Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

Ringraziamo Kari Huppert e Stacey Huppert per la loro esperienza e il loro aiuto per quanto riguarda la cannulazione dei dotti biliari e la loro ospitalità di laboratorio. Ringraziamo anche Nadja Schultz e Charlotte L. Mattsson per il loro aiuto con la cannulazione del dotto biliare comune.
Ringraziamo le seguenti Agenzie Concedenti per il loro supporto:
Per il lavoro in ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (sovvenzione iniziale delle fondazioni svedesi), Associazione europea per lo studio del fegato (Premio Daniel Alagille), Fondazione svedese Heart-Lung (20170723) e Vetenskapsrådet (2019-01350).
Per il lavoro in JK Lab: Riconosciamo l'infrastruttura di ricerca CzechNanoLab supportata da MEYS CR (LM2018110). J.K. grazie al supporto della sovvenzione FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

Un progetto separato nel laboratorio ERA è finanziato da ModeRNA. ModeRNA non ha avuto alcun ruolo nel progetto/protocollo qui descritto.

Diversi passaggi critici determinano il successo del DUCT, dalla preparazione del campione ai parametri del dispositivo CT. Per ottenere i migliori risultati, è necessario utilizzare resina ben contrastata, ben iniettata e priva di bolle per consentire un'elaborazione digitale semplice con soglia automatizzata per ottenere dati, immagini e filmati 3D. Con l'allenamento e seguendo questo protocollo, il 90% delle iniezioni ha successo e si traduce in dati riproducibili. È importante utilizzare resina gialla fresca per ottenere il miglior contrasto tra i due sistemi iniettati. La resina gialla ha una radiopacità molto forte, mentre la resina blu ha una radiopacità non rilevabile. I migliori risultati si ottengono entro i primi tre mesi dall'apertura di una nuova bottiglia di resina gialla. Con il tempo, la resina precipita e dopo una conservazione più lunga (>6 mesi), le resine gialle e verdi non saranno più distinguibili nelle scansioni TC. Le immagini con scarso contrasto richiedono un tracciamento manuale esteso e dispendioso in termini di tempo e la segmentazione dei due sistemi. Successivamente, il tubo ben allungato è indispensabile per adattarsi al dotto biliare comune dei topi adulti e al dotto biliare comune e alla vena porta dei topi postnatali. Il punto di ingresso per l'iniezione deve essere creato con cura. Se il dotto biliare comune viene tagliato trasversalmente, è probabile che si stacchi dal tessuto circostante, impedendo l'ingresso riuscito del tubo. Questo passaggio è particolarmente delicato per i topi postnatali in cui il dotto biliare comune si ritrae e si "raggomitola" se si è staccato dal tessuto circostante, rendendo l'inserimento del tubo estremamente impegnativo. L'ingresso e l'iniezione del dotto biliare comune possono richiedere un po 'di pratica. Durante la preparazione del tubo con resina e durante l'iniezione, evitare la formazione di bolle poiché le bolle creeranno spazio negativo nelle immagini TC e richiederanno una correzione manuale dispendiosa in termini di tempo. È importante massaggiare delicatamente il fegato rotolando sulla sua superficie con un batuffolo di cotone bagnato durante e dopo la procedura di iniezione in quanto ciò facilita anche la diffusione della resina. Dopo il completamento dell'iniezione e la rimozione del tubo, il nodo di sutura della seta deve essere stretto rapidamente e con attenzione, in modo che la resina non fuoriesca dal fegato prima che polimerizzi completamente. Per un'imaging microCT di successo, il campione deve essere correttamente fissato in posizione con agarosio e adattato termicamente per eliminare gli artefatti di movimento nei dati CT. Anche le impostazioni di acquisizione sono di fondamentale importanza, che dovrebbero essere ottimizzate per raggiungere un'adeguata risoluzione spaziale per risolvere strutture fini.
Modifiche tecniche alla procedura di iniezione possono essere apportate per ottenere l'iniezione nei topi più giovani. Attualmente, la fusione di resina di fegati di topo più giovani è limitata dalla disponibilità di tubi sufficientemente sottili, con PE10 che è il più piccolo tubo disponibile in commercio. Tanimizu et al. hanno iniettato con successo inchiostro di carbonio nel dotto biliare embrionale del giorno 17 (E17) usando capillari di vetro11. Sarebbero quindi interessanti i test futuri per verificare se la resina può essere consegnata tramite capillare di vetro. DUCT è stato ulteriormente adattato per iniettare altri sistemi tubolari come le vie aeree e la vascolarizzazione dell'arteria polmonare dei polmoni9. La doppia iniezione di resina potrebbe anche essere modificata per essere utilizzata con altre resine disponibili in commercio, oppure questo protocollo potrebbe essere utilizzato per iniezioni con inchiostro di carbonio.
