על ידי הזמינות של צינורות דקים מספיק, עם PE10 להיות הצינורות המסחריים הזמינים הקטן ביותר. Tanimizu ואח ' הזריק בהצלחה דיו פחמן לתוך יום עוברי 17 (E17) צינור מרה משותף באמצעות נימי זכוכית11. בדיקה עתידית אם שרף יכול להיות מועבר באמצעות נימי זכוכית ולכן יהיה עניין. DUCT הותאם עוד יותר להזרקת מערכות צינוריות אחרות כגון דרכי הנשימה ו vasculature עורק הריאות של הריאות9. הזרקת שרף כפול יכול גם להיות שונה כדי לשמש עם צפים אחרים זמינים מסחרית, או פרוטוקול זה יכול לשמש עבור זריקות עם דיו פחמן.
אחד הגורמים המגבילים העיקריים של צינור צינור הוא צמיגות שרף. צינור יכול לשמש רק עבור יציקת שרף של מבנים צינוריים מעל קוטר של 5 מיקרומטר. בערכת נתונים זו, השרף יכול לחדור צינורות עם הקוטר הקטן ביותר של 5μm9. מגבלת גודל זו מונעת ניתוח של ductules בסדר נימים קטנים. כדי לקדם עוד יותר את צינור DUCT לכלי קליבר קטנים יותר, שרפים אחרים הזמינים מסחרית צריכים להיבדק, או פיתוח של סוכני רדיו-צמיגות נמוכה חדשים עשוי לשפר את חדירת לומן.
ב Hankeova et al.9, DUCT הושווה לשתי טכניקות נפוצות אחרות, זריקות דיו פחמן כפול ואחריו ניקוי רקמות וצילום סטנדרטי, ו- iDISCO + עם כתמים של כלי הדם עם אקטין תא שריר חלק אלפא צינורות מרה עם ציטוקרטין 7, ואחריו הדמיה 3D9. DUCT השיג ביצועים טובים יותר משתי השיטות האחרות במונחים של ניתוח כפול (שהיה מאתגר עבור iDISCO+ עקב אוטופלואורסצנטיות כבד גבוהה), הדמיה תלת-ממדית וכימות (לא אפשרי עם הזרקת דיו פחמן), ולומניזציה (DUCT מספק נתונים עבור ארכיטקטורת לומן הפנימית זלוף המערכת). כפי שהוזכר לעיל, המגבלה העיקרית של DUCT היא גודל לומן המינימלי שניתן להזריק וניתוח (מגבלת 5 מיקרומטר), פרמטר שבו הן הזרקת דיו פחמן ו- iDISCO + ביצעו טוב יותר. DUCT עדיף על יציקת שרף מערכת אחת3,5,6 מכיוון שהוא מאפשר ניתוח של כל מערכת מוזרקת בנפרד וגם מאפשר חקירה תלת-ממדית כפולה כדי לחקור את היחסים האדריכליים בין שתי המערכות.
צינור ניתן להחיל כדי ללמוד כל שתי רשתות צינוריות בתלת-ממד. כהוכחה לעיקרון, DUCT שימש כדי לדמיין את מערכות ורידי המרה הכבד ואת עורק הריאות vasculature ודרכי הנשימה בריאות9. צינורות המרה התוך-היפים מתפתחים בסמוך לווריד הפורטל, וריד הפורטל מספק תבנית מבנית ומרכז איתות המסדיר את הצמיחה וההבחנה של עץ המרה12. ב Hankeova ואח '9, DUCT חקר התחדשות מרה במודל עכבר עבור מחלת הילדים האנושית תסמונת Alagille. DUCT חשף מנגנונים אדריכליים שלא דווחו בעבר שמערכת המרה השתמשה בהם כדי להשיג נפח דמוי סוג פראי9. עכברי תסמונת אלג'יל השתמשו בשתי אסטרטגיות שונות: (1) באזורים הילאר והמרכזיים של הכבד, מערכת המרה הגדילה את הסתעפותה, ו -(2) בפריפריה הכבדית, צינורות המרה שנוצרו על ידי דה נובו היו עינויים מאוד. שני גורמים אלה יחד כדי להניב נפח מערכת מרה כמעט נורמלי, למרות הארכיטקטורה החריגה. יתר על כן, DUCT זיהה הסתעפות צינור מרה חריג שהתרחש ללא תלות של הסתעפות וריד הפורטל צינורות מרה להרכיב גשרים מחברים בין שני ורידים פורטל9. פנוטיפים אלה יהיה בלתי אפשרי לזהות יציקת שרף יחיד יכול להתפרש לא נכון בחלקים היסתולוגיים 2D כמו התפשטות צינור המרה. כך מספק DUCT נתונים המתארים את הארכיטקטורה התלת-ממדית של שתי רשתות צינוריות בכל רמת האיבר או האונה עם אפשרות לניתוח כמותי איכותי ומעמיק. DUCT יכול להיות תקן חדש להתפתחות כבד לאחר הולדתי ניתוחי התחדשות הכבד במודלים שונים של בעלי חיים.

