Name: rodent heart and brain tissue preparation for digital macro photography after ischemia-reperfusion
Uploaded: 2022-02-01T14:10:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion at JoVE.com

Авторы были поддержаны научно-исследовательской и инновационной программой Европейского Союза Horizon 2020 в рамках грантового соглашения No 857394, проект FAT4BRAIN.

Экспериментальные процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами Европейского сообщества и местными законами и политикой (Директива 2010/63/ЕС), и все процедуры были одобрены Продовольственной и ветеринарной службой, Рига, Латвия.
1. Окрашивание и нарезка сердца
ПРИМЕЧАНИЕ: Методы, описанные в настоящем протоколе, могут быть использованы после анализов ИК-повреждения сердца крысы или мыши in vivo перфузированным Лангендорфом 6,7 и in vivo ИК-повреждения сердца крысы8,9,10,11. Для окрашивания после анализа in vivo IR-травмы предполагается, что сердце иссекается, устанавливается на канюлю и кратковременно перфузионируется в режиме перфузии Лангендорфа.
<ol><li>Отсоедините сердечную канюлю от шприца, заполненного раствором Кребса-Хенселейта, и соедините ее со шприцем, наполненным теплым (37 °C) раствором 0,1% метиленового синего в растворе Krebs-Henseleit. Используйте шприц 5 мл для крысиных сердец и шприц 1-2 мл для мышечных сердец. ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является заполнение аппарата, контролируемого давлением или потоком (например, Langendorff), синим раствором, содержащим краситель. Во время процедуры отслоения и монтажа важно не оставлять пузырьков воздуха в канюле и не ослаблять шов, используемый для повторного прикуса коронарной артерии.</li>
	<li>Далее перфируют сердца крыс 4 мл раствора метиленового синего со скоростью ~4 мл/мин и перфузируют сердца мышей 1 мл раствора метиленового синего со скоростью ~0,5-1 мл/мин. ПРИМЕЧАНИЕ: Исходя из опыта, оба метода безопасны и обеспечивают адекватное окрашивание; тем не менее, использование насоса с регулируемым давлением / гидростатической системы давления является более трудоемким, но более безопасным вариантом против чрезмерного загрязнения для начинающих ученых.</li>
	<li>Отсоедините канюлю от шприца и извлеките сердце из канюли.</li>
	<li>Удалите излишки метиленового синего, аккуратно раскатывая сердце на папиросной бумаге. Ослабьте лигатуру вокруг коронарной артерии, открыв гемостатические щипцы и удалив пластиковую трубку из хирургического шва только после удаления избытка метиленового синего. ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе можно поместить сердце мыши в небольшой полиэтиленовый пакет или микротрубку центрифуги объемом 5 мл в морозильную камеру (-20 °C) на срок до 5-10 мин. Максимальное время замораживания должно определяться экспериментально в каждой лаборатории. Кратковременное замораживание сердца мыши может помочь начинающему экспериментатору разрезать его на кусочки толщиной 1 мм. Замораживание крысиных сердец не рекомендуется. Следует избегать чрезмерной заморозки в течение более 10 мин при -20 °C.</li>
	<li>Поместите окрашенное сердце крысы в матрицу из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов) для нарезки сердца (рисунок 1А). Затем разрежьте желудочки сердца на ломтики толщиной 2 мм (цельтесь в 6-7 кусочков сердца взрослой крысы). Для мышечных сердец разрежьте желудочки сердца на кусочки толщиной 1,5 мм (стремитесь как минимум к 4 кусочкам сердца взрослой мыши). ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать бритвенные лезвия, совместимые с нарезкой матрицы. В общем, совместимые лезвия бритвы с одним лезвием (например, толщиной до 0,01 дюйма (0,254 мм)) могут использоваться для нарезки крысиных сердец. Лезвия бритвы с двойными краями обычно используются для сердец мышей и обычно имеют толщину до 0,004 дюйма (0,1 мм).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig01.jpg"> Рисунок 1: Матрицы для нарезки сердца и мозга крысы. (А) Сердце крысы, (Б) мозг крысы. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<ol start="6"><li>После нарезки переложите ломтики в пластиковую трубку объемом 15 мл. Добавьте 5 мл 1% трифенилтетразолия хлорида (TTC), растворенного в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS), в трубку с сердечными ломтиками и инкубируйте в течение 10 мин на водяной бане при 37 °C.</li>