Uno dei principali fattori limitanti della tubazione DUCT è la viscosità della resina. DUCT può essere utilizzato solo per la fusione in resina di strutture tubolari di diametro superiore a 5 μm. In questo set di dati, la resina potrebbe penetrare tubi con il diametro più piccolo di 5 μm9. Questa limitazione dimensionale preclude l'analisi di duttili fini e piccoli capillari. Per far avanzare ulteriormente la tubazione DUCT verso recipienti di calibro più piccolo, è necessario testare altre resine disponibili in commercio o lo sviluppo di nuovi agenti radiopaci a bassa viscosità può migliorare la penetrazione del lume.
In Hankeova et al.9, DUCT è stato confrontato con altre due tecniche comunemente usate, iniezioni di inchiostro a doppio carbonio seguite da pulizia dei tessuti e fotografia standard, e iDISCO + con colorazione dei vasi sanguigni con actina delle cellule muscolari alfa-lisce e dotti biliari con citocheratina 7, seguita da imaging 3D9. DUCT ha superato gli altri due metodi in termini di doppia analisi (che è stata difficile per iDISCO + a causa dell'elevata autofluorescenza epatica), imaging 3D e quantificazione (non possibile con l'iniezione di inchiostro di carbonio) e lumenizzazione (DUCT fornisce dati per l'architettura del lumen interno e la perfusione del sistema). Come accennato in precedenza, il limite principale di DUCT è la dimensione minima del lumen che può essere iniettata e analizzata (limite di 5 μm), un parametro in cui sia l'iniezione di inchiostro di carbonio che iDISCO+ hanno funzionato meglio. DUCT è superiore alla colata di resina a sistema singolo3,5,6 perché consente l'analisi di ciascun sistema iniettato separatamente e facilita anche la doppia indagine 3D per studiare la relazione architettonica tra i due sistemi.
DUCT può essere applicato per studiare due reti tubolari in 3D. Come prova di principio, DUCT è stato utilizzato per visualizzare i sistemi biliari e delle vene portarie del fegato e la vascolarizzazione dell'arteria polmonare e le vie aeree nel polmone9. I dotti biliari intraepatici si sviluppano adiacenti alla vena porta e la vena porta fornisce un modello strutturale e un centro di segnalazione che regola la crescita e la differenziazione dell'albero biliare12. In Hankeova et al.9, DUCT ha esplorato la rigenerazione biliare in un modello murino per la malattia pediatrica umana Sindrome di Alagille. DUCT ha rivelato meccanismi architettonici precedentemente non riportati che il sistema biliare ha utilizzato per ottenere un volume simile a un tipo selvaggio9. I topi con sindrome di Alagille hanno utilizzato due diverse strategie: (1) nelle regioni ilare e centrale del fegato, il sistema biliare ha aumentato la sua ramificazione e (2) nella periferia epatica, i dotti biliari generati de novo erano altamente tortuosi. Questi due fattori combinati hanno prodotto un volume del sistema biliare quasi normale, nonostante l'architettura anormale. Inoltre, DUCT ha rilevato una ramificazione anomala del dotto biliare che si è verificata indipendentemente dalla ramificazione della vena porta e dai dotti biliari che formano ponti di collegamento tra due vene porta9. Questi fenotipi sarebbero impossibili da rilevare nella fusione di singole resine e potrebbero essere interpretati erroneamente nelle sezioni istologiche 2D come proliferazione dei dotti biliari. DUCT fornisce quindi dati che descrivono l'architettura 3D di due reti tubolari a livello dell'intero organo o lobo con la possibilità di analisi quantitative qualitative e approfondite. DUCT potrebbe essere un nuovo standard per lo sviluppo postnatale del fegato e le analisi di rigenerazione epatica in diversi modelli animali.

La fusione di resina per organo è una tecnica che risale al 17 ° secolo1. Uno dei primi esempi di fusione di resina moderna è stato eseguito sul fegato umano da un'autopsia. I dotti biliari intraepatici sono stati riempiti con un mezzo di contrasto mescolato con gelatina, seguito da imaging con una scansione TC a raggi X2. Lo scopo della tecnica DUCT è quello di visualizzare, digitalizzare e analizzare due reti tubolari in resina, in tandem, in 3D.