יציקת שרף איברים היא טכניקה שתחילתה במאה ה -171. אחת הדוגמאות הראשונות של יציקת שרף מודרני בוצעה על הכבד האנושי מנתיחה שלאחר המוות. צינורות מרה תוך-הפטיים היו מלאים בסוכן ניגודיות מעורבב עם ג'לטין, ואחריו הדמיה עם סריקת CT רנטגן2. מטרת טכניקת DUCT היא לדמיין, להפוך את הדיגיטציה ולנתח שתי רשתות יצוקות שרף צינוריות, בד בבד, בתלת-ממד.
DUCT מבוסס על הידע הקיים הנרחב של יציקת שרף כבד חד-מערכתית3,4,5,6,7,8 וממשיך להדמיה וניתוח תלת-ממדיים בו זמנית של שתי מערכות9. DUCT מתקדם יציקת שרף יחיד יציקת שרף כפול על ידי ערבוב שני שרפים radiopaque של ניגודיות שונה והזרקת שרפים אלה לשתי רשתות שונות, במיוחד צינור המרה המשותף וריד הפורטל. צינור ניתן להחיל על עכברים צעירים לאחר ההולכה עם תוצאות לשחזור כבר ביום שלאחר ההולכה 15 (P15). בהשוואה לטכניקות הדמיה מבוססות מיקרוסקופיה, היתרון העיקרי הוא ש- DUCT מהיר יותר, נטול נוגדנים, ואוטפלואורסצנטיות של רקמת כבד אינה מפריעה להדמיה. יתר על כן, DUCT מספק נתונים כמותיים המתארים מצב לומן, קוטר פנימי, קישוריות רשת וחדירה. הבחנה בין נוכחות של תאים יוצרי לומן שלהם מורפוגנזה דה פקטו לתוך צינורות חיונית לניתוח איברים שבהם תאים צינוריים נוכחים אך אינם יוצרים צינורות, כפי שניתן במקרה בתסמונת Alagille10. החיסרון העיקרי של DUCT הוא החדירה המוגבלת של השרף, שהוא צמיג ואינו נכנס צינורות עם קליבר קטן (<5 מיקרומטר). צינור ניתן להחיל על כל מבנה צינורי לאחר קביעת נקודת הכניסה הזרקה, כגון מערכות הדם עורקים ורידים, דרכי הנשימה, צינור מרה חוץ-היפאטי, או כלי הלימפה. זה יכול להקל על ניתוח ארכיטקטורת איברים שלמה של רקמות אחרות כגון ריאות ולבלב.
ניתן לעבד תמונות מפולח MicroCT באמצעות תוכנת הדמיה זמינה מסחרית, כגון ImageJ, או צינורות שנכתבו בהתאמה אישית (למשל, MATLAB). ניתן לנתח את הכבד המוזרק בשרף באופן איכותי להרחבת הרשת ולקישוריות או כמותית לנפח, אורך, הסתעפות, טורטואוזיות של מערכת אחת, והאינטראקציה בין שתי מערכות כגון המרחק בין שתי מערכות, או תלות בסניפים (האם מערכת 1 מסתעפת בסמיכות למערכת 2 מסתעפת?). צינור DUCT הכולל הזרקת שרף, סריקת מיקרו-CT ופילוח נתוני CT, בשילוב עם ניתוח כמותי מפורט של מנגנונים אדריכליים של שתי מערכות צינוריות, יכול לספק תקן לניתוח כבד שלם במודלים של בעלי חיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

