Name: duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis
Uploaded: 2021-09-28T14:00:00
Duration: 12 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

Kari Huppert ve Stacey Huppert'a safra yolu kanülasyonu ve laboratuvar misafirperverliği konusundaki uzmanlıkları ve yardımları için teşekkür ederiz. Nadja Schultz ve Charlotte L. Mattsson'a da ortak safra yolu kanülasyonuna yardımları için teşekkür ederiz.
Aşağıdaki Hibe Kuruluşlarına destekleri için teşekkür ederiz:
ERA Lab'de çalışmak için: Karolinska Institutet (2-560/2015-280), Stockholms Läns Landsting (CIMED (2-538/2014-29)), Ragnar Söderbergs stiftelse (İsveç Vakıfları Başlangıç Hibesi), Avrupa Karaciğer Araştırmaları Derneği (Daniel Alagille Ödülü), İsveç Kalp-Akciğer Vakfı (20170723) ve Vetenskapsrådet (2019-01350).
JK Lab'deki çalışmalar için: MEYS CR (LM2018110) tarafından desteklenen CzechNanoLab Araştırma Altyapısını kabul ediyoruz. Hibe FSI-S-20-6353 desteği sayesinde J.K.

<ol>
	<li>Narat, J. K., Loef, J. A., Narat, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+preparation+of+multicolored+corrosion+specimens.">On the preparation of multicolored corrosion specimens.</a> The Anatomical Record. 64, 155-160 (1936).</li><li>Ludwig, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+biliary+system+studied+by+quantitative+computer-aided+three-dimensional+imaging+techniques.">Anatomy of the human biliary system studied by quantitative computer-aided three-dimensional imaging techniques.</a> Hepatology. 27, 893-899 (1998).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+assessment+of+the+rat+intrahepatic+biliary+system+by+three-dimensional+reconstruction.">Quantitative assessment of the rat intrahepatic biliary system by three-dimensional reconstruction.</a> American Journal of Pathology. 158, 2079-2088 (2001).</li><li>Masyuk, T. V., Ritman, E. L., LaRusso, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatic+artery+and+portal+vein+remodeling+in+rat+liver:+Vascular+response+to+selective+cholangiocyte+proliferation.">Hepatic artery and portal vein remodeling in rat liver: Vascular response to selective cholangiocyte proliferation.</a> American Journal of Pathology. 162, 1175-1182 (2003).</li><li>Sparks, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Notch+signaling+regulates+formation+of+the+three-dimensional+architecture+of+intrahepatic+bile+ducts+in+mice.">Notch signaling regulates formation of the three-dimensional architecture of intrahepatic bile ducts in mice.</a> Hepatology. 51, 1391-1400 (2010).</li><li>Cuervo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+notch+signaling+is+essential+to+prevent+hepatic+vascular+malformations+in+mice.">Endothelial notch signaling is essential to prevent hepatic vascular malformations in mice.</a> Hepatology. 64, 1302-1316 (2016).</li><li>Thakurdas, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jagged1+heterozygosity+in+mice+results+in+a+congenital+cholangiopathy+which+is+reversed+by+concomitant+deletion+of+one+copy+of+Poglut1+(Rumi).">Jagged1 heterozygosity in mice results in a congenital cholangiopathy which is reversed by concomitant deletion of one copy of Poglut1 (Rumi).</a> Hepatology. 63, 550-565 (2016).</li><li>Walter, T. J., Sparks, E. E., Huppert, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3-Dimensional+resin+casting+and+imaging+of+mouse+portal+vein+or+intrahepatic+bile+duct+system.">3-Dimensional resin casting and imaging of mouse portal vein or intrahepatic bile duct system.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (68), e4272 (2012).</li><li>Hankeova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DUCT+reveals+architectural+mechanisms+contributing+to+bile+duct+recovery+in+a+mouse+model+for+Alagille+syndrome.">DUCT reveals architectural mechanisms contributing to bile duct recovery in a mouse model for Alagille syndrome.</a> Elife. 1, 1-29 (2021).</li><li>Andersson, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+of+Alagille+syndrome+and+mechanisms+of+Jagged1+missense+mutations.">Mouse model of Alagille syndrome and mechanisms of Jagged1 missense mutations.</a> Gastroenterology. 154, 1080-1095 (2018).</li><li>Tanimizu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrahepatic+bile+ducts+are+developed+through+formation+of+homogeneous+continuous+luminal+network+and+its+dynamic+rearrangement+in+mice.">Intrahepatic bile ducts are developed through formation of homogeneous continuous luminal network and its dynamic rearrangement in mice.</a> Hepatology. 64, 175-188 (2016).</li><li>Ober, E. A., Lemaigre, F. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+the+liver:+Insights+into+organ+and+tissue+morphogenesis.">Development of the liver: Insights into organ and tissue morphogenesis.</a> Journal of Hepatology. 68, 1049-1062 (2018).</li></ol>

ERA laboratuvarındaki ayrı bir proje ModeRNA tarafından finanse edilir. ModeRNA'nın burada açıklanan projede/protokolde hiçbir rolü yoktu.

Örnek hazırlamadan CT cihazının parametrelerine kadar çeşitli kritik adımlar KANAL başarısını belirler. En iyi sonuçları elde etmek için, 3D veri, görüntü ve film elde etmek için otomatik eşikleme ile basit dijital işlemeye izin vermek için iyi kontrastlı, iyi enjekte edilmiş ve kabarcıksız reçine kullanılmalıdır. Eğitim ve bu protokole uyulurken enjeksiyonların %90'ı başarılıdır ve tekrarlanabilir verilerle sonuçlanır. Enjekte edilen iki sistem arasında en iyi kontrastı elde etmek için taze sarı reçine kullanmak önemlidir. Sarı reçine çok güçlü bir radyopaklığa sahipken, mavi reçine tespit edilemeyen radyopaklığa sahiptir. En iyi sonuçlar, yeni bir sarı reçine şişesi açıldıktan sonraki ilk üç ay içinde elde edilir. Zamanla, reçine çökeltir ve daha uzun depolamadan sonra (>6 ay), sarı ve yeşil reçineler artık CT taramalarında ayırt edilemez. Kontrastı zayıf görüntüler, iki sistemin kapsamlı ve zaman alıcı manuel izleme ve segmentasyonunu gerektirir. Daha sonra, iyi gerilmiş boru, yetişkin farelerin ortak safra kanalına ve doğum sonrası farelerin ortak safra kanalına ve portal damarına sığmak için vazgeçilmezdir. Enjeksiyonun giriş noktası özenle oluşturulmalıdır. Ortak safra kanalı enine olarak kesilirse, borunun başarılı bir şekilde girmesini önleyerek çevredeki dokudan kopması muhtemeldir. Bu adım, özellikle ortak safra kanalının çevre dokusundan ayrılmışsa geri çekip "kıvrıldığı" doğum sonrası fareler için hassastır ve borunun yerleştirilmesini son derece zorlaştırır. Ortak safra yolu girişi ve enjeksiyonu biraz pratik gerektirebilir. Boruyu reçine ile ve enjeksiyon boyunca hazırlarken, kabarcıklar CT görüntülerinde negatif alan yaratacağından ve zaman alıcı manuel düzeltme gerektireceğinden kabarcık oluşumundan kaçının. Enjeksiyon işlemi sırasında ve sonrasında ıslanmış pamuklu çubukla yüzeyi üzerinden yuvarlanarak karaciğere hafifçe masaj yapmak önemlidir, çünkü bu reçine yayılmasını bile kolaylaştırır. Enjeksiyonun tamamlanmasından ve borunun çıkarılmasından sonra, ipek dikiş düğümü hızlı ve dikkatli bir şekilde sıkılmalıdır, böylece reçine tamamen polimerize olmadan önce karaciğerden akmaz. Başarılı mikroCT görüntüleme için, numune agarose ile düzgün bir şekilde sabitlenmeli ve BT verilerindeki hareket yapıtlarını ortadan kaldırmak için termal olarak uyarlanmalıdır. Alım ayarları, ince yapıları çözmek için yeterli bir uzamsal çözünürlüğe ulaşmak için optimize edilmesi gereken önemli öneme de sahiptir.
Genç farelerde enjeksiyon elde etmek için enjeksiyon prosedüründe teknik değişiklikler yapılabilir. Şu anda, genç fare karaciğerlerinin reçine dökümü, PE10'un piyasada bulunan en küçük boru olmasıyla yeterince ince boruların mevcudiyeti ile sınırlıdır. Tanimizu ve arkadaşları, cam kılcal damarlar kullanarak embriyonik gün 17 (E17) ortak safra kanalına karbon mürekkedeyi başarıyla enjekte etti11. Bu nedenle reçinenin cam kılcal damarlar aracılığıyla teslim edilip edilemeyeceği konusunda gelecekteki testler ilgi çekici olacaktır. DUCT ayrıca akciğerlerin hava yolları ve pulmoner arter vaskülatürü gibi diğer tübüler sistemleri enjekte etmek için uyarlandı9. Çift reçine enjeksiyonu, piyasada bulunan diğer reçinelerle kullanılmak üzere de değiştirilebilir veya bu protokol karbon mürekkepli enjeksiyonlar için kullanılabilir.
DUCT boru hattının ana sınırlayıcı faktörlerinden biri reçine viskozitesidir. DUCT sadece 5 μm çapındaki borulu yapıların reçine dökümü için kullanılabilir. Bu veri kümesinde, reçine en küçük çapı 5 μm9 olan tüplere nüfuz edebilir. Bu boyut sınırlaması ince kanallar ve küçük kılcal damarların analizini önler. DUCT boru hattını daha küçük kalibreli kaplara daha da ilerletmek için, piyasada bulunan diğer reçineler test edilmelidir veya yeni düşük viskoziteli radyopak ajanların geliştirilmesi lümen penetrasyonunu artırabilir.
Hankeova ve ark.9'da, DUCT yaygın olarak kullanılan diğer iki teknikle karşılaştırıldı, çift karbonlu mürekkep enjeksiyonları ve ardından doku temizleme ve standart fotoğrafçılık ve iDISCO + alfa-pürüzsüz kas hücresi aktin ve safra kanalları ile kan damarlarının lekelenmesi ile sitokeratin 7, ardından 3D görüntüleme9. DUCT, ikili analiz (yüksek karaciğer otoflüoresansı nedeniyle iDISCO+ için zorlayıcı olan), 3D görüntüleme ve nicelik (karbon mürekkep enjeksiyonu ile mümkün değildir) ve lümenizasyon (DUCT iç lümen mimarisi ve sistem perfüzyonu için veri sağlar) açısından diğer iki yöntemi geride bıraktı. Yukarıda belirtildiği gibi, DUCT'nin ana sınırlaması, hem karbon mürekkep enjeksiyonunun hem de iDISCO+'nın daha iyi performans gösterdiği bir parametre olan enjekte edilebilen ve analiz edilebilen minimum lümen boyutudur (5 μm sınırı). DUCT, enjekte edilen her sistemin ayrı ayrı analizini sağladığı ve ayrıca iki sistem arasındaki mimari ilişkiyi incelemek için çift 3D incelemeyi kolaylaştırdığı için tek sistemli reçine dökümünden daha üstündür3,5,6.
DUCT, herhangi iki borulu ağı 3D olarak incelemek için uygulanabilir. İlke kanıtı olarak, karaciğer safra ve portal damar sistemlerini ve akciğerdeki pulmoner arter vaskülatını ve hava yollarını görselleştirmek için DUCT kullanıldı9. İntrahepatik safra kanalları portal damara bitişik olarak gelişir ve portal damar, safra ağacının büyümesini ve farklılaştırılmasını düzenleyen yapısal bir şablon ve sinyal merkezi sağlar12. Hankeova ve ark.9'da DUCT, insan pediatrik hastalığı Alagille sendromu için bir fare modelinde safra rejenerasyonunu araştırdı. DUCT, safra sisteminin vahşi tip benzeri bir hacim elde etmek için kullandığı daha önce bildirilmemiş mimari mekanizmaları ortaya çıkardı9. Alagille sendromu fareleri iki farklı strateji kullandı: (1) karaciğerin hilar ve orta bölgelerinde, safra sistemi dallanmayı artırdı ve (2) karaciğer çevresinde, de novo tarafından üretilen safra kanalları oldukça işkenceliydi. Bu iki faktör, anormal mimariye rağmen, normale yakın bir safra sistemi hacmi sağlamak için bir araya gelir. Ayrıca, DUCT, portal damar dallanma ve safra kanallarından bağımsız olarak meydana gelen anormal safra kanalı dallanma tespit etti ve iki portal damarı arasında köprüler oluşturdu9. Bu fenotiplerin tek reçine dökümünde tespit edilmesi imkansızdır ve 2D histolojik bölümlerde safra kanalı çoğalması olarak yanlış yorumlanabilir. DUCT böylece tüm organ veya lob düzeyindeki iki borulu ağın 3D mimarisini nitel ve derinlemesine nicel analiz olasılığı ile açıklayan veriler sağlar. DUCT, farklı hayvan modellerinde doğum sonrası karaciğer gelişimi ve karaciğer rejenerasyon analizleri için yeni bir standart olabilir.

Organ reçinesi dökümü 17. yüzyıla dayanan bir tekniktir1. Modern reçine dökümünün ilk örneklerinden biri bir otopsiden insan karaciğerine yapıldı. İntrahepatik safra kanalları jelatin ile karıştırılmış bir kontrast madde ile dolduruldu, ardından x-ışını CT taraması ile görüntüleme2. KANAL tekniğinin amacı, iki borulu reçine dökümlü ağı birlikte 3D olarak görselleştirmek, dijitalleştirmek ve analiz etmektir.
DUCT, tek sistemli karaciğer reçine dökümünün mevcut geniş bilgisine dayanmaktadır3,4,5,6,7,8 ve iki sistemin eşzamanlı 3D görselleştirme ve analizine kadar uzanır9. DUCT, farklı kontrastlı iki radyopak reçineyi karıştırarak ve bu reçineleri iki farklı ağa, özellikle ortak safra kanalı ve portal damarına enjekte ederek çift reçine dökümüne gelişmiş tek reçine dökümü. DUCT, doğum sonrası 15 (P15) gibi erken bir zamanda tekrarlanabilir sonuçlara sahip genç postnatal farelere uygulanabilir. Mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, en büyük avantajı DUCT'nin daha hızlı, antikorsuz olması ve karaciğer dokusu otoflüoresansının görüntülemeyi engellememesidir. Ayrıca, DUCT lümenizasyon durumunu, iç çapı, ağ bağlantısını ve perfüzyonu açıklayan nicel veriler sağlar. Lümen oluşturan hücrelerin varlığı ile bunların fiil morfogenezini tüplere ayırma, Alagille sendromunda olduğu gibi ductular hücrelerin bulunduğu ancak tüp oluşturmadığı organları analiz etmek için gereklidir10. DUCT'nin ana dezavantajı, viskoz olan ve küçük kalibreli (<5 μm) tüplere girmeyen reçinenin sınırlı penetrasyonudur. DUCT, enjeksiyon giriş noktası belirlendikten sonra arteriyel ve venöz dolaşım sistemleri, hava yolları, ekstrahepatik safra kanalı veya lenfatik damarlar gibi herhangi bir tübüler yapı için uygulanabilir. Böylece akciğerler ve pankreas gibi diğer dokuların tüm organ mimarisi analizini kolaylaştırabilir.
MikroCT segmentli görüntüler, ImageJ gibi ticari olarak kullanılabilen görüntüleme yazılımı veya özel yazılı işlem hatları (örneğin, MATLAB) kullanılarak işlenebilir. Reçine enjekte edilen karaciğer, ağ genişlemesi ve bağlantısı için nitel olarak veya tek bir sistemin hacmi, uzunluğu, dallanması, işkencesi ve iki sistem arasındaki mesafe veya dallanma bağımlılığı gibi iki sistem arasındaki etkileşim için nitel olarak analiz edilebilir (sistem 1 dallanma sistemi 2 dallanma yakınlığında mı?). Reçine enjeksiyonu, mikroCT taraması ve BT veri segmentasyonunu kapsayan DUCT boru hattı, iki borulu sistemin mimari mekanizmalarının ayrıntılı nicel analizi ile birlikte, hayvan modellerinde tüm karaciğer analizi için bir standart sağlayabilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL SafeSeal micro tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.706</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>23 G butterfly needle with tubing</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>367283</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 G needle</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Top-Bio</td>
			<td>P045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl alcohol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>108006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzyl benzoate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B6630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 50 mL tubes</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>CLS430829-500EA</td>
			<td>polypropylene</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swabs</td>
			<td>Medicarier</td>
			<td>60406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection Microscope</td>
			<td>Leica Camera AG</td>
			<td></td>
			<td>Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14190144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 70%</td>
			<td>VWR</td>
			<td>83801.41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon tube 15 mL</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>331.850.084.006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps curved</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm curved</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps straight</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11050-10</td>
			<td>Fine Graefe 10 cm straight</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F8775</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GE Phoenix v|tome|x L 240</td>
			<td>Waygate Technologoies</td>
			<td></td>
			<td>micro computed tomography scanner</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Leo Pharma</td>
			<td>B01AB01</td>
			<td>5000 IE/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolfurane</td>
			<td>Baxter</td>
			<td>FDG9623</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>11413413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-122</td>
			<td>synthetic resin yellow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-120</td>
			<td>synthetic resin blue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MICROFIL</td>
			<td>Flowtech</td>
			<td>MV-diluent</td>
			<td>clear resin diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur pipette</td>
			<td>Verkon</td>
			<td>130.690.424.503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>010.6131.M20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phoenix datos|x 2.0 software</td>
			<td>Baker Hughes</td>
			<td></td>
			<td>CT data reconstruction software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rocker</td>
			<td>VWR</td>
			<td>444-0142</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silk suture</td>
			<td>AgnThos</td>
			<td>14757</td>
			<td>Black silk, 4-0, sterile, 100 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Skin scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14058-09</td>
			<td>Iris straight tip 9 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissor</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-03</td>
			<td>Vannas micro, straight tip 2 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL Luer</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE10</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing PE50</td>
			<td>BD bioscience</td>
			<td>427411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VG Studio MAX 3.3 software</td>
			<td>Volume Graphics GmbH</td>
			<td></td>
			<td>CT data processing and analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

duct: double resin casting followed by micro-computed tomography for 3d liver analysis

Karaciğer, insanlarda ve farelerde en büyük iç organdır ve yüksek oto-floresan, organın üç boyutlu (3D) mimarisini tüm organ düzeyinde değerlendirmek için önemli bir zorluk teşkil eder. Karaciğer mimarisi, vasküler ve safra ağaçları da dahil olmak üzere reçine ile doldurulabilen ve aksi takdirde hepatosit bakımından zengin parankimde son derece kalıplaşmış bir desen oluşturan birden fazla dallanma lümenize yapı ile karakterizedir. Bu protokol, çift reçine döküm mikro bilgisayarlı tomografi veya "DUCT" gerçekleştirmek için işlem hattını açıklar. DUCT, portal damarı ve ortak safra kanalının iki farklı radyopak sentetik reçine ile enjekte edilmesini ve ardından doku fiksasyonunu gerektirir. Bir lobun veya tüm karaciğerin optik temizleme maddesi ile temizlenmesiyle kalite kontrolü, uygun şekilde enjekte edilen numunelerin ön taramasına izin verir. KANAL boru hattının ikinci bölümünde, mikro bilgisayarlı tomografi (mikroCT) taraması, (yarı)otomatik segmentasyon ve portal venöz ve safra ağlarının 3D işlenmesi için bir lob veya tüm karaciğer kullanılabilir. MikroCT, iki reçine için 3D koordinat verileri ile sonuçlanır ve iki sistemin nitel ve nicel analizine ve mekansal ilişkilerine izin verir. DUCT doğum sonrası ve yetişkin fare karaciğerine uygulanabilir ve akciğerlerdeki damar ağları ve hava yolları gibi diğer tübüler ağlara daha da genişletilebilir.

Ne yapmalı Hem intrahepatik safra kanalları hem de portal damar damarı iyi dolduğunda başarılı çift reçine enjeksiyonu sağlanır. Bir kalite kontrol adımı olarak, bir lobun temizlenmesi (örneğin, sol lateral lob) başarılı bir enjeksiyonun doğrulanmasına ve ardından ilgi çekici lobların görüntülenmesine izin verir. Optik olarak temizlenen lob daha sonra mikroCT kullanılarak taranabilir; bu nedenle tüm karaciğeri optik olarak temizlemek mümkündür. İyi enjekte edilmiş fare karaciğerinde portal damar damarı, karaciğer çevresi ve reçine yan dallarda görünene kadar reçine ile doldurulmalıdır (Şekil 4) ve bu mimari mikroCT taranmış ve segmentli verilerde sadık bir şekilde yeniden elde edilir. Ayrıca, iyi enjekte edilmiş intrahepatik safra kanalları, neredeyse çevreye uzanan ana portal damar dallarının yanında görünmeli ve reçine ana yan dallarda görülebilmelidir. Kontrol lobunun kalite kontrol adımını geçmesi durumunda, ilgi çekici loblar (optik olarak temizlenen lob dahil) mikroCT ile taranabilir. İyi enjekte edilmiş bir karaciğerden elde edilen segmentlere ayrılmıştı verilerin sonucu bir P15 faresi (Şekil 4A,B) ve yetişkin bir fare (Şekil 4C, D) için gösterilir.
Ne yapmamalı Sağlam karaciğer dokusu başarılı enjeksiyon için bir ön koşuldur. Karaciğer dokusunu yanlışlıkla çalmamak için karın boşluğunu ve diyaframı keserken ekstra özenyi görün. Bu işlem sırasında karaciğerde fiziksel hasar varsa, reçinenin portal damar enjeksiyonu sırasında dışarı sızma olasılığı çok yüksektir (Şekil 5A). Karaciğer fiziksel olarak hasar görmüşse damar sisteminin iyi bir enjeksiyonu elde etmek mümkün değildir.
Yaygın hatalardan biri, karaciğeri görselleştirme veya analiz için zorluklara yol açabilecek reçine ile doldurmaktır. Sistem yetersiz doldurma nedenlerinden biri, enjeksiyon tamamlanmadan önce iğnede veya borunun ucunda erken sertleşen reçinedir (Şekil 5B, mavi ok uçları, braketler büyük kabarcıkları tasvir eder). İyi bir uygulama, hayvan başına bir enjeksiyon seti kullanmak ve kürleme maddesi reçineye eklendikten sonra hızlı çalışmaktır. Reçine enjeksiyon sırasında sertleşirse (yarı dolu bir sistem tarafından gözlemlenebilir, burada yarı dolu bir portal damar vaskülatıyla örneklenmiştir) boruyu çıkarın, borunun ucunu kesin (eğimli bir uç oluşturmak için her zaman çapraz olarak) ve pistonu itin. Reçine tekrar damlamaya başlarsa, boruyu dikkatlice yeniden takın ve dikişle sabitleyin. Reçine iğnede sertleşmişse, boruyu tamamen değiştirin, reçine ile doldurun (kabarcıklardan kaçının), boruyu dikkatlice yeniden yerleştirin ve dikişle sabitleyin. Doku daha kırılgan olduğu için, özellikle genç doğum sonrası farelerde <P30 tüpünü değiştirmek zor olabilir. Portal ven vaskülatının kötü reçine dolgusunun bir diğer nedeni yetersiz transkardiyal perfüzyon olabilir (Şekil 5C, mavi ok uçları terminal dallarında görülebilen kanı gösterir). Damarların uçları reçine yerine kanla dolduğunda bu gözlenebilir. Bundan kaçınmak için, portal damarın (karaciğerin dışında) enjeksiyondan önce herhangi bir kan içermediğinden emin olun. Az doldurulmuş karaciğerin üçüncü nedeni, borunun karaciğerin çok derinine yerleştirilmesi ve loblardan birine doğru bir dal girmesidir. Bunu önlemek için, boruyu karaciğere girişten en az 0,5 cm'ye yerleştirin.
Tersine, sistemlerden biri veya her ikisi de reçine ile dolduruldu (Şekil 5D). Enjeksiyon boyunca karaciğeri görsel olarak izlemek gerekir. Reçine ile safra sistemi dökümü portal ven reçine dökümünden daha zordur, çünkü reçine dolu kanallar karaciğer yüzeyinde sadece hafifçe görülebilir ve sistemin ne zaman dolduğunu ve ne zaman dureceğini değerlendirmek zordur. Karaciğer yüzeyinde küçük sarı reçine noktaları göründüğünde (Şekil 2Ci, mavi ok ucu), bu safra sisteminin tamamen dolduğunun ve reçinenin kanallardan sızmaya başladığının bir işaretidir. Küçük reçine sızıntısı mikroCT veri segmentasyonu sırasında manuel olarak düzeltilebilir (Şekil 5D, sağ paneller).
Enjeksiyon basıncı çok yüksekse, bu damarların veya kanalların yırtılmasına neden olabilir (Şekil 5E), gemi veya kanal mimarisine geri dönüşümsüz olarak zarar verebilir. Karaciğer mikroCT taraması veya analizi için uygun olmayacaktır. Yeniden satış aşırı doldurmayı önlemek için, her fare modelinde enjeksiyon için kullanılan doğru hacmi ve basıncı optimize edin. Safra veya venöz sistemleri veya karaciğer sertliğini etkileyen toksik bir diyet, genetik modifikasyon veya karaciğer hasarı ile zorlanan farelerle çalışırken, enjeksiyon basıncının ve hacminin hacim olarak ayarlanması gerekebilir ve basınç tolere edilen vahşi tip farelerden farklı olabilir. Bu protokol iki sistemin manuel enjeksiyonunu açıklar, ancak enjeksiyon basıncını standartlaştırmak için şırınnayı bir pompaya bağlamak mümkündür. Kabarcıklar, borulu ağların seyrek doldurulmasına yol açan çok yaygın bir başka enjeksiyon yapıtıdır (Şekil 5F-H, mavi ok uçları). Kabarcık oluşumunu önlemek için, şırınnanın ve borunun herhangi bir kabarcık içermediğinden, tamamen reçine ile dolduğundan ve enjeksiyondan önce reçinenin borunun ucundan damladığına emin olun. MikroCT verilerinde negatif alanlar olarak görünen küçük kabarcıklar, işlem sonrası adımlar sırasında manuel olarak düzeltilebilir, ancak bu zahmetlidir.
Taze en iyisidir Taze sarı reçine kullanmak, iki reçinenin kontrastını ve mikroCT veri segmentasyonunu önemli ölçüde etkileyen önemli bir faktördür. Yeni açılan reçine kullanıldığında (Şekil 6A), sarı reçine enjekte edilen safra kanalları (parlak beyaz) ile yeşil reçine enjekte edilen portal damarlar (parlak gri) arasında açık bir kontrast farkı vardır. Taze reçine ile enjekte edilen karaciğer, otomatik küresel eşik kullanılarak kolayca işlenir. Uzun süreli depolama ile reçine çökeltir ve kontrast azalır. 3 aylık depolamadan sonra, kontrast portal damarı safra kanalından ayırmak için hala yeterli olabilir (Şekil 6B), ancak yağış, dolu portal damarında heterojen bir opaklık olarak görülebilen iki reçinenin karıştırılmasını etkiler (Şekil 6B, mavi ok uçları). Heterojen kontrast otomatik eşiği olumsuz yönde etkiler ve işlem süresini artıran manuel düzeltmeleri gerektirir. Reçine altı aydan daha eskiyse, kontrast, sarı enjekte edilen safra kanalını sadece kontrastlarına göre yeşil enjekte edilen portal damardan ayırt etmenin mümkün olmadığı bir noktaya kadar bozulmuştur (Şekil 6C). Bu durumda, safra kanalı ve portal damar, hilar bölgesindeki çaplarına ve konumlarına göre manuel olarak parçalanmalıdır ve tüm mikroCT verileri boyunca manuel olarak takip edilmelidir. Bu prosedür son derece zaman alıcıdır ve en iyi şekilde kaçınılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig01.jpg"> Şekil 1: Reçine dökümü için enjeksiyon seti. (A) Enjeksiyon seti #1, ~30 cm uzunluğunda 30 G iğne ve PE10 borudan oluşur. Enjeksiyon seti #2, 23 G iğne ve PE50 boru ~30 cm uzunluğundadır. (B) Borunun ucu gerilir ve eğimli bir uç oluşturmak için bir açıyla kesilir. A ve B'deki cetvel, 1 cm'lik büyük artışlar, 5 mm'lik orta artışlar ve 1 mm'lik küçük artışlarla <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig01large.jpg" target="_blank">bir santimetre cetveldir.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig02.jpg"> Şekil 2: Çift reçine döküm akış şeması. (A) Perfüzyondan önce kesilmesi gereken murine venöz dolaşım sistemini ve kalbi vurgulanmış sağ kulakçıkla ve kanı dolaşım sisteminden temizlemek için perfüzyon için iğnenin yerleştirilmesi gereken sol ventrikül gösteren şematik. Vasküler basıncı azaltmak için alt vena kava böbreklerin altında kesilmelidir. (B) Safra kanalı reçine enjeksiyon akış şeması. (i) IVC'nin nerede kesilir olduğunu gösteren (A) görüntüsünü yakınlaştırın. (ii) Karaciğer hilar bölgesinden Oddi'nin sfinkterine (siyah ok uçları) kadar ortak safra kanalını (sarı noktalı çizgi) gösteren görüntü, temizlenmiş ortak safra kanalının altında dikiş ipliği ile. (iii) Ortak safra kanalı etrafında gevşek overhand knot için uygun konum. (iv) Sarı noktalı çizgi ve siyah ok uçları Oddi'nin sfinkterini etiketleerek kesi için eğik açıyı ve eğik açı kesiği sonrası açıklığın nasıl görünmesi gerektiğini gösterir. (v) Pe10 boru eğim açıklığının (yukarı) yerleştirilmesinden sonra yönünü gösteren şematik. (vi) Enjekte edilen sarı reçinenin görünümü; reçine gevşek bağlanmış düğümü kolayca geçirmelidir. IVC, alt vena kava; CBD, ortak safra kanalı. (C) Portal ven reçine enjeksiyon akış şeması. (i) Yeşil noktalı çizgi, hilar bölgesinden portal damarı işaretler. Mavi ok uçları aşırı doldurulmuş safra sistemini etiketler. (ii) Portal damar etrafında gevşek overhand düğüm için uygun konum. (iii) Ekleme sırasında eğim açıklığı (yukarı) gösteren şematik. (iv) Yeşil reçine ve sarı reçine enjeksiyonu üzerine karaciğerin görünümü; karaciğer çevresindeki reçine dolu kan damarına dikkat edin. PV, portal damar. Şekil 2A Biorender.com ile oluşturulmuştur. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig03.jpg"> Şekil 3: Hacim grafik yazılımında mikro BT veri işleme. (A) Yüzey belirleme, (i) aşırı tahmin edilmiş isovalue (seçimin mevcut önizlemesi sarı renkte gösterilmiştir), (ii) hafife alınan isovalue, (iii) portal damar ve safra kanallarının uygun yüzey tayini için en uygun isovalue seçimi. (B) Yüzey belirleme ile oluşturulan ilgi alanının (ROI) bölünmesi, (i) iletişim penceresindeki değeri yalnızca bir segmentin (en büyüğü) kalacak kadar yüksek olarak ayarlayın, (ii) sarı çerçevelerde daha küçük (hariç) parçacıklar gösterilir. (C) Verilerin yüzey yumuşatması, (i) yumuşatma işlevi sol paneldedir, (ii) yumuşatma mukavemetini 1 (maks. 2) olarak ayarlayın ve yeni yumuşatılmış yatırım getirisi, (iii) düzeltilmiş veri oluşturun. (D) Bireysel borulu sistemlerin ayrılması, (i) yüzey belirleme fonksiyonunda isovalue'yi seçime sadece safra sisteminin dahil edilmesi için ayarlayın (seçimin mevcut önizlemesi sarı renkte gösterilir), (ii) hem sistemlerin hem de sadece safra sisteminin yatırım getirisini işaretlemek ve her iki sistemin yatırım getirisinden safra sistemi yatırım getirisini çıkarmak, (iii) Portal damar gri, safra sistemi yeşil olarak gösterilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig04.jpg"> Şekil 4: İyi enjekte edilmiş safra kanalı (BD) ve portal damar (PV) sistemleri. (A) İki sisteme iki reçine enjekte edilen doğum sonrası 15 (P15) karaciğerinin sağ medial lob (RML) optik olarak temizlendi. Ölçek çubuğu 1 mm. (B) P15 RML'nin 3D işlemesi(A) portal damar vaskülatını beyaz ve safra sisteminde yeşil olarak gösterir. Ölçek çubuğu 1 mm. (C) İki sisteme iki reçine enjekte edilen yetişkin karaciğerinin RML'si optik olarak temizlendi. Ölçek çubuğu 1 mm. (D) Beyaz portal damar vaskülatını gösteren (C) ve yeşil biliyer sistemde gösterilen yetişkin RML'nin 3D işlemesi. H = hilar, P = periferik. Ölçek çubuğu 1 mm. Paneller A, B, D, Hankeova ve ark.9'un izniyle uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig05.jpg"> Şekil 5: Çift reçine karaciğer enjeksiyonlarının yaygın zorlukları. (A) Görüntü, karın boşluğunun ilk açılması sırasında yanlışlıkla aşınmış bir karaciğeri tasvir eder ve reçine kesimden (mavi ok ucu) sızmaktadır. (B) Reçine sertleşmesi nedeniyle kötü enjekte edilmiş portal damar sistemi. Mavi ok uçları boş terminal dallarını, kırmızı köşeli ayraçlar ise büyük kabarcıkları etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (C) Zayıf transkardiyal perfüzyon nedeniyle zayıf enjekte edilen portal damar sistemi. Mavi ok uçları, terminal dallarında görülebilen kanı etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (D) İzole reçine topları ile kendini gösteren aşırı doldurulmuş safra sistemi. Sol paneller optik olarak temizlenmiş karaciğeri, sağ paneller ise 3D mikroCT işlenmiş görüntüyü gösterir. Mavi noktalı anahatlar yakınlaştırma bölgelerini tasvir eder. Siyah ok uçları, mikroCT taramasından sonra optik temizleme sırasında hasar gören karaciğerin bir kısmını etiketler. Ölçek çubuğu 1 mm. (E) Reçine enjeksiyonu sırasında yüksek basınç portal damarın yırtılmasına neden olabilir (bu paneldeki hayvan, mavi ok uçları ile işaretlenmiş bir Jag1H268Q mutasyonu taşır). Ölçek çubuğu 1 mm. (F) Portal damar enjeksiyonu sırasında reçinedeki kabarcıklar (mavi ok uçları) ve (G) safra sistemi enjeksiyonu (mavi ok ucu), ölçek çubuğu 1 mm. (H) Kabarcıkların mikroKT taraması (mavi ok ucu), kötü doldurulmuş terminal dalları (kırmızı braketler) ve reçine sızıntısı (sarı ok ucu), ölçek çubuğu 1 mm <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig05large.jpg" target="_blank">. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62941/62941fig06.jpg"> Şekil 6: Diferansiyel reçine kontrastı. (A) Yeni açılmış sarı reçine, reçine enjekte edilen portal damarı (gri) ve safra kanallarını (beyaz) ayırt etmek için yeterli kontrast oluşturur. (B) Sarı reçinenin üç ay saklanması, reçinenin heterojen opaklığa (gri-beyaz portal damar, mavi ok ucu) neden olmasına neden olur. (C) Uzun süreli depolama (>6 ay) sarı reçine portal damar (gri) ve safra kanalları (gri) arasındaki kontrastı azaltır. Ölçek çubuğu 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62941/62941fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis at JoVE.com

DUCT: Double Resin Casting followed by Micro-Computed Tomography for 3D Liver Analysis

Çift reçine döküm mikro hesaplamalı tomografi veya DUCT, organ mimarisinin 3D analizini kolaylaştırmak için aynı anda iki borulu sistemin görselleştirilmesini, dijitalleşmesini ve segmentasyonunu sağlar. DUCT, iki radyopak reçinenin ex vivo enjeksiyonunu ve ardından tomografik verilerin mikro bilgisayarlı tomografi taramasını ve segmentasyonunu birleştirir.

DUCT: Çift Reçine Dökümü ve ardından 3D Karaciğer Analizi için Mikro Bilgisayarlı Tomografi

The liver is the biggest internal organ in humans and mice, and high auto-fluorescence presents a significant challenge for assessing the ...

Bu yöntem, karaciğer vasküler ve safra sistemleri mimarisini 3D olarak analiz etmemizi, görselleştirmemizi ve ölçmemizi sağlar. Artık karaciğer hastalığının ve yenilenmenin mekansal yönlerini daha iyi anlayabiliriz. Bu tekniğin temel avantajı antikorların veya floresan görüntülemenin varlığına dayanmamasıdır.Ayrıca, hangi ağların düzgün bir şekilde lümenleştirildiğinin doğrudan görselleştirilmesine izin verir. Bu yöntem tübüler sistemlerin analizi için uygundur, bu nedenle kan damarlarının, safra kanallarının ve hava yollarının araştırılması ideal alanlardır. Safra rejenerasyonu ile ilgili yapısal değişiklikleri anlamak için KANAL'ı kullandık.Reçineyi farenin safra sistemine enjekte etmeden önce, bağırsak ve pankreası farenin sol tarafına hareket ettirmeye başlayın, ortak safra kanalını ve portal damarı ortaya çıkarmak için PBS ile ıslanmış bir pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra alt vena kavasında küçük bir transversal kesi yapın. İçsel yüzeyi ve hilar bölgeyi açığa çıkarmak için karaciğerin ventral tarafını kalbe doğru çevirin ve pankreas boyunca hilar bölgesinden ve Oddi'nin sfinkterinden bağırsağa uzanan ortak safra kanalını bulun.Yaklaşık beş milimetrelik çevre doku alanını ortak safra kanalından temizlemek için düz tokmakları kullanın. Daha sonra, ortak safra kanalının altına ipek bir dikiş ipliği yerleştirerek, ortak safra kanalının etrafına gevşek bir el üstü düğüm bağlayın. Ortak safra kanalının Oddi sfinkterinin yanındaki pankreas ve bağırsağa girdiği noktada ortak safra kanalına eğik bir kesi yapmak için yay makasını ortak safra kanalına karşı düz tutun.Daha sonra, sarı reçinenin bir mililitresini MV kürleme maddesinin 50 mikrolitresi ile karıştırın ve bir mililitrelik bir şırıngayı reçine kürleyici maddesi karışımı ile doldurun. Dolu şırınnayı boru seti bir ile bağlayın ve reçine kürleme maddesi karışımı borunun ucundan damlayana kadar boruyu doldurmak için pistona basın. Ortak safra kanalı kesisinin etrafındaki alanı düzeltmek için tokaları kullanın.Boruyu, eğimli ucun en uzun kenarı ile ortak safra kanalındaki açıklığa yerleştirmeden önce, safra kanalının dorsal tarafına doğru aşağı doğru. Daha sonra ortak safra kanalının içindeki boruyu sabitlemek için ipek iplik düğümünü sıkın. Reçineyi ortak safra kanalına enjekte ettikten sonra, safra kesesini ve bireysel karaciğer loblarını gözlemleyin.Reçinenin eşit şekilde yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatılmış pamuklu çubukla masaj yapın. Reçine dolu safra kanalları terminal dalları karaciğer yüzeyinde hafifçe görülebilecektir. Karaciğerin yüzeyinde reçine noktaları göründüğünde veya direnç karşılandığında reçine enjekte etmeyi bırakın.Daha sonra ortak safra kanalından çekerek boruyu çıkarın ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için ipek düğümünü hızlı bir şekilde sertçe sıkın. İpek dikişin gevşek uçlarını kesin, böylece portal damar enjeksiyonuna müdahale etmezler. Reçineyi portal damara enjekte etmeden önce, portal damarı karaciğere girişinden yaklaşık iki santimetre uzaklıktaki çevresindeki dokusundan düz tokmaklar kullanarak temizleyin.Daha sonra gevşek bir el düğümü bağlamak için ipek dikiş ipliğini portal damarının temizlenmiş alanının altına yerleştirin. Karaciğere giden portal damarda, düğümü bağlamadan önce boyuna bir kesi yapın. Daha sonra, şırındada yeşil reçine kürleyici karışımını hazırlayın ve boruyu daha önce gösterildiği gibi karışımla doldurun.Eğimli ucun en uzun kenarı olan boruyu damarın sırt tarafına doğru yerleştirmeden önce çevredeki dokuyu kuyruk tarafına doğru çekerek portal damarı düzeltmek için tokmakları kullanın. Portal damardaki boruyu sabitlemek için ipek ipliği sıkın. Reçineyi portal damara enjekte ettikten sonra, reçine ile dolu kan damarlarını gözlemleyin ve reçinenin yayılmasına yardımcı olmak için karaciğere PBS ıslatmış pamuklu çubukla masaj yapın.Tüm kan damarları dolduğunda, boruyu portal damardan çekin ve reçinenin dışarı sızmasını önlemek için tokalar kullanarak ipek düğümünü hızla sıkın. Fareden incelenen karaciğerin mikro bilgisayarlı tomografisi veya MikroCT taraması için, sağ medial karaciğer lobunun 15 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirilmesi ve MikroCT ölçümü sırasında istenmeyen örnek hareketin en aza indirilmesi için tüpün toplam hacminin yaklaşık üçte ikisine% 1 agarose jel ile doldurun. 15 mililitrelik konik tüpü bir CT cihazının dönme aşamasına örnekle monte edin.Tüpün ölçüm odasına en az bir saat boyunca termal olarak adapte olmasını sağlayın. Numune termal olarak uyarlandığında, görüş alanına veya FOV'a ortala, ardından kaynak numune ve numune dedektör mesafelerini veya yeterli voksel çözünürlüğe ulaşmak için SSD ve SDD'yi optimize edin. Parametreler ayarlandıktan sonra bir CT ölçümü başlatın.CT verilerini yeniden oluşturmak için özel tomografik rekonstrüksiyon yazılımı kullanın. CT verilerini çözümlemek için dosya, içe aktarma ve komut seçerek dosyaları yükleyin. Genel eşik kullanarak verilerdeki reçineyi segmentlere ayırmak için üst paneldeki yüzey belirleme işlevini kullanın.Diyalog penceresinde, kırmızı izovalue çizgisinin konumunu yalnızca reçine dolu damarları segmentlere ayıracak şekilde ayarlayarak histogram değerlendirmesi ile eşik değerini belirleyin. Sol panelde, reçine dolu gemilerin ilgi alanı veya yatırım getirisi oluşturmak için hacim veya CAD veya mesh'ten yatırım getirisi oluştur modülini seçin. İletişim penceresinde, işlenen birimin adını seçmek ve onaylamak için katıdan ROI oluştur seçeneğini kullanın.Bu yatırım getirisinin arka plan bölgesindeki gürültü kümelerinin hatalı segmentasyonunu ortadan kaldırın. YZ'yi sağ tıklatıp modül bölünmüş yatırım getirisini seçerek sağ panelde işaretleyin. Diyalog penceresinde, tüm gürültü parçacıklarını dışlamak için minimum hacim voxel parametresini ayarlayın.Parametre değeri deneme ve veriye bağımlıdır ve analiz edilecek her örnek için en iyi duruma getirilmiştir. Sol panelde, reçine maliyeti yatırım getirisinde hava kabarcıklarının varlığı veya reçine sızıntısı gibi eserler olmadan pürüzsüz, sürekli ve sağlam kanal maskeleri oluşturmak için yumuşatma modülunu kullanın. CT verilerinde daha yüksek yoğunluklu değerlere sahip ortak safra kanalı enjeksiyonu için kullanılan sarı reçine gibi daha absorptif reçine ile dolu sistem için daha önce açıklandığı gibi ayrı bir yatırım getirisi oluşturun.Roi'leri çıkarmadan önce sağ tıklatıp ardından kalan borulu sistem için yeni bir yatırım getirisi oluşturmak üzere reçine maskesi yatırım getirisinden yeni yatırım getirisini çıkararak yeni yatırım getirisini işaretleyin ve yeniden işleyin. Her iki borulu sistem için elde eden ROI'leri, farklı yazılımlarda sonraki işlemler için operatör başvurularına göre çeşitli biçimlerde dışa aktarın. Elde eden ROI'leri bir birim grafik yazılımında, son görselleştirmeyi bir görüntü veya video biçiminde dışa aktarmak için daha fazla işleyin.Bu çalışmada iyi doldurulmuş intrahepatik safra kanalları ve portal damar damarı ile başarılı bir çift reçine enjeksiyonu sağlanmıştır. Temsili analiz, bir P15 faresi için iyi enjekte edilmiş bir karaciğerden ve yan dallarda reçinenin göründüğü yetişkin bir fareden elde edilen segmentlere ayrılmıştır. Tipik başarısız enjeksiyon örneğinde, cerrahi işlem sırasında karaciğerde fiziksel hasar reçinenin sızmasına neden oldu.Ayrıca enjeksiyondan önce iğnedeki veya borunun ucundaki reçinenin erken sertleşmesi ve yetersiz transkardiyal perfüzyon sistem eksik dolumuna neden oldu. Küçük reçine sızıntısı MikroCT veri segmentasyonu sırasında manuel olarak düzeltilebilir. Yüksek enjeksiyon basıncı damarları veya kanalları yırtabilir ve damar veya kanal mimarisine geri dönüşü olmayan bir şekilde zarar verebilir.Ek olarak, kabarcıklar tübüler ağların seyrek doldurulmasına yol açan çok yaygın bir başka enjeksiyon yapıtıydı. Yeni açılan reçine kullanıldığında sarı reçine enjekte edilen safra kanalları ile yeşil reçine enjekte edilen portal damarlar arasındaki kontrastta belirgin bir fark gözlenmiştir. Üç aylık depolamadan sonra, kontrast portal damarı safra kanalından ayırmak için yeterliydi.Bununla birlikte, yağış, dolu portal damarında heterojen bir opaklık olarak görülebilen iki reçinenin karıştırılmasında etkili oldu. Reçine altı aydan daha eski olduğunda, kontrast, sarı enjekte edilen safra kanalını yeşil enjekte edilen portal damardan ayırt etmenin mümkün olmadığı bir noktaya kadar geriledi, sadece kontrastlarına göre. Ortak safra kanalına eğik bir kesi yapmak çok önemlidir.Aksi takdirde boruyu takmak çok zor olacaktır. KANAL tekniği, hilar ve periferik lob bölgelerinde farklı özelliklere sahip klinik olarak ilgili bir modelde safra rejenerasyonunun yeni mimari mekanizmalarını aydınlatır.

Research

JoVE Journal

Medicine

Retrograde Perfusion and Filling of Mouse Coronary Vasculature as Preparation for Micro Computed Tomography Imaging

Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme için hazırlık olarak retrograd perfüzyon ve Fare Koroner damarları doldurulması

Visualization of the vasculature is becoming increasingly important for understanding many different disease states. While several techniques exist for ...

3-Dimensional Resin Casting and Imaging of Mouse Portal Vein or Intrahepatic Bile Duct System

3-Boyutlu Reçine Döküm ve Fare Portal Ven veya intrahepatik safra Sisteminin Görüntüleme

In  organs, the correct architecture of vascular and ductal structures is  indispensable for proper physiological function, and the formation and  ...

Osmotic Drug Delivery to Ischemic Hindlimbs and Perfusion of Vasculature with Microfil for Micro-Computed Tomography Imaging

Mikro-Bilgisayarlı Tomografi Görüntüleme için Microfil ile İskemik arka ayaklarında ve damarları bir Perfüzyon için osmotik İlaç Taşıyıcı

Preclinical research in animal models of peripheral arterial disease plays a vital role in testing the efficacy of therapeutic agents designed to ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Mikro-Bilgisayarlı Tomografi ile Çıplak Fareler içine İnsan Yağ Enjeksiyonu Canlılığına Değerlendirilmesi

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Bile Duct Ligation in Mice: Induction of Inflammatory Liver Injury and Fibrosis by Obstructive Cholestasis

Farelerde Safra Kanalı ligasyonu: Obstrüktif Kolestaz tarafından İnflamatuar Karaciğer Hasarı ve Fibrozis indüksiyonu

In most vertebrates, the liver produces bile that is necessary to emulsify absorbed fats and enable the digestion of lipids in the small intestine as well ...

Using Micro-computed Tomography for the Assessment of Tumor Development and Follow-up of Response to Treatment in a Mouse Model of Lung Cancer

Tümör Gelişim Değerlendirme Mikro bilgisayarlı Tomografi ile ve Takibi Tedavi Yanıtın Akciğer Kanseri Fare Modeli

Lung cancer is the most lethal cancer in the world. Intensive research is ongoing worldwide to identify new therapies for lung cancer. Several mouse ...

Combined Near-infrared Fluorescent Imaging and Micro-computed Tomography for Directly Visualizing Cerebral Thromboemboli

Doğrudan Serebral emboli görselleştirme için Kombine Yakın kızılötesi Floresan Görüntüleme ve Mikro bilgisayarlı Tomografi

Direct thrombus imaging visualizes the root cause of thromboembolic infarction. Being able to image thrombus directly allows far better investigation of ...

Testing Acetylcholine Followed by Adenosine for Invasive Diagnosis of Coronary Vasomotor Disorders

Koroner Vazomotor Bozuklukların İnvaziv Tanısı için Asetilkolin ve Adenozin Testi

More than 50% of patients with signs and symptoms of myocardial ischemia undergoing coronary angiography have unobstructed coronary arteries. Coronary ...

Tissue Preparation Techniques for Contrast-Enhanced Micro Computed Tomography Imaging of Large Mammalian Cardiac Models with Chronic Disease

Kronik Hastalığı Olan Büyük Memeli Kardiyak Modellerinin Kontrastlı Mikro Bilgisayarlı Tomografi Görüntülemesinde Doku Hazırlama Teknikleri

Structural remodeling is a common consequence of chronic pathological stresses imposed on the heart. Understanding the architectural and compositional ...

HE Staining and Micro-CT to Evaluate Murine Trabecular Bone Microarchitecture

Trabecular Bone Microarchitecture Evaluation in an Osteoporosis Mouse Model

An Economic and Efficient Method for Quantitative Evaluation of Bone Microarchitecture in a Murine Osteoporosis Model (Video) | JoVE

Osteoporoz Fare Modelinde Trabeküler Kemik Mikromimarisinin Değerlendirilmesi

Bone microstructure refers to the arrangement and quality of bone tissue at the microscopic level. Understanding the bone microstructure of the skeleton ...