DUCT si basa sulla vasta conoscenza esistente della colata di resina epatica a sistema singolo3,4,5,6,7,8 e si estende alla visualizzazione e all'analisi 3D simultanee di due sistemi9. DUCT ha avanzato la fusione di resina singola a doppia resina mescolando due resine radiopache di diverso contrasto e iniettando queste resine in due reti diverse, in particolare il dotto biliare comune e la vena porta. DUCT può essere applicato a giovani topi postnatali con risultati riproducibili già dal giorno 15 postnatale (P15). Rispetto alle tecniche di imaging basate sulla microscopia, il vantaggio principale è che DUCT è più veloce, privo di anticorpi e l'autofluorescenza del tessuto epatico non interferisce con l'imaging. Inoltre, DUCT fornisce dati quantitativi che descrivono lo stato di lumenizzazione, il diametro interno, la connettività di rete e la perfusione. Distinguere tra la presenza di cellule che formano lumen e la loro morfogenesi de facto in tubi è essenziale per analizzare gli organi in cui sono presenti cellule duttali ma non formano tubi, come può essere il caso della sindrome di Alagille10. Il principale svantaggio di DUCT è la limitata penetrazione della resina, che è viscosa e non entra in tubi con un piccolo calibro (<5 μm). DUCT può essere applicato per qualsiasi struttura tubulare dopo aver determinato il punto di ingresso dell'iniezione, come i sistemi circolatori arteriosi e venosi, le vie aeree, il dotto biliare extraepatico o i vasi linfatici. Potrebbe quindi facilitare l'analisi dell'architettura dell'intero organo di altri tessuti come polmoni e pancreas.
Le immagini segmentate MicroCT possono essere elaborate utilizzando software di imaging disponibili in commercio, come ImageJ, o pipeline scritte su misura (ad esempio, MATLAB). Il fegato iniettato con resina può essere analizzato qualitativamente per l'espansione e la connettività della rete o quantitativamente per volume, lunghezza, ramificazione, tortuosità di un singolo sistema e l'interazione tra due sistemi come la distanza tra due sistemi o la dipendenza dal punto di diramazione (il sistema 1 si dirama in prossimità della ramificazione del sistema 2?). La pipeline DUCT che comprende l'iniezione di resina, la scansione microCT e la segmentazione dei dati CT, combinata con un'analisi quantitativa dettagliata dei meccanismi architettonici di due sistemi tubolari, potrebbe fornire uno standard per l'analisi del fegato intero in modelli animali.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

Il fegato è il più grande organo interno negli esseri umani e nei topi e l'elevata autofluorescenza rappresenta una sfida significativa per valutare l'architettura tridimensionale (3D) dell'organo a livello dell'intero organo. L'architettura del fegato è caratterizzata da molteplici strutture ramificate lumenizzate, che possono essere riempite con resina, compresi gli alberi vascolari e biliari, stabilendo un modello altamente stereotipato nel parenchima altrimenti ricco di epatociti. Questo protocollo descrive la pipeline per l'esecuzione della tomografia micro-computerizzata a doppia colata di resina, o "DUCT". DUCT comporta l'iniezione della vena porta e del dotto biliare comune con due diverse resine sintetiche radiopache, seguite dalla fissazione dei tessuti. Il controllo di qualità mediante la compensazione di un lobo, o dell'intero fegato, con un agente di compensazione ottica, consente la pre-screening di campioni opportunamente iniettati. Nella seconda parte della pipeline DUCT, un lobo o l'intero fegato possono essere utilizzati per la scansione della tomografia micro-computerizzata (microCT), la segmentazione (semi)automatizzata e il rendering 3D delle reti venose e biliari del portale. MicroCT produce dati di coordinate 3D per le due resine che consentono un'analisi qualitativa e quantitativa dei due sistemi e della loro relazione spaziale. DUCT può essere applicato al fegato di topo postnatale e adulto e può essere ulteriormente esteso ad altre reti tubolari, ad esempio reti vascolari e vie aeree nei polmoni.

Cosa fare La doppia iniezione di resina di successo si ottiene quando sia i dotti biliari intraepatici che la vascolarizzazione della vena porta sono ben riempiti. Come fase di controllo qualità, la cancellazione di un lobo (ad esempio, il lobo laterale sinistro) consente la verifica di un'iniezione riuscita, seguita dall'imaging dei lobi di interesse. Il lobo otticamente cancellato può essere scansionato in seguito utilizzando microCT; quindi è possibile cancellare otticamente l'intero fegato. Nel fegato di topo ben iniettato, la vascolarizzazione della vena porta deve essere riempita con resina fino a quando la periferia epatica e la resina devono essere visibili nei rami laterali (Figura 4), e questa architettura è fedelmente ricapitolata nei dati scansionati e segmentati microCT. Inoltre, i dotti biliari intraepatici ben iniettati dovrebbero essere visibili accanto ai principali rami della vena porta che si estendono quasi fino alla periferia e la resina dovrebbe essere visibile nei principali rami laterali. Se il lobo di controllo supera la fase di controllo qualità, i lobi di interesse (incluso quello otticamente cancellato) possono essere scansionati con microCT. Il risultato dei dati segmentati da un fegato ben iniettato è mostrato per un topo P15 (Figura 4A,B) e un topo adulto (Figura 4C,D).