הכבד הוא האיבר הפנימי הגדול ביותר בבני אדם ועכברים, ופלואורסצנטיות אוטומטית גבוהה מהווה אתגר משמעותי להערכת הארכיטקטורה התלת ממדית (3D) של האיבר ברמת האיברים המלאים. ארכיטקטורת הכבד מאופיינת במספר מבנים מסועפים, אשר ניתן למלא שרף, כולל עצי כלי דם ומרה, יצירת דפוס סטריאוטיפי מאוד בפרנצ'ימה עשירה בהפטוציט אחרת. פרוטוקול זה מתאר את הצינור לביצוע טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת של יציקת שרף כפול, או "DUCT". DUCT כרוך בהזרקת וריד הפורטל וצינור המרה המשותף עם שני שרפים סינתטיים רדיופאק שונים, ואחריו קיבוע רקמות. בקרת איכות על ידי ניקוי אונה אחת, או הכבד כולו, עם חומר ניקוי אופטי, מאפשר הקרנה מראש של דגימות מוזרקות כראוי. בחלק השני של צינור DUCT, אונה או הכבד כולו יכול לשמש לסריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT), (חצי) פילוח אוטומטי ועיבוד תלת-ממדי של רשתות ורידים ומרה. MicroCT תוצאות 3D לתאם נתונים עבור שני השרפים המאפשרים ניתוח איכותי כמו גם כמותי של שתי המערכות ואת היחסים המרחביים שלהם. צינור ניתן להחיל על כבד עכבר לאחר ה לידה ומבוגר והוא יכול להיות מורחב עוד יותר לרשתות צינוריות אחרות, למשל, רשתות כלי דם ודמתי הנשימה בריאות.

Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

טומגוגרפיה מיקרו-ממוחשבת עם שרף כפול מאפשרת הדמיה, דיגיטציה וסגמנטציה של שתי מערכות צינוריות בו זמנית כדי להקל על ניתוח תלת-ממדי של ארכיטקטורת איברים. DUCT משלב הזרקת ex vivo של שני שרפים radiopaque ואחריו סריקת טומוגרפיה מיקרו ממוחשבת פילוח של הנתונים טומוגרפיים.

צינור: יציקת שרף כפול ואחריו טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת לניתוח כבד תלת-ממדי