	<li>После инкубации в растворе ТТС промыть срезы сердца не менее 2-3 раз ПБС и подготовить к захвату изображения.</li>
</ol>2. Окрашивание и нарезка мозга
<ol><li>После эксперимента по окклюзии средней мозговой артерии3,12 удалите мозг, включая ствол мозга, из черепа и промыть его ледяным PBS.</li>
	<li>Выберите правильный размер мозговой матрицы из нержавеющей стали (см. Таблицу материалов) в зависимости от веса животных (рисунок 1В). Поместите мозг вентральной стороной вверх в мозговой матрице. ПРИМЕЧАНИЕ: При нахождении в матрице вентральная поверхность мозга должна быть параллельна верхней поверхности формы.</li>
	<li>Используя лезвия, ограничьте лобную и каудальную части (по 2 лезвия с обеих сторон) мозга. ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо использовать бритвенные лезвия, совместимые с нарезкой матрицы. В общем, совместимое лезвие бритвы с одним лезвием (толщина до 0,01 дюйма (0,254 мм)) может быть использовано для нарезки мозга крысы.</li>
	<li>Поместите лезвия частично (не полностью разрезая мозг) в каналы между первым и последним лезвиями. Когда все лезвия вставлены и расположены параллельно, прижмите все лезвия ладонью одновременно, чтобы разрезать мозг на корональные срезы 2 мм.</li>
	<li>Два пальца крепко обхватите лезвия по бокам и выньте их вместе с разрезанным мозгом из матрицы.</li>
	<li>Разложите кусочки мозга один за другим в лоток (70 мл, 72 х 72 мм). При расстановке ломтиков убедитесь, что передняя поверхность каждого среза всегда обращена вверх.</li>
	<li>Налейте теплый (+37 °C) 1% раствор TTC в PBS на срезы мозга и инкубируйте их в течение 8 мин при 37 °C в темноте. ПРИМЕЧАНИЕ: Срезы мозга должны быть полностью погружены в раствор ТТС во время инкубации.</li>
	<li>После инкубации в 1% растворе TTC переложите срезы мозга в синий пластиковый лоток для захвата изображений. Расположите срезы мозга в последовательном порядке от лобной к каудальной части и используйте скальпель для разделения полушарий в сагиттальной плоскости. ПРИМЕЧАНИЕ: Поверхность лотка должна быть моющейся, матовой и цвета, контрастирующего с кусочками мозга (т.е. не красной, белой или бледно-розовой).</li>
</ol>3. Макросъемка
<ol><li>Сфотографируйте срезы ткани сразу после окрашивания. ПРИМЕЧАНИЕ: Сердечные срезы можно хранить в холодном PBS (при +4 °C) или растворе формалина до 30 мин. Срезы мозга могут храниться в формалине в течение длительного периода (1-2 недели).</li>
	<li>Настройте камеру по своему выбору с заряженной батареей, картой памяти и прикрепленным объективом на подставке (рисунок 2) ПРИМЕЧАНИЕ: Включите свет по крайней мере за 5-10 минут до получения изображения, чтобы разогреть оборудование. Светодиодные фонари достигают полной яркости за микросекунды.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig02.jpg"> Рисунок 2: Камера и освещение, настроенные для макросъемки. Камера перпендикулярна поверхности изображения, чтобы гарантировать, что фокальная плоскость камеры параллельна образцам. Аббревиатура: LED = светодиод. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<ol start="3"><li>В зависимости от доступных источников света выберите соответствующие настройки баланса белого или выполните калибровку цветовой температуры в соответствии с инструкциями в руководстве по эксплуатации камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: Белый светодиодный свет (цветовая температура 6 500 К) является предпочтительным источником света, чтобы избежать мерцания света люминесцентными лампами.</li>
	<li>Переключите камеру в полностью ручной режим, установите ISO 100 и диафрагму на f / 10 и отрегулируйте выдержку для оптимальной экспозиции изображения. Убедитесь, что фокальная плоскость камеры параллельна поверхности, на которую будет помещен образец. ПРИМЕЧАНИЕ: Функция гистограммы полезна для обеспечения того, чтобы срезы ткани не подвергались переэкспонированию.</li>
	<li>Подключите или включите проводной или беспроводной дистанционный триггер, чтобы предотвратить дрожание камеры при отпускании затвора. ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативой является включение функции замедленного затвора, которая будет задерживать триггер на 2 или 10 с после нажатия кнопки триггера.</li>
	<li>Полностью погрузите сердечные срезы в контейнер с PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Погруженные слайды, как правило, уплывают от своего положения. Чтобы свести к минимуму плавание ломтиков, используйте наименьший возможный лоток, в который могут поместиться все ломтики, и минимальное количество погружного раствора, гарантируя, что образец полностью погружен. Альтернативные методы включают размещение срезов между стеклянными слайдами или использование поляризационного фильтра на объективе. Круговой поляризационный фильтр прикрепляется к объективу и поворачивается до тех пор, пока отражения в дисплее камеры в режиме реального времени не исчезнут.</li>
	<li>Разложите ломтики мозга в сухом лотке без PBS или других жидкостей. ПРИМЕЧАНИЕ: Поляризационный фильтр очень удобен для захвата изображений срезов мозга.</li>
	<li>Поместите контейнер с ломтиками под камеру с макрообъективом и убедитесь, что все срезы полностью помещаются в поле зрения. Убедитесь, что срезы находятся на одной плоскости, т.е. не изогнуты и не свернуты.</li>
	<li>Проверьте экспозицию и при необходимости отрегулируйте параметры камеры. ПРИМЕЧАНИЕ: После установки не изменяйте экспозицию и другие настройки в течение всего эксперимента.</li>
	<li>Запишите номер (или другую идентификацию) образца и визуализируйте срез ткани с помощью удаленного триггера. ПРИМЕЧАНИЕ: Маркер размера, такой как линейка мм, должен быть включен в поле зрения, когда необходима абсолютная количественная оценка размера образца.</li>
	<li>Поверните фрагменты и захватите их изображения с другой стороны.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bell, R. M., Mocanu, M. M., Yellon, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrograde+heart+perfusion:+the+Langendorff+technique+of+isolated+heart+perfusion.">Retrograde heart perfusion: the Langendorff technique of isolated heart perfusion.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (6), 940-950 (2011).</li><li>Botker, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+guidelines+for+rigor+and+reproducibility+in+preclinical+and+clinical+studies+on+cardioprotection.">Practical guidelines for rigor and reproducibility in preclinical and clinical studies on cardioprotection.</a> Basic Research in Cardiology. 113 (5), 39 (2018).</li><li>Uluc, K., Miranpuri, A., Kujoth, G. C., Akture, E., Baskaya, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focal+cerebral+ischemia+model+by+endovascular+suture+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery+in+the+rat.">Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e1978 (2011).</li><li>Zvejniece, L., Svalbe, B., Liepinsh, E., Pulks, E., Dambrova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sensorimotor+and+cognitive+deficits+in+rats+following+90-+and+120-min+transient+occlusion+of+the+middle+cerebral+artery.">The sensorimotor and cognitive deficits in rats following 90- and 120-min transient occlusion of the middle cerebral artery.</a> Journal of Neuroscience Methods. 208 (2), 197-204 (2012).</li><li>Liepinsh, E., Kuka, J., Dambrova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Troubleshooting+digital+macro+photography+for+image+acquisition+and+the+analysis+of+biological+samples.">Troubleshooting digital macro photography for image acquisition and the analysis of biological samples.</a> Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 98-106 (2013).</li><li>Kolwicz, S. C., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cardiac+function+and+energetics+in+isolated+mouse+hearts+using+31P+NMR+spectroscopy.">Assessment of cardiac function and energetics in isolated mouse hearts using 31P NMR spectroscopy.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (42), e2069 (2010).</li><li>Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+and+assessment+of+ischemia-reperfusion+injury+in+Langendorff-perfused+rat+hearts.">Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in Langendorff-perfused rat hearts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (101), e52908 (2015).</li><li>Liepinsh, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+L-carnitine+biosynthesis+and+transport+by+methyl-gamma-butyrobetaine+decreases+fatty+acid+oxidation+and+protects+against+myocardial+infarction.">Inhibition of L-carnitine biosynthesis and transport by methyl-gamma-butyrobetaine decreases fatty acid oxidation and protects against myocardial infarction.</a> British Journal of Pharmacology. 172 (5), 1319-1332 (2015).</li><li>Nakamura, K., Al-Ruzzeh, S., Ilsley, C., Yacoub, M. H., Amrani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+effect+of+cerivastatin+on+cardiac+regional+ischemia+in+a+rat+model+mimicking+off-pump+coronary+surgery.">Acute effect of cerivastatin on cardiac regional ischemia in a rat model mimicking off-pump coronary surgery.</a> Journal of Cardiac Surgery. 20 (6), 507-511 (2005).</li><li>Li, Q., Morrison, M. S., Lim, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+cardiac+anchor+to+refine+myocardial+infarction+surgery+in+the+rat.">Using a cardiac anchor to refine myocardial infarction surgery in the rat.</a> Lab Animal. 39 (10), 313-317 (2010).</li><li>Wu, Y., Yin, X., Wijaya, C., Huang, M. H., McConnell, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acute+myocardial+infarction+in+rats.">Acute myocardial infarction in rats.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (48), e2464 (2011).</li><li>Vavers, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroprotective+effects+of+R-phenibut+after+focal+cerebral+ischemia.">The neuroprotective effects of R-phenibut after focal cerebral ischemia.</a> Pharmacological Research. 113, 796-801 (2016).</li><li>Acin-Perez, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+approach+to+measure+mitochondrial+respiration+in+frozen+biological+samples.">A novel approach to measure mitochondrial respiration in frozen biological samples.</a> EMBO Journal. 39 (13), 104073 (2020).</li><li>Kloner, R. A., Darsee, J. R., DeBoer, L. W., Carlson, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+pathologic+detection+of+acute+myocardial+infarction.">Early pathologic detection of acute myocardial infarction.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 105 (8), 403-406 (1981).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конфликта интересов.

На протяжении десятилетий фотография и анализ образцов сердечной и мозговой тканей были важной частью экспериментов в области наук о жизни. Прогресс науки и инноваций стимулирует разработку дорогостоящих микроскопов, способных к сверхразрешению. Микрофотографии получаются в хорошо контролируемой световой среде в соответствии с подробными инструкциями. Напротив, макросъемка (при увеличении 1:2 или выше) часто выполняется в неконтролируемой световой среде с использованием неподходящих настроек изображения. Часто методы пробоподготовки и настройки камеры нуждаются в существенной оптимизации. В результате макрофотографы ограниченного качества были широко опубликованы в научных журналах. Недостаточное разрешение изображения и контрастность ограничивают возможности точной количественной оценки изображения в ИК-исследованиях.
Подробно описаны экспериментальные процедуры инфарктов миокарда1,2 и головного мозга3,4. Целью данного исследования является предоставление пошагового руководства о том, как настроить систему фотосъемки и стандартизированного анализа образцов сердца и мозговой ткани грызунов после экспериментов с инфарктом. Это включает в себя нарезку тканей, окрашивание и макрофотографию образцов сердца и мозга. Подготовка образцов тканей является неотъемлемой частью эксперимента, и результаты планиметрического анализа изображений сильно зависят от качества полученных изображений5.
Эти методы особенно полезны для выполнения измерений и планиметрического анализа изображений в тканях грызунов и могут представлять ценность для общенаучной макрофотографии. Кроме того, высокое качество и согласованность изображений позволяют выполнять автоматизированный анализ цифровых фотографий, что помогает сэкономить время, избежать пользовательского ввода и минимизировать риск ошибок или смещений при анализе изображений. Это приведет к генерации надежных и надежных данных и увеличит трансляцию доклинических открытий в новые антиишемические методы лечения в клиниках.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 mL syringe</td>
			<td>Sagimed</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>298-96-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL syringe</td>
			<td>Sagimed</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult Rat Brain Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BSRAS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula for mouse heart</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>SP3787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aortic cannula for rat heart</td>
			<td>ADInstruments</td>
			<td>SP3786</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate, &#8805;99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>207780010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover Glass Forceps, Angled</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11073-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>13008-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoya 62 mm alpha Circular Polarizer Filter</td>
			<td>Hoya</td>
			<td>HOCPA62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate</td>
			<td>Penta</td>
			<td>16330-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylene Blue</td>
			<td>SigmaAldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse Heart Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSMS005-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene plastic tubing</td>
			<td>BD Intramedic</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride for biochemistry</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>418205000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate, monobasic, &#8805;99%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>205920025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat Heart Slicer Matrix</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>HSRS001-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors curved with blunt ends</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>14013-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors for cleaning heart</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>14058-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Edge Razor Blades</td>
			<td>Zivic Instruments</td>
			<td>BLADE012.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate for biochemistry, 99.5%</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>447100010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Fisher bioreagents</td>
			<td>BP358-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony Alpha a6000 Mirrorless Digital Camera</td>
			<td>Sony</td>
			<td>ILCE6000</td>
			<td>Can be repalaced by any up-to-date digiatal camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony FE 90 mm F/ 2.8 Macro G OSS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>SEL90M28G</td>
			<td>Important, lens should be compatible with camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sony SF32UZ SDHC 32 GB Class 10 UHS</td>
			<td>Sony</td>
			<td>2190246141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blade</td>
			<td>Heinz Herenz Hamburg Germany</td>
			<td>BS2982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo-Shaker</td>
			<td>BioSan</td>
			<td>PST-60HL-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed tissue forceps</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>11021-12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toothed tissue forceps for cleaning heart</td>
			<td>Agnthos</td>
			<td>11023-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh tray, 70 mL</td>
			<td>Sarsted</td>
			<td>71,99,23,212</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rodent heart and brain tissue preparation for digital macro photography after ischemia-reperfusion

Макросъемка применима для визуализации различных образцов тканей с большим увеличением для выполнения качественного и количественного анализа. Подготовка тканей и последующий захват изображения являются этапами, выполняемыми сразу после эксперимента с ишемией-реперфузией (ИК) и должны выполняться своевременно и с соответствующей осторожностью. Для оценки ИК-индуцированных повреждений в сердце и головном мозге в этой статье описывается окрашивание на основе 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорида (ТТС) с последующей макрофотографией. Научная макросъемка требует контролируемого освещения и соответствующей настройки изображения. Стандартизированная методология обеспечивает высокое качество, детализированные цифровые изображения, даже если используется комбинация недорогой современной цифровой камеры и макрообъектива. Обсуждаются правильные методы и потенциальные ошибки в подготовке образцов и получении изображения, а также приводятся примеры влияния правильных и неправильных настроек на качество изображения. Предоставляются конкретные советы о том, как избежать распространенных ошибок, таких как чрезмерное загрязнение, неправильное хранение образцов и неоптимальные условия освещения. В этой статье показана соответствующая методология нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга крыс, а также приведены рекомендации по созданию освещения и настроек камер и методов фотографии для получения изображений с высоким разрешением.

Фиг.3А представляет собой фотографию метиленового сине- и TTC-окрашенного среза сердца после инфаркта миокарда, которая содержит достаточно подробной и цветовой информации для дальнейшего планиметрического анализа размеров инфаркта (рисунок 3B). Мы проверили, как замораживание сердца в течение 24 ч влияет на целостность тканей сердца (рисунок 3С). Замораживание в течение длительного периода (>1 ч, рисунок 3С) снижает функцию митохондрий; таким образом, окрашивание сердца TTC не красное, а бледно-розовое, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями размыта (рисунок 3C).
Далее сравнивались два метода уменьшения отражений в образцах. Погружение является наиболее эффективным методом и дает подробные изображения с хорошей контрастностью (рисунок 4A). Второй способ заключается в использовании поляризационного фильтра, прикрепленного к линзе. Поляризационный фильтр также эффективен; однако фильтр немного уменьшает разрешение и микроконтраст изображения (рисунок 4B). Пример изображения сердечного среза без погружения или фильтра (рисунок 4С) содержит много отражений и не подходит для дальнейшего анализа.
Срезы мозга не погружаются из-за проблем управления срезами (плавающих). В планиметрическом анализе важно сравнить незатронутую (здоровую) сторону мозга (рисунок 5А) с пораженной инсультом стороной (рисунок 5B). Срезами мозга легче управлять на сухой пластине или лотке, а для удаления отражений используется поляризационный фильтр. Лоток с синим фоном используется для фотографирования среза мозга (выбор фона описан ранее5).
Ручные настройки камеры использовались для обеспечения полного контроля экспозиции и баланса белого. Настройки камеры должны быть отрегулированы до или в начале эксперимента в соответствии с имеющимся источником света. Это обеспечивает оптимальную экспозицию и баланс белого всех изображений для обеспечения равномерного анализа (рисунок 6A). Автоматические настройки камеры не идеальны и могут привести к изменению параметров камеры, что приводит к неадекватным результатам и введению изменчивости изображения к изображению.
На рисунке 6 показаны примеры переэкспонированных (рисунок 6B) и недоэкспонированных изображений (рисунок 6C) срезов сердца. Достаточное внимание следует уделить правильным настройкам баланса белого камеры в соответствии с конкретным источником света, используемым в настройке освещения камеры. Неправильные настройки баланса белого могут привести к смещению изображения на синий или желтый (рисунок 6D) и пурпурный или зеленый (рисунок 6E).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig03.jpg"> Рисунок 3: Изображения сердечных срезов крыс. (A) Свежий срез сердца был проанализирован в программном обеспечении ImageProPlus 6.3 с использованием цветовой сегментации (B). (C) Окрашивание TTC плохо различает жизнеспособную и некротическую ткань в замороженном сердечном срезе (замороженном в течение 24 ч). Аббревиатура: TTC = 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорид. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig04.jpg"> Рисунок 4: Методы уменьшения отражений. Изображение среза сердца крысы снято погруженным в PBS (A) и с использованием поляризационного фильтра (B). (C) Срез сердца с отражениями, когда не используется ни погружение, ни фильтр. Аббревиатура = PBS = фосфатно-буферный физиологический раствор. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig05.jpg"> Рисунок 5: Изображения срезов мозга крысы. Мозг крысы разрезали на семь ломтиков и окрашивали ТТС после ишемии-реперфузии. Использование поляризационного фильтра приводит к получению изображения без отражения. (A) Срезы из неповрежденного полушария; (B) Срезы из полушария, пораженного инсультом. Аббревиатура: TTC = 2,3,5-трифенил-2H-тетразолия хлорид. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig05large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62942/62942fig06.jpg"> Рисунок 6: Изображения среза сердца крысы. Правильно (A) и неправильно (B-E) захватили изображения среза сердца. Неправильные настройки экспозиции приводят к переэкспонированным (B) и недоэкспонированным изображениям (C). Неправильные настройки баланса белого приводят к желтому (D) или зеленому оттенку на изображении (E). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62942/62942fig06large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion at JoVE.com

Rodent Heart and Brain Tissue Preparation for Digital Macro Photography after Ischemia-reperfusion

Здесь представлен протокол стандартизированной методологии подготовки тканей грызунов после эксперимента с ишемией-реперфузией и руководство по созданию освещения и настроек камер для получения изображения с высоким разрешением. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.

Подготовка сердца и мозговой ткани грызунов к цифровой макрофотографии после ишемии-реперфузии

Macro photography is applicable for imaging various tissue samples at high magnification to perform qualitative and quantitative analyses. Tissue ...

Этот протокол показывает соответствующую методологию для нарезки и окрашивания тканей сердца и мозга. В нем также содержатся рекомендации по установке освещения и камеры, а также методы фотосъемки для получения изображений. Эти методы особенно полезны для выполнения измерений при планиметрическом анализе изображений в тканях грызунов и могут представлять ценность для общенаучной макрофотографии.Для начала отсоедините сердечную канюлю от шприца, заполненного раствором Кребса-Генселеита и подключенного к шприцу, заполненному теплым раствором Кребса-Генселеита, содержащим 0,1% метиленового синего. Перфузируйте сердце крысы четырьмя миллилитрами раствора метиленового синего со скоростью четыре миллилитра в минуту. После отсоединения канюли от шприца и удаления сердца из канюли удалите избыток метиленового синего, аккуратно раскатывая сердце на папиросной бумаге.После удаления избытка метиленового синего ослабьте лигатуру вокруг коронарной артерии, открыв гемостатические щипцы и удалив пластиковую трубку вокруг хирургического шва. Затем поместите окрашенное сердце крысы в матрицу из нержавеющей стали для нарезки. Разрежьте желудочки на ломтики толщиной в два миллиметра, стремясь получить шесть-семь ломтиков от одного сердца взрослой крысы.После нарезки переложите ломтики в 15-миллилитровую пластиковую трубку. Затем добавить пять миллилитров 1%-трифенилтетразолия хлорида, растворенного в PBS, в трубку с сердечными ломтиками и инкубировать в течение 10 минут на водяной бане при 37 градусах Цельсия с мягким перемешиванием через пять минут. После инкубации промыть кусочки сердца не менее двух-трех раз PBS и подготовиться к захвату изображения.После удаления мозга, включая ствол мозга, из черепа поместите мозг с его вентральной стороной вверх в матрицу мозга. В зависимости от веса животных, выбирайте правильный размер мозговой матрицы из нержавеющей стали. Используя лопасти, ограничьте лобную и каудальную части мозга.Затем поместите лопасти частично в каналы между первым и последним лезвиями. Когда все лезвия вставлены и расположены параллельно, прижмите все лезвия ладонью одновременно, чтобы разрезать мозг на двухмиллиметровые корональные срезы. Затем двумя пальцами крепко обхватите лезвия по бокам и извлеките их вместе с разрезанным мозгом из матрицы.Расположите кусочки мозга один за другим в лотке, гарантируя, что внутренняя поверхность каждого среза всегда обращена вверх. Затем вылейте теплый 1% раствор трифенилтетразолия хлорида и PBS на ломтики мозга и инкубируйте в течение восьми минут при 37 градусах Цельсия в темноте. После инкубации переместите кусочки мозга в синий пластиковый лоток для захвата изображений.Расположите срезы мозга в последовательном порядке от лобной к каудальной части и используйте скальпель для разделения полушарий в сагиттальной плоскости. Сфотографируйте срезы ткани сразу после окрашивания. Установите камеру по своему выбору с заряженной батареей, картой памяти и прикрепленным объективом на подставке.В зависимости от доступных источников света выберите соответствующие настройки баланса белого или выполните калибровку цветовой температуры в соответствии с инструкциями в руководстве по эксплуатации камеры. Полностью погрузите сердечные срезы в контейнер с PBS. Разложите ломтики мозга в сухом лотке без PBS или других жидкостей.Поместите контейнер с срезами под камеру с макрообъективом. Убедитесь, что все фрагменты полностью помещаются в поле зрения и находятся на одной плоскости. Переключите камеру в полностью ручной режим, установите ISO 100 и диафрагму на F10.Отрегулируйте выдержку для оптимальной экспозиции изображения и убедитесь, что фокальная плоскость камеры параллельна поверхности, где находится образец. После захвата номера образца поверните круговой поляризационный фильтр до тех пор, пока не исчезнут отражения, и визуализируйте срез ткани с помощью дистанционного триггера, чтобы предотвратить дрожание камеры при отпускании затвора, затем поверните срезы и захватите изображения с другой стороны. Эта фотография среза сердца, окрашенного метиленовым синим и трифенилтетразолием хлоридом после инфаркта миокарда, содержит достаточно подробной и цветовой информации для дальнейшего планиметрического анализа размеров инфаркта.Замораживание сердечной ткани в течение 24 часов влияет на целостность и снижает митохондриальную функцию. Таким образом, трифенилтетразолийхлоридное окрашивание сердца не красный, а бледно-розовый, а граница между некротическими и жизнеспособными тканями размыта. Из двух методов, сравниваемых для уменьшения отражений в образцах, погружение является наиболее эффективным методом и дает подробные изображения с хорошей контрастностью.Поляризационный фильтр также эффективен, однако он немного снижает разрешение и микроконтраст изображения. Изображение среза сердца без погружения или фильтра содержит множество отражений и не подходит для дальнейшего анализа. В планиметрическом анализе незатронутую сторону мозга следует сравнивать с пораженной инсультом стороной.Ручные настройки камеры обеспечивают оптимальную экспозицию и баланс белого всех изображений, обