Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

Мы благодарим Кари Юпперт и Стейси Юппер за их опыт и помощь в отношении каннуляции желчных протоков и их лабораторное гостеприимство. Мы также благодарим Надю Шульц и Шарлотту Л. Маттссон за их помощь в канюляции желчных протоков.
Мы благодарим следующие учреждения, предоставляющие гранты, за их поддержку:
За работу в ERA Lab: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (Стартовый грант шведских фондов), Европейская ассоциация по изучению печени (премия Даниэля Алагилле), Шведский фонд сердца и легких (20170723) и Vetenskapsrådet (2019-01350).
За работу в JK Lab: Мы благодарим исследовательскую инфраструктуру CzechNanoLab, поддерживаемую MEYS CR (LM2018110). J.K. благодаря поддержке гранта FSI-S-20-6353.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

Отдельный проект в лаборатории ERA финансируется ModeRNA. ModeRNA не играла никакой роли в описанном здесь проекте/протоколе.

Несколько критических шагов определяют успех DUCT, от подготовки образца до параметров устройства КТ. Для достижения наилучших результатов следует использовать хорошо контрастную, хорошо впрыскиваемую и безпузырьковую смолу, чтобы обеспечить простую цифровую обработку с автоматическим пороговым значением для получения 3D-данных, изображений и фильмов. При обучении и следовании этому протоколу 90% инъекций являются успешными и приводят к воспроизводимым данным. Важно использовать свежую желтую смолу для достижения наилучшего контраста между двумя инжекторными системами. Желтая смола имеет очень сильную рентгенопроницаемость, в то время как синяя смола имеет неопределяемую рентгенопроницаемость. Наилучшие результаты достигаются в течение первых трех месяцев после открытия новой бутылки с желтой смолой. Со временем смола выпадает в осадок, и после более длительного хранения (>6 месяцев) желтая и зеленая смолы больше не будут различимы на КТ. Изображения с плохой контрастностью требуют обширной и трудоемкой ручной трассировки и сегментации двух систем. Далее, хорошо растянутая трубка незаменима, чтобы вписаться в общий желчный проток взрослых мышей и общий желчный проток и воротную вену постнатальных мышей. Точка входа для инъекции должна быть создана с осторожностью. Если общий желчный проток разрезать поперечно, он, вероятно, отсоединится от окружающих тканей, препятствуя успешному проникновению трубки. Этот шаг особенно деликатный для постнатальных мышей, у которых общий желчный проток втягивается и «сворачивается», если он отделился от окружающих тканей, что делает введение трубки чрезвычайно сложным. Общий вход в желчный проток и инъекция могут потребовать некоторой практики. При приготовлении трубки со смолой и на протяжении всей инъекции избегайте образования пузырьков, так как пузырьки создадут негативное пространство на изображениях КТ и потребуют трудоемкой ручной коррекции. Важно мягко массировать печень, перекатываясь по ее поверхности смоченным ватным тампоном во время и после процедуры инъекции, так как это облегчает равномерное распространение смолы. После завершения инъекции и снятия трубки шелковый шовной узел необходимо быстро и осторожно затянуть, чтобы смола не вытекала из печени до того, как она полностью полимеризуется. Для успешной микроКТ-визуализации образец должен быть правильно закреплен на месте с помощью агарозы и термически адаптирован для устранения артефактов движения в данных КТ. Настройки сбора также имеют ключевое значение, которое должно быть оптимизировано для достижения адекватного пространственного разрешения для разрешения тонких структур.
Технические изменения в процедуре инъекции могут быть сделаны для достижения инъекции у молодых мышей. В настоящее время литье смолы молодых печени мышей ограничено наличием достаточно тонких трубок, причем PE10 является самой маленькой коммерчески доступной трубкой. Tanimizu et al. успешно ввели углеродные чернила в эмбриональный желчный проток 17 (E17) с использованием стеклянных капилляров11. Поэтому будущее тестирование того, может ли смола быть доставлена через стеклянный капилляр, будет представлять интерес. DUCT был дополнительно адаптирован для инъекции других канальцевых систем, таких как дыхательные пути и сосудистая система легочной артерии легких9. Двойное впрыскивание смолы также может быть модифицировано для использования с другими коммерчески доступными смолами, или этот протокол может быть использован для инъекций углеродными чернилами.
Одним из основных ограничивающих факторов трубопровода DUCT является вязкость смолы. DUCT может быть использован только для литья смолы трубчатых конструкций диаметром выше 5 мкм. В этом наборе данных смола могла проникать в трубы с наименьшим диаметром 5 мкм9. Это ограничение размера исключает анализ тонких протоков и мелких капилляров. Для дальнейшего продвижения трубопровода DUCT к сосудам меньшего калибра должны быть протестированы другие коммерчески доступные смолы, или разработка новых низковязких рентгеноконтрастных агентов может улучшить проникновение просвета.
В Hankeova et al.9 DUCT сравнивали с двумя другими широко используемыми методами: двойными инъекциями углеродных чернил с последующей очисткой тканей и стандартной фотографией и iDISCO+ с окрашиванием кровеносных сосудов актином альфа-гладкомышечных клеток и желчных протоков цитокератином 7, с последующей 3D-визуализацией9. DUCT превзошел два других метода с точки зрения двойного анализа (что было сложно для iDISCO+ из-за высокой аутофлуоресценции печени), 3D-визуализации и количественной оценки (невозможно при инъекции углеродных чернил) и люменизации (DUCT предоставляет данные для архитектуры внутреннего просвета и перфузии системы). Как упоминалось выше, основным ограничением DUCT является минимальный размер светового потока, который может быть введен и проанализирован (предел 5 мкм), параметр, в котором как впрыск углеродных чернил, так и iDISCO+ работали лучше. DUCT превосходит односистемное литье смолы3,5,6, поскольку позволяет анализировать каждую инжектируемую систему отдельно, а также облегчает двойное 3D-исследование для изучения архитектурных отношений между двумя системами.
DUCT может быть применен для изучения любых двух трубчатых сетей в 3D. В качестве доказательства принципа DUCT был использован для визуализации систем желчных и портальных вен печени, а также сосудистой системы и дыхательных путей легочной артерии в легких9. Внутрипеченочные желчные протоки развиваются рядом с портальной веной, а портальная вена обеспечивает структурный шаблон и сигнальный центр, который регулирует рост и дифференцировку желчевыводящего дерева12. В Hankeova et al.9 DUCT исследовал билиарную регенерацию в мышиной модели для детского заболевания человека синдрома Алагилле. DUCT выявил ранее неизвестные архитектурные механизмы, которые билиарная система использовала для достижения дикого типа тома9. Мыши с синдромом Алагилле использовали две различные стратегии: (1) в хиларной и центральной областях печени билиарная система увеличила свое ветвление, и (2) на периферии печени de novo-генерируемые желчные протоки были очень извилистыми. Эти два фактора в совокупности дали почти нормальный объем билиарной системы, несмотря на аномальную архитектуру. Кроме того, DUCT обнаружил аномальное ветвление желчных протоков, которое происходило независимо от ветвления портальных вен и желчных протоков, образующих соединительные мосты между двумя портальными венами9. Эти фенотипы было бы невозможно обнаружить при литье одной смолы и могут быть неправильно истолкованы в 2D гистологических срезах как пролиферация желчных протоков. Таким образом, DUCT предоставляет данные, описывающие 3D-архитектуру двух трубчатых сетей на уровне всего органа или доли с возможностью качественного и глубокого количественного анализа. DUCT может стать новым стандартом для анализа постнатального развития печени и регенерации печени на различных животных моделях.