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

שיטה זו מאפשרת לנו לנתח, לדמיין ולכומת ארכיטקטורת מערכות כלי דם ומרה בכבד בתלת-ממד. עכשיו אנחנו יכולים להבין טוב יותר את ההיבטים המרחביים של מחלת כבד והתחדשות. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא אינה מסתמכת על קיומם של נוגדנים או הדמיית פלואורסצנטיות.זה גם מאפשר הדמיה ישירה של אילו רשתות הם לומן כראוי. שיטה זו מתאימה לניתוח של מערכות צינוריות, ומכאן מחקר של כלי דם, צינורות מרה ודרכי הנשימה הם אזורים אידיאליים. השתמשנו ב- DUCT כדי להבין את השינויים המבניים הקשורים להתחדשות מרה.לפני הזרקת שרף לתוך מערכת המרה של העכבר, להתחיל להזיז את המעי והלבלב לצד שמאל של העכבר, באמצעות צמר גפן רטוב עם PBS לחשוף את צינור המרה המשותף וריד הפורטל. ואז לעשות חתירה רוחבית קטנה בצמח הוועד הנחות. הפוך את הצד הגחוני של הכבד לכיוון הלב כדי לחשוף את פני השטח הקרביים ואת אזור הילאר, ולאתר את צינור המרה המשותף העובר מאזור הילאר על פני הלבלב, לתוך המעי הסוגר של אודי.השתמש במלקחיים ישרים כדי לנקות את אזור הרקמה שמסביב של כחמישה מילימטרים מצינור המרה המשותף. לאחר מכן, על ידי הצבת חוט תיל משי מתחת לצינור המרה המשותף, לקשור קשר רופף overhand סביב צינור המרה המשותף. החזק את מספריים האביב שטוח נגד צינור המרה המשותף כדי להפוך חתך אלחפוס לצינור המרה המשותף במקום שבו צינור המרה המשותף נכנס הלבלב והמעי ליד הסוגר של אודי.לאחר מכן, מערבבים מיליליטר אחד של השרף הצהוב עם 50 מיקרוליטרים של חומר הריפוי MV, ולמלא מזרק luer מיליליטר אחד עם תערובת סוכן ריפוי שרף. חברו את המזרק המלא עם סט הצינורות, ולחצו על הבוכנה כדי למלא את הצינורות עד תערובת סוכן ריפוי השרף מטפטפת מקצה הצינורות. השתמש במלקחיים כדי ליישר את האזור סביב תרסיס צינור המרה המשותף.לפני החדרת הצינורות לתוך הפתח בצינור המרה המשותף עם הקצה הארוך ביותר של הקצה משופע כלפי מטה לכיוון הצד החוטי של צינור המרה. לאחר מכן הדק את קשר חוט המשי כדי לאבטח את הצינורות בתוך צינור המרה המשותף. לאחר הזרקת השרף לתוך צינור המרה המשותף, להתבונן בכיס המרה ואת אונות הכבד בודדים.יש לעסות את הכבד עם צמר גפן רטוב PBS כדי לעזור להפיץ את השרף באופן שווה. ענפי מסוף צינורות מרה מלאים שרף יהיו גלויים קלושים על פני הכבד. להפסיק להזריק את השרף כאשר נקודות של שרף מופיעים על פני השטח של הכבד או כאשר ההתנגדות מתקיימת.לאחר מכן להסיר את הצינורות על ידי משיכה של צינור המרה המשותף במהירות להדק את קשר המשי באמצעות מלקחיים כדי למנוע את השרף מדלוף החוצה. חותכים את הקצוות הרופפים של תפר המשי, כך שהם לא מפריעים להזרקת וריד הפורטל. לפני הזרקת השרף בווריד הפורטל, לנקות את וריד הפורטל מן הרקמה הסובבת אותו כשני סנטימטרים מכניסתו לכבד, באמצעות מלקחיים ישרים.לאחר מכן מניחים את חוט תפר המשי מתחת לאזור המנוקה של וריד הפורטל כדי לקשור קשר אוברה-יד רופף. בווריד השער דיסטל לכבד, לעשות פירוק אורך לפני קשירת הקשר. לאחר מכן, להכין את תערובת סוכן ריפוי שרף ירוק במזרק ולמלא את הצינורות עם התערובת כפי שהודגם בעבר.השתמש במלקחיים כדי ליישר את וריד הפורטל על ידי משיכת הרקמה שמסביב לכיוון צד הזנב לפני החדרת הצינורות עם הקצה הארוך ביותר של הקצה משופע לכיוון הצד האחורי של הכלי. הדק את חוט המשי כדי לאבטח את הצינורות בווריד השער. לאחר הזרקת השרף לווריד הפורטל, התבונן בכלי הדם המתמלאים שרף, ולעסות את הכבד עם ספוגית כותנה רטובה PBS כדי לעזור להפיץ את השרף.כאשר כל כלי הדם מלאים, לשלוף את הצינורות מן הווריד הפורטל, במהירות להדק את קשר המשי באמצעות מלקחיים כדי למנוע את השרף מדלוף החוצה. לטומוגרפיה ממוחשבת מיקרו או סריקת MicroCT של הכבד הניתח מהעכבר, הניחו את אונת הכבד המדיאלית הימנית בצינור חרוט של 15 מיליליטר, ומלאו את הצינור בג'ל 1%אגרוז לכשני שלישים מהנפח הכולל של הצינור כדי למזער את תנועת המדגם הלא רצויה במהלך מדידת MicroCT. הר את הצינור החרוט 15 מיליליטר עם המדגם על השלב הסיבובי של מכשיר CT.אפשר לצינור להסתגל תרמית לתא המדידה למשך שעה לפחות. כאשר המדגם מותאם תרמית, מרכז אותו בשדה הראייה או FOV, ולאחר מכן למטב את מדגם המקור ואת מרחקי גלאי מדגם, או SSD ו- SDD כדי להגיע לרזולוציה voxel מספיק. לאחר הגדרת הפרמטרים, התחל מדידת CT.השתמש בתוכנת שחזור טומוגרפית ייעודית כדי לשחזר את נתוני ה- CT. כדי לנתח את נתוני ה- CT, טען את הקבצים על-ידי בחירת קובץ, ייבוא ופקודה. השתמש בפונקציית קביעת פני השטח בחלונית העליונה כדי לפלח את השרף בנתונים באמצעות סף כללי.בחלון הדו-שיח, קבע את ערך הסף עם הערכת היסטוגרמה על-ידי הגדרת המיקום של קו isovalue האדום לפלח רק את כלי השיט המלאים בשרף. בחלונית הימנית, בחר במודול צור החזר על הוצאות על הוצאות מנפח או CAD או רשת מחדש כדי ליצור אזור עניין או החזר על הוצאות על הוצאות על כלי הדם המלאים שרף. בחלון הדו-שיח, השתמש באפשרות ליצור ROIs ממוצק כדי לבחור ולאשר את שם אמצעי האחסון המעובד.בטל פילוח שגוי של אשכולות רעש באזור הרקע של ROI זה. סמן את ההקלה על ההפרש בחלונית הימנית על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני ובחירת המודול לפצל את ההבגיה. בחלון הדו-שיח, הגדר את הפרמטר voxel אמצעי האחסון המינימלי כדי לא לכלול את כל חלקיקי הרעש.ערך הפרמטר הוא ניסוי ותלוי נתונים, וממוטב לניתוח כל דגימה. בלוח השמאלי השתמש במודול ההחלקה כדי ליצור מסכות תעלה חלקות, רציפה ומוצקות ללא חפצים, כמו נוכחות של בועות אוויר או דליפת שרף ב- ROI עלות השרף. צור החזר על הוצאות עלמה נפרד כפי שתואר קודם עבור המערכת מלא שרף ספיגה יותר כמו שרף צהוב המשמש להזרקת צינור המרה הנפוצה עם ערכים בעוצמה גבוהה יותר בנתוני CT.סמן ושרף להסוות את החזרה החדשה על ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני לפני בחירת הפחת החזר החזר על עסקה ולאחר מכן הפחתה של החזר ההחזרה החדש ממסכת השרף ROI כדי ליצור החזר על ROI חדש עבור המערכת הצינורית הנותרת. יצא את ה- ROIs המתקבל עבור שתי המערכות הצינוריות בפורמטים שונים בהתבסס על הפניות מפעיל לעיבוד עוקב בתוכנות שונות. תהליך נוסף של ההמחאות המתקבלות בתוכנת גרפיקה של אמצעי אחסון כדי לייצא את הפריט החזותי הסופי בצורה של תמונה או וידאו.במחקר זה, הזרקת שרף כפול מוצלח הושגה עם צינורות מרה intrahepatic מלא היטב, vasculature וריד הפורטל. הניתוח הייצוגי ממחיש את התוצאה של הנתונים המפולחים בכבד מוזרק היטב לעכבר P15, ועכבר בוגר שבו שרף נראה בענפים הצדדיים. בדוגמה האופיינית של הזרקה לא מוצלחת, נזק פיזי לכבד במהלך ההליך הכירורגי הביא לדליפת השרף.גם התקשות מוקדמת של השרף במחט או קצה הצינורות לפני ההזרקה, ואת זלוף עירוי לא מספיק גרם למערכת תת מילוי. ניתן לתקן באופן ידני את דליפת השרף המשנית במהלך פילוח נתוני MicroCT. לחץ הזרקה גבוה עלול לקרוע כלי דם או תעלות, ולפגוע באופן בלתי הפיך בארכיטקטורת כלי הדם או הצינור.בנוסף, הבועות היו עוד חפץ הזרקה נפוץ מאוד שהוביל למילוי דליל של הרשתות הצינוריות. כאשר נעשה שימוש בשרף שנפתח זה עתה, נצפה הבדל ברור בניגוד בין צינורות המרה הצהובים שהוזרקו שרף לוורידים ירוקים שהוזרקו שרף. לאחר שלושה חודשים של אחסון, הניגודיות הספיקה כדי להבחין בין וריד הפורטל לבין צינור המרה.עם זאת, המשקעים השפיעו על ערבוב שני השרף, אשר נראה כמו אטימות הטרוגנית בווריד הפורטל מלא. כאשר השרף היה מבוגר משישה חודשים, הניגוד הושפל לנקודה שבה לא היה ניתן להבחין בין צינור המרה שהוזרק בצהוב לווריד הפורטל שהוזרק בירוק, בהתבסס על הניגודיות שלהם בלבד. זה חיוני כדי להפוך התנגשות עקיפה לתוך צינור המרה המשותף.אחרת יהיה קשה מאוד להכניס את הצינורות. טכניקת DUCT מאירה מנגנונים ארכיטקטוניים חדשים של התחדשות מרה במודל רלוונטי קלינית עם מאפיינים ברורים באזורי האונה ההילרית והיקפית.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

זלוף מדרדר ומילוי בכלי הדם הכליליים עכבר כהכנה מיקרו טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

יציקה והדמיה של וריד שער מאוס או מערכת צינור מרת intrahepatic שרף 3-Dimensional

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

משלוח סמים האוסמוטי לhindlimbs איסכמי וטפטוף של כלי דם עם Microfil למייקרו-טומוגרפיה ממוחשבת הדמיה

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

הערכה של יכולת הקיום של הזרקת שומן האנושי בעכברי עירום עם מיקרו-טומוגרפיה ממוחשבת

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

מרה Duct קשירת בעכברים: אינדוקציה של דלקת כבד פגיעה ופיברוזיס ידי חסימתית cholestasis

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

באמצעות טומוגרפיה מיקרו שחושבת הערכת התפתחות גידול ומעקב של תגובה לטיפול במודל עכברי של סרטן הריאות

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

משולב האינפרה-אדום הקרוב הדמיה פלורסנט וטומוגרפיה-מחושב מיקרו ישירות חזותי מוחין Thromboemboli

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

בדיקת אצטילכולין ואחריו אדנוזין לאבחון פולשני של הפרעות וזומוטוריות כליליות

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

טכניקות הכנת רקמות להדמיית טומוגרפיה ממוחשבת מיקרו משופרת ניגודיות של מודלים לבביים של יונקים גדולים עם מחלות כרוניות

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

הערכת מיקרו-ארכיטקטורה של עצם טרבקולרית במודל עכבר אוסטאופורוזיס

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...