Cosa non fare Il tessuto epatico intatto è un prerequisito per un'iniezione di successo. Prestare particolare attenzione quando si taglia la cavità addominale e il diaframma per non graffiare accidentalmente il tessuto epatico. Se c'è un danno fisico al fegato durante questa procedura, è molto probabile che la resina fuoriesca durante l'iniezione della vena porta (Figura 5A). Non è possibile ottenere una buona iniezione del sistema vascolare se il fegato è fisicamente danneggiato.
Uno degli errori più comuni è il riempimento del fegato con resina che può portare a sfide per la visualizzazione o l'analisi. Una delle cause del riempimento insufficiente del sistema è l'indurimento prematuro della resina nell'ago o nella punta del tubo prima che l'iniezione sia completata (Figura 5B, punte di freccia blu, staffe raffigurano bolle di grandi dimensioni). Una buona pratica è quella di utilizzare un set di iniezione per animale e lavorare velocemente dopo che l'agente polimerizzante è stato aggiunto alla resina. Se la resina si indurisce durante l'iniezione (che può essere osservata da un sistema semi-riempito, qui esemplificato con una vascolarizzazione della vena porta semi-riempita) rimuovere il tubo, tagliare la punta del tubo (sempre in diagonale per creare una punta smussata) e spingere lo stantuffo. Se la resina inizia a gocciolare di nuovo, reinserire con cura il tubo e fissarlo con la sutura. Se la resina si è indurita nell'ago, sostituire completamente il tubo, riempirlo di resina (evitando bolle), reinserire con cura il tubo e fissarlo con la sutura. Può essere difficile sostituire il tubo, specialmente nei giovani topi postnatali < P30, poiché il tessuto è più fragile. Un'altra causa di scarso riempimento di resina della vascolarizzazione della vena porta può essere insufficiente perfusione transcardica (Figura 5C, punte di freccia blu denotano sangue visibile nei rami terminali). Questo può essere osservato quando le punte dei vasi sono piene di sangue invece di resina. Per evitare questo, assicurarsi che la vena porta (al di fuori del fegato) non contenga sangue prima dell'iniezione. La terza causa di fegato sottoriempito è quando il tubo viene inserito troppo in profondità nel fegato ed entra in un ramo verso uno dei lobi. Per evitare ciò, inserire il tubo ad un minimo di 0,5 cm dall'ingresso al fegato.
Al contrario, uno o entrambi i sistemi si riempiono di resina (Figura 5D). È necessario monitorare visivamente il fegato durante l'iniezione. La fusione del sistema biliare con resina è più impegnativa della colata di resina della vena porta poiché i condotti riempiti di resina sono solo debolmente visibili sulla superficie del fegato ed è difficile valutare quando il sistema è quasi pieno e quando fermarsi. Quando piccoli punti di resina gialla appaiono sulla superficie del fegato (Figura 2Ci, punta di freccia blu), questo è un segno che il sistema biliare è completamente riempito e la resina sta iniziando a fuoriuscire dai dotti. Le perdite di resina minori possono essere corrette manualmente durante la segmentazione dei dati microCT (Figura 5D, pannelli di destra).
Se la pressione di iniezione è troppo alta, ciò può causare la rottura di vasi o condotti (Figura 5E), danneggiando irreversibilmente l'architettura del recipiente o del condotto. Il fegato non sarà adatto per la scansione o l'analisi microCT. Per evitare il riempimento eccessivo della resina, ottimizzare il giusto volume e la giusta pressione utilizzati per l'iniezione in ogni modello di mouse. Quando si lavora con topi che sono stati sfidati con una dieta tossica, modificazione genetica o danno epatico che colpisce il sistema biliare o venoso, o rigidità epatica, la pressione e il volume dell'iniezione potrebbero dover essere regolati in quanto il volume e la pressione tollerati possono essere diversi dai topi selvatici. Questo protocollo descrive l'iniezione manuale dei due sistemi, ma è possibile collegare la siringa ad una pompa per standardizzare la pressione di iniezione. Le bolle sono un altro artefatto di iniezione molto comune che porta al riempimento sparso delle reti tubolari (Figura 5F-H, punte di freccia blu). Per evitare la formazione di bolle, assicurarsi che la siringa e il tubo non contengano bolle, siano completamente riempiti di resina e che la resina goccioli dalla punta del tubo prima dell'iniezione. Piccole bolle che appaiono come aree negative sui dati microCT possono essere corrette manualmente durante le fasi di post-elaborazione, sebbene ciò sia laborioso.