Литье из органной смолы - это техника, которая восходит к 17 веку1. Один из первых примеров современного литья смолы был выполнен на печени человека после вскрытия. Внутрипеченочные желчные протоки заполняли контрастным веществом, смешанным с желатином, с последующей визуализацией с помощью рентгеновской КТ2. Целью метода DUCT является визуализация, оцифровка и анализ двух трубчатых смоляных сетей в тандеме в 3D.
DUCT основан на обширных существующих знаниях односистемного литья печеночной смолы3,4,5,6,7,8 и распространяется на одновременную 3D-визуализацию и анализ двух систем9. Усовершенствованное литье одной смолы DUCT для литья двойной смолы путем смешивания двух рентгеноконтрастных смол разного контраста и введения этих смол в две разные сети, в частности в общий желчный канал и портальную жилу. DUCT может быть применен к молодым постнатальным мышам с воспроизводимыми результатами уже на 15-й день (P15). По сравнению с методами визуализации, основанными на микроскопии, основным преимуществом является то, что DUCT быстрее, без антител, а аутофлуоресценция тканей печени не мешает визуализации. Кроме того, DUCT предоставляет количественные данные, описывающие состояние люменизации, внутренний диаметр, сетевое подключение и перфузию. Дифференциация между присутствием просветообразующих клеток и их де-факто морфогенезом в трубки имеет важное значение для анализа органов, в которых проточные клетки присутствуют, но не образуют трубок, как это может быть в случае синдрома Алагилле10. Основным недостатком DUCT является ограниченное проникновение смолы, которая является вязкой и не попадает в трубки с малым калибром (<5 мкм). DUCT может применяться для любой трубчатой структуры после определения точки входа инъекции, такой как артериальная и венозная системы кровообращения, дыхательные пути, внепеченочный желчный проток или лимфатические сосуды. Таким образом, это может облегчить анализ архитектуры целых органов других тканей, таких как легкие и поджелудочная железа.
Сегментированные изображения MicroCT могут быть обработаны с использованием коммерчески доступного программного обеспечения для обработки изображений, такого как ImageJ, или специально написанных конвейеров (например, MATLAB). Печень, введенная смолой, может быть качественно проанализирована на предмет расширения сети и связности или количественно на объем, длину, ветвление, извилистость одной системы и взаимодействие между двумя системами, такое как расстояние между двумя системами или зависимость от точки ветвления (разветвляется ли система 1 в непосредственной близости от ветвления системы 2?). Трубопровод DUCT, охватывающий инъекцию смолы, микроКТ-сканирование и сегментацию данных КТ, в сочетании с подробным количественным анализом архитектурных механизмов двух трубчатых систем, может обеспечить стандарт для анализа всей печени на животных моделях.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

Печень является самым большим внутренним органом у людей и мышей, и высокая автофлуоресценция представляет собой значительную проблему для оценки трехмерной (3D) архитектуры органа на уровне всего органа. Архитектура печени характеризуется множественными ветвящимися люменизированными структурами, которые могут быть заполнены смолой, включая сосудистые и желчные деревья, устанавливая очень стереотипный рисунок в богатой гепатоцитами паренхиме. Этот протокол описывает конвейер для выполнения микрокомпьютерной томографии с двойной смолой, или «DUCT». DUCT влечет за собой инъекцию в воротную вену и общий желчный проток с двумя различными рентгеноконтрастными синтетическими смолами с последующей фиксацией ткани. Контроль качества путем очистки одной доли или всей печени оптическим очищающим агентом позволяет проводить предварительный скрининг надлежащим образом введенных образцов. Во второй части трубопровода DUCT доля или вся печень могут быть использованы для микрокомпьютерного сканирования (микроКТ), (полу)автоматизированной сегментации и 3D-рендеринга портальных венозных и желчных сетей. MicroCT приводит к 3D-координатным данным для двух смол, что позволяет проводить качественный, а также количественный анализ двух систем и их пространственных отношений. DUCT может применяться к постнатальной и взрослой печени мыши и может быть дополнительно распространен на другие канальцевые сети, например, сосудистые сети и дыхательные пути в легких.

Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Микрокомпьютерная томография с двойным литьем смолы, или DUCT, позволяет одновременно визуализировать, оцифровывать и сегментировать две трубчатые системы для облегчения 3D-анализа архитектуры органов. DUCT сочетает в себе ex vivo инъекцию двух рентгеноконтрастных смол с последующим микрокомпьютерным сканированием и сегментацией томографических данных.

DUCT: Двойное литье смолы с последующей микрокомпьютерной томографией для 3D-анализа печени