Fresco è il migliore L'utilizzo di resina gialla fresca è un fattore cruciale, che influisce in modo significativo sul contrasto delle due resine e sulla segmentazione dei dati microCT. Quando si utilizza la resina appena aperta (Figura 6A) c'è una chiara differenza di contrasto tra i dotti biliari iniettati con resina gialla (bianco brillante) e le vene porta iniettate di resina verde (grigio brillante). Il fegato iniettato con resina fresca viene facilmente lavorato utilizzando la soglia globale automatizzata. Con lo stoccaggio prolungato, la resina precipita e il contrasto diminuisce. Dopo 3 mesi di conservazione, il contrasto può ancora essere sufficiente per distinguere la vena porta dal dotto biliare (Figura 6B), ma la precipitazione influisce sulla miscelazione delle due resine, che è visibile come un'opacità eterogenea nella vena porta riempita (Fig 6B, punte di freccia blu). Il contrasto eterogeneo influisce negativamente sulla soglia automatizzata e richiede correzioni manuali, il che aumenta il tempo di elaborazione. Se la resina è più vecchia di sei mesi, il contrasto si è degradato a un punto in cui non è possibile distinguere il dotto biliare iniettato di giallo dalla vena porta iniettata di verde in base al loro solo contrasto (Figura 6C). In questo caso, il dotto biliare e la vena porta devono essere segmentati manualmente in base al loro diametro e posizione nella regione ilare e seguiti manualmente per tutti i dati microCT. Questa procedura è estremamente dispendiosa in termini di tempo e meglio evitare.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> Figura 1: Set di iniezione per la fusione della resina. (A) Il set di iniezione #1 comprende un ago da 30 G e un tubo in PE10 lungo circa 30 cm. Il set di iniezione #2 è composto da un ago da 23 G e un tubo in PE50 lungo ~ 30 cm. (B) La punta del tubo viene allungata e tagliata ad angolo per creare una punta smussata. Il righello in A e B è un righello centimetrico, con incrementi maggiori di 1 cm, incrementi intermedi di 5 mm e incrementi minori di 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> Figura 2: Diagramma di flusso per colata di resina doppia. (A) Schema che mostra il sistema circolatorio venoso murino e il cuore con l'atrio destro evidenziato, che deve essere tagliato prima della perfusione, e il ventricolo sinistro in cui deve essere inserito l'ago per la perfusione per lavare via il sangue dal sistema circolatorio. La vena cava inferiore deve essere recisa sotto i reni per alleviare la pressione vascolare. (B) Diagramma di flusso di iniezione della resina del dotto biliare. (i) Zoom dell'immagine di (A) raffigurante dove separare l'IVC. (ii) Immagine raffigurante il dotto biliare comune (linea tratteggiata gialla) dalla regione ilare del fegato allo sfintere di Oddi (punte di freccia nere), con filo di sutura sotto il dotto biliare comune cancellato. (iii) Posizione adatta per il nodo overhand sciolto attorno al dotto biliare comune. (iv) La linea tratteggiata gialla e le punte di freccia nere etichettano lo sfintere di Oddi, dimostrando l'angolo obliquo per l'incisione e come l'apertura dovrebbe apparire dopo l'incisione ad angolo obliquo. (v) Schema che dimostri l'orientamento dell'apertura smussata del tubo PE10 (verso l'alto) al momento dell'inserimento. vi) Aspetto dell'iniezione di resina gialla; la resina dovrebbe facilmente passare il nodo legato liberamente. IVC, vena cava inferiore; CBD, dotto biliare comune. (C) Diagramma di flusso di iniezione della resina della vena porta. (i) La linea tratteggiata verde segna la vena porta dalla regione ilare. Le punte di freccia blu etichettano il sistema biliare sovraffollato. (ii) Posizione adatta per il nodo overhand sciolto intorno alla vena porta. (iii) Schema che dimostri l'apertura smussata (verso l'alto) al momento dell'inserimento. iv) Aspetto del fegato dopo l'iniezione di resina verde e resina gialla; notare il vaso sanguigno pieno di resina nella periferia del fegato. PV, vena porta. La Figura 2A è stata creata con Biorender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> Figura 3: Elaborazione dei dati Micro CT nel software di grafica di volume. (A) Determinazione della superficie, (i) isovalore sovrastimato (l'anteprima corrente della selezione è mostrata in colore giallo), (ii) isovalore sottovalutato, (iii) selezione ottimale dell'isovalo per una corretta determinazione superficiale della vena porta e dei dotti biliari. (B) Dividere la regione di interesse (ROI) creata dalla determinazione della superficie, (i) impostare il valore nella finestra di dialogo abbastanza in alto da rimanere solo un segmento (il più grande), (ii) nei fotogrammi gialli vengono mostrate le particelle più piccole (escluse). (C) Levigatura superficiale dei dati, (i) la funzione di levigatura è sul pannello di sinistra, (ii) impostare la forza di levigatura su 1 (max. 2) e creare un nuovo ROI levigato, (iii) dati levigati. (D) Separazione dei singoli sistemi tubolari, (i) nella funzione di determinazione della superficie impostare l'isovalore in modo che solo il sistema biliare sia incluso nella selezione (l'anteprima corrente della selezione è mostrata in colore giallo), (ii) contrassegnare il ROI di entrambi i sistemi e il ROI del solo sistema biliare e sottrarre il ROI del sistema biliare dal ROI di entrambi i sistemi, (iii) Vena porta mostrata in grigio, il sistema biliare mostrato in verde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> Figura 4: Sistemi di dotto biliare ben iniettato (BD) e vena porta (PV). (A) Lobo mediale destro (RML) otticamente eliminato del fegato postnatale del giorno 15 (P15) iniettato con due resine nei due sistemi. Scala barra 1 mm. (B) Rendering 3D di P15 RML mostrato in (A) raffigurante la vascolarizzazione della vena porta in bianco e il sistema biliare in verde. Scala barra 1 mm. (C) RML otticamente cancellato del fegato adulto iniettato con due resine nei due sistemi. Scala barra 1 mm. (D) Rendering 3D di RML adulto mostrato in (C) raffigurante la vascolarizzazione della vena porta in bianco e sistema biliare in verde. H = ilare, P = periferico. Scala barra 1 mm. I pannelli A, B, D sono adattati con il permesso di Hankeova et al.9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> Figura 5: Sfide comuni delle iniezioni di fegato a doppia resina. (A) L'immagine raffigura un fegato che è stato accidentalmente graffiato durante l'apertura iniziale della cavità addominale e la resina sta perdendo attraverso il taglio (punta di freccia blu). (B) Sistema di vene porta scarsamente iniettato a causa dell'indurimento della resina. Le punte di freccia blu etichettano i rami terminali vuoti e le parentesi rosse etichettano le bolle di grandi dimensioni. Scala barra 1 mm. (C) Sistema di vene porta scarsamente iniettato a causa della scarsa perfusione transcardica. Le punte di freccia blu etichettano il sangue visibile nei rami terminali. Scala barra 1 mm. (D) Sistema biliare sovrariempito manifestato da sfere isolate di resina. I pannelli di sinistra mostrano il fegato otticamente cancellato e i pannelli di destra mostrano l'immagine renderizzata 3D microCT. I contorni punteggiati blu raffigurano le regioni di zoom.in. Le punte di freccia nere etichettano una parte del fegato che è stata danneggiata durante la compensazione ottica dopo la scansione microCT. Scala bar 1 mm. (E) L'alta pressione durante l'iniezione di resina può causare la rottura della vena porta (l'animale in questo pannello porta una mutazione Jag1H268Q), contrassegnata da punte di freccia blu. Barra della scala 1 mm. (F) Bolle nella resina durante l'iniezione della vena porta (punte di freccia blu) e (G) iniezione del sistema biliare (punta di freccia blu), barra della scala 1 mm. (H) Scansione MicroCT di bolle (punta freccia blu), rami terminali scarsamente riempiti (parentesi rosse) e perdite di resina (punta freccia gialla), barra della scala 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> Figura 6: Contrasto differenziale della resina. (A) La resina gialla appena aperta genera un contrasto sufficiente per distinguere la vena porta iniettata dalla resina (grigia) e i dotti biliari (bianchi). (B) Tre mesi di conservazione della resina gialla portano alla precipitazione della resina con conseguente opacità eterogenea (vena porta grigio-bianca, punta di freccia blu). (C) La conservazione prolungata (>6 mesi) di resina gialla riduce il contrasto tra la vena porta (grigia) e i dotti biliari (grigio). Barra della scala 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

La tomografia micro-computerizzata a doppia colata di resina, o DUCT, consente la visualizzazione, la digitalizzazione e la segmentazione di due sistemi tubolari contemporaneamente per facilitare l'analisi 3D dell'architettura degli organi. DUCT combina l'iniezione ex vivo di due resine radiopace seguita dalla scansione tomografica micro-computerizzata e dalla segmentazione dei dati tomografici.

DUCT: Double Resin Casting seguito da Tomografia Micro-Computerizzata per Analisi 3D del Fegato

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Questo metodo ci consente di analizzare, visualizzare e quantificare l'architettura dei sistemi vascolari e biliari del fegato in 3D. Ora possiamo comprendere meglio gli aspetti spaziali della malattia del fegato e della rigenerazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non si basa sull'esistenza di anticorpi o imaging a fluorescenza.Consente inoltre la visualizzazione diretta di quali reti sono correttamente lumenizzate. Questo metodo è adatto per l'analisi dei sistemi tubulari, quindi la ricerca di vasi sanguigni, dotti biliari e vie aeree sono aree ideali. Abbiamo usato DUCT per comprendere i cambiamenti strutturali legati alla rigenerazione biliare.Prima di iniettare resina nel sistema biliare del topo, iniziare a spostare l'intestino e il pancreas sul lato sinistro del topo, utilizzando un batuffolo di cotone bagnato con PBS per esporre il dotto biliare comune e la vena porta. Quindi fare una piccola incisione trasversale nella vena cava inferiore. Capovolgere il lato ventrale del fegato verso il cuore per esporre la superficie viscerale e la regione ilare, e individuare il dotto biliare comune che corre dalla regione ilare attraverso il pancreas e nell'intestino allo sfintere di Oddi.Utilizzare la pinza diritta per liberare l'area del tessuto circostante di circa cinque millimetri dal dotto biliare comune. Quindi, posizionando un filo di sutura di seta sotto il dotto biliare comune, legare un nodo overhand sciolto attorno al dotto biliare comune. Tenere le forbici a molla piatte contro il dotto biliare comune per fare un'incisione obliqua al dotto biliare comune nel punto in cui il dotto biliare comune entra nel pancreas e nell'intestino accanto allo sfintere di Oddi.Quindi, mescolare un millilitro della resina gialla con 50 microlitri dell'agente di polimerizzazione MV e riempire una siringa luer da un millilitro con la miscela di agenti polimerizzanti in resina. Collegare la siringa riempita con il set di tubi uno e premere lo stantuffo per riempire il tubo fino a quando la miscela di agenti polimerizzanti in resina gocciola dalla punta del tubo. Utilizzare la pinza per raddrizzare l'area intorno all'incisione del dotto biliare comune.Prima di inserire il tubo nell'apertura nel dotto biliare comune con il bordo più lungo della punta smussata verso il basso verso il lato dorsale del dotto biliare. Quindi stringere il nodo del filo di seta per fissare il tubo all'interno del dotto biliare comune. Dopo aver iniettato la resina nel dotto biliare comune, osservare la cistifellea e i singoli lobi del fegato.Massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato pbS per aiutare a diffondere la resina allo stesso modo. I rami terminali dei dotti biliari pieni di resina saranno debolmente visibili sulla superficie del fegato. Interrompere l'iniezione della resina quando appaiono punti di resina sulla superficie del fegato o quando si incontra resistenza.Quindi rimuovere il tubo estraendo dal dotto biliare comune e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Tagliare le estremità sciolte della sutura di seta, in modo che non interferiscano con l'iniezione della vena porta. Prima di iniettare la resina nella vena porta, eliminare la vena porta dal tessuto circostante a circa due centimetri dal suo ingresso nel fegato, usando una pinza diritta.Quindi posizionare il filo di sutura di seta sotto l'area liberata della vena porta per legare un nodo sciolto. Nella vena porta distale al fegato, fare un'incisione longitudinale prima di legare il nodo. Quindi, preparare la miscela di agenti polimerizzanti in resina verde nella siringa e riempire il tubo con la miscela come dimostrato in precedenza.Utilizzare la pinza per raddrizzare la vena porta tirando il tessuto circostante verso il lato della coda prima di inserire il tubo con il bordo più lungo della punta smussata verso il lato dorsale del vaso. Stringere il filo di seta per fissare il tubo nella vena porta. Dopo aver iniettato la resina nella vena porta, osservare i vasi sanguigni che si riempiono di resina e massaggiare il fegato con un batuffolo di cotone bagnato PBS per aiutare a diffondere la resina.Quando tutti i vasi sanguigni sono pieni, estrarre il tubo dalla vena porta e stringere rapidamente il nodo di seta usando una pinza per evitare che la resina fuoriesca. Per la tomografia micro-computerizzata o la scansione MicroCT del fegato sezionato dal topo, posizionare il lobo epatico mediale destro in un tubo conico da 15 millilitri e riempire il tubo con gel di agarosio all'1% a circa due terzi del volume totale del tubo per ridurre al minimo il movimento indesiderato del campione durante la misurazione MicroCT. Montare il tubo conico da 15 millilitri con il campione sullo stadio rotazionale di un dispositivo CT.Lasciare che il tubo si adatti termicamente alla camera di misura per almeno un'ora. Quando il campione è adattato termicamente, centrarlo nel campo visivo o FOV, quindi ottimizzare le distanze del campione sorgente e del rilevatore di campioni, o SSD e SDD per raggiungere una risoluzione voxel sufficiente. Una volta impostati i parametri, avviare una misurazione CT.Utilizzare un software di ricostruzione tomografica dedicato per ricostruire i dati CT. Per analizzare i dati CT, caricare i file selezionando file, importa e comando. Utilizzare la funzione di determinazione della superficie sul pannello superiore per segmentare la resina nei dati utilizzando la soglia globale.Nella finestra di dialogo, determinare il valore di soglia con la valutazione dell'istogramma impostando la posizione della linea di isovalori rossi per segmentare solo i vasi riempiti di resina. Nel pannello di sinistra, selezionare il modulo crea ROI da volume o CAD o mesh per creare una regione di interesse o ROI dei vasi riempiti di resina. Nella finestra di dialogo, utilizzare l'opzione crea ROI da solido per selezionare e confermare il nome del volume elaborato.Elimina la segmentazione errata dei cluster di rumore nell'area di sfondo di questo ROI. Contrassegna il ROI nel pannello di destra facendo clic con il pulsante destro del mouse e selezionando il ROI diviso del modulo. Nella finestra di dialogo, impostare il parametro voxel del volume minimo per escludere tutte le particelle di rumore.Il valore del parametro è dipendente dall'esperimento e dai dati e ottimizzato per ogni campione da analizzare. Sul pannello di sinistra utilizzare il modulo di levigatura per creare maschere di canale lisce, continue e solide senza artefatti, come la presenza di bolle d'aria o perdite di resina nel ROI del costo della resina. Creare un ROI separato come descritto in precedenza per il sistema riempito con la resina più assorbente come la resina gialla utilizzata per l'iniezione del dotto biliare comune con valori di intensità più elevati nei dati CT.Contrassegnare e mascherare in resina il nuovo ROI facendo clic con il pulsante destro del mouse prima di selezionare i ROI di sottrazione e quindi sottrarre il nuovo ROI dal ROI della maschera in resina per creare un nuovo ROI per il sistema tubolare rimanente. Esportare i ROI risultanti per entrambi i sistemi tubolari in vari formati in base ai riferimenti dell'operatore per la successiva elaborazione in diversi software. Elaborare ulteriormente i ROI risultanti in un software di grafica di volume per esportare la visualizzazione finale sotto forma di immagine o video.In questo studio, è stata ottenuta una doppia iniezione di resina di successo con dotti biliari intraepatici ben riempiti e vascolarizzazione della vena porta. L'analisi rappresentativa illustra il risultato dei dati segmentati da un fegato ben iniettato per un topo P15 e un topo adulto in cui la resina è visibile nei rami laterali. Nel tipico esempio di iniezione non riuscita, il danno fisico al fegato durante la procedura chirurgica ha provocato la fuoriuscita di resina.Anche l'indurimento prematuro della resina nell'ago o nella punta del tubo prima dell'iniezione e l'insufficiente perfusione transcardica hanno causato il riempimento insufficiente del sistema. La perdita di resina minore potrebbe essere corretta manualmente durante la segmentazione dei dati MicroCT. Un'alta pressione di iniezione potrebbe rompere vasi o condotti e danneggiare irreversibilmente l'architettura del recipiente o del condotto.Inoltre, le bolle erano un altro artefatto di iniezione molto comune che portava al riempimento sparso delle reti tubolari. Quando è stata utilizzata la resina appena aperta, è stata osservata una chiara differenza nel contrasto tra i dotti biliari iniettati con resina gialla e le vene porta iniettate di resina verde. Dopo tre mesi di conservazione, il contrasto era sufficiente per distinguere la vena porta dal dotto biliare.Tuttavia, la precipitazione ha influenzato la miscelazione delle due resine, che era visibile come un'opacità eterogenea nella vena porta riempita. Quando la resina era più vecchia di sei mesi, il contrasto si degradava a un punto in cui non era possibile distinguere il dotto biliare iniettato di giallo dalla vena porta iniettata di verde, in base al loro solo contrasto. È fondamentale fare un'incisione obliqua nel dotto biliare comune.Altrimenti sarà molto difficile inserire il tubo. La tecnica DUCT illumina nuovi meccanismi architettonici di rigenerazione biliare in un modello clinicamente rilevante con caratteristiche distinte nelle regioni ilare e del lobo periferico.

Research

JoVE Journal

Medicine

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Medicina

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