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Этот метод позволяет анализировать, визуализировать и количественно оценивать архитектуру сосудистой и билиарной систем печени в 3D. Теперь мы можем лучше понять пространственные аспекты заболеваний печени и регенерации. Основным преимуществом этой методики является то, что она не опирается на наличие антител или флуоресцентную визуализацию.Это также позволяет непосредственно визуализировать, какие сети должным образом люменизированы. Этот метод подходит для анализа трубчатых систем, поэтому исследование кровеносных сосудов, желчных протоков и дыхательных путей являются идеальными областями. Мы использовали DUCT, чтобы понять структурные изменения, связанные с билиарной регенерацией.Прежде чем вводить смолу в желчную систему мыши, начните перемещать кишечник и поджелудочную железу в левую сторону мыши, используя ватный тампон, смаченный PBS, чтобы обнажить общий желчный проток и воротную вену. Затем делают небольшой поперечный разрез в нижней полой вене. Переверните вентральную сторону печени к сердцу, чтобы обнажить висцеральную поверхность и область хилара, и найдите общий желчный проток, который проходит из хилярной области через поджелудочную железу и в кишечник в сфинктере Одди.Используйте прямые щипцы, чтобы очистить окружающий участок тканей примерно на пять миллиметров от общего желчного протока. Затем, поместив шелковую шовную нить под общий желчный проток, завяжите свободный узел вокруг общего желчного протока. Держите пружинные ножницы плоско против общего желчного протока, чтобы сделать косой разрез к общему желчному протоку в том месте, где общий желчный проток попадает в поджелудочную железу и кишечник рядом со сфинктером Одди.Затем смешайте один миллилитр желтой смолы с 50 микролитрами отверждающего агента MV и заполните шприц на один миллилитр luer смесью отверждающего агента смолы. Соедините заполненный шприц с трубкой и нажмите на плунжер, чтобы заполнить трубку до тех пор, пока смесь смоляного отверждающего агента не стекает с кончика трубки. Используйте щипцы, чтобы выпрямить область вокруг общего разреза желчного протока.Перед введением трубки в отверстие в общем желчном протоке с самым длинным краем скошенного кончика вниз по направлению к дорсальной стороне желчного протока. Затем затяните узел шелковой нити, чтобы закрепить трубку внутри общего желчного протока. После введения смолы в общий желчный проток наблюдают за желчным пузырем и отдельными долями печени.Массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь равномерно распределить смолу. Заполненные смолой концевые ветви желчных протоков будут слабо видны на поверхности печени. Прекратите инъекцию смолы, когда точки смолы появляются на поверхности печени или когда сопротивление встречается.Затем снимите трубку, вытащив из общего желчного протока, и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Обрежьте свободные концы шелкового шва, чтобы они не мешали инъекции воротной вены. Перед введением смолы в воротную вену очистите воротную вену от окружающих ее тканей примерно в двух сантиметрах от ее поступления в печень, используя прямые щипцы.Затем поместите шелковую шовную нить под очищенный участок воротной вены, чтобы завязать свободный узел. В воротной вене дистальнее печени сделайте продольный разрез перед завязыванием узла. Затем подготовьте смесь отверждающего агента зеленой смолы в шприце и заполните трубку смесью, как показано ранее.Используйте щипцы, чтобы выпрямить воротную вену, вытягивая окружающие ткани к хвостовой стороне, прежде чем вставлять трубку с самым длинным краем скошенного кончика к спинной стороне сосуда. Затяните шелковую нить, чтобы закрепить трубку в воротной вене. После введения смолы в воротную вену наблюдайте, как кровеносные сосуды заполняются смолой, и массируйте печень ватным тампоном, смачиваемым PBS, чтобы помочь распределить смолу.Когда все кровеносные сосуды заполнены, вытащите трубку из воротной вены и быстро затяните шелковый узел с помощью щипцов, чтобы предотвратить утечку смолы. Для микрокомпьютерной томографии или микроКТ-сканирования рассеченной печени у мыши поместите правую медиальную долю печени в коническую трубку объемом 15 миллилитров и заполните трубку 1%-агарозным гелем примерно до двух третей от общего объема пробирки, чтобы свести к минимуму нежелательное движение образца во время измерения MicroCT. Установите 15-миллилитровую коническую трубку с образцом на вращательную ступень устройства КТ.Позвольте трубке термически адаптироваться к измерительной камере в течение не менее одного часа. Когда образец термически адаптирован, центрируйте его в поле зрения или FOV, а затем оптимизируйте расстояние до исходного образца и детектора образца или SSD и SDD для достижения достаточного разрешения вокселя. После того, как параметры установлены, начните измерение КТ.Используйте специальное программное обеспечение для томографической реконструкции для реконструкции данных КТ. Чтобы проанализировать данные КТ, загрузите файлы, выбрав файл, импорт и команду. Используйте функцию определения поверхности на верхней панели, чтобы сегментировать смолу в данных с помощью глобального порогового значения.В диалоговом окне определите пороговое значение с помощью оценки гистограммы, установив положение красной изозначальной линии, чтобы сегментировать только сосуды, заполненные смолой. На левой панели выберите модуль создания ROI из объема, CAD или сетки, чтобы создать интересующую область или ROI сосудов, заполненных смолой. В диалоговом окне используйте опцию Создать ROI из твердого тела, чтобы выбрать и подтвердить имя обрабатываемого тома.Исключить ошибочную сегментацию шумовых кластеров в фоновой области данной окупаемости инвестиций. Отметьте рентабельность инвестиций на правой панели, щелкнув правой кнопкой мыши и выбрав разделенный ROI модуля. В диалоговом окне установите параметр минимальной громкости вокселя, чтобы исключить все частицы шума.Значение параметра зависит от эксперимента и данных и оптимизировано для каждого анализируемого образца. На левой панели используйте сглаживающий модуль для создания гладких, непрерывных и сплошных масок каналов без артефактов, таких как наличие пузырьков воздуха или утечка смолы в рентабельности затрат смолы. Создайте отдельную рентабельность инвестиций, как описано ранее, для системы, заполненной более абсорбирующей смолой, такой как желтая смола, используемая для инъекции общего желчного протока с более высокими значениями интенсивности в данных КТ.Пометьте и замаскируйте новую рентабельность инвестиций, щелкнув правой кнопкой мыши, прежде чем выбрать вычесть ROI, а затем вычесть новую рентабельность инвестиций из ROI маски смолы, чтобы создать новую рентабельность инвестиций для оставшейся трубчатой системы. Экспортируйте результирующие ROI для обеих трубных систем в различных форматах на основе ссылок операторов для последующей обработки в различном программном обеспечении. Далее обрабатывайте результирующие ROI в программном обеспечении объемной графики для экспорта окончательной визуализации в виде изображения или видео.В этом исследовании была достигнута успешная двойная инъекция смолы с хорошо заполненными внутрипеченочными желчными протоками и сосудистой сетью воротных вен. Репрезентативный анализ иллюстрирует результат сегментированных данных от хорошо введенной печени для мыши P15 и взрослой мыши, где смола видна в боковых ветвях. В типичном примере неудачной инъекции физическое повреждение печени во время хирургической процедуры привело к утечке смолы.Также преждевременное затвердевание смолы в игле или наконечнике трубки перед инъекцией и недостаточная транскардиальная перфузия вызывали недополнение системы. Незначительная утечка смолы может быть исправлена вручную во время сегментации данных MicroCT. Высокое давление впрыска может разорвать сосуды или протоки и необратимо повредить архитектуру сосуда или протока.Кроме того, пузырьки были еще одним очень распространенным инъекционным артефактом, который привел к разреженному заполнению трубчатых сетей. При использовании свежеоткрытой смолы наблюдалась четкая разница в контрасте между желтыми желчными протоками, вводимыми смолой, и портальными венами, вводимыми зеленой смолой. После трех месяцев хранения контраста оказалось достаточно, чтобы отличить воротную вену от желчного протока.Однако осаждение повлияло на смешивание двух смол, что было видно как гетерогенное помутнение в заполненной портальной вене. Когда смола была старше шести месяцев, контраст деградировал до такой степени, что было невозможно отличить желтый желчный проток от зеленой впрыскиваемой воротной вены, основываясь только на их контрасте. Крайне важно сделать косой разрез в общем желчном протоке.В противном случае будет очень сложно вставить трубку. Методика DUCT освещает новые архитектурные механизмы регенерации желчевыводящих путей в клинически значимой модели с отчетливыми особенностями в областях хилярной и периферической долей.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Ретроградная перфузия и заполнение мыши коронарных артерий, как подготовка к Micro компьютерной томографии изображений

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-мерная литья смол и обработки изображений Мыши воротной вены или внутрипеченочных желчных протоков системы

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Осмотическое доставки лекарств к ишемическим задних конечностей и перфузии сосудистого с Microfil для микро-компьютерной томографии

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Оценка жизнеспособности человеческого жира инъекции голым мышам с Micro-компьютерной томографии

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Желчного протока Лигирование у мышей Индукция воспалительного печени травматизма и фиброза обструктивной холестаза

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Использование микро-компьютерной томографии для оценки развития опухоли и последующая деятельность в ответ на лечение в мышиной модели рака легких

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Комбинированный ближней инфракрасной области флуоресцентных изображений и микро-компьютерной томографии для прямого Визуализируя церебральный тромбоэмболию

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

Тестирование ацетилхолина с последующим использованием аденозина для инвазивной диагностики коронарных вазомоторных расстройств

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Методы подготовки тканей для контрастно-усиленной микрокомпьютерной томографии моделей сердца крупных млекопитающих с хроническими заболеваниями

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Оценка микроархитектуры трабекулярной кости на мышиной модели остеопороза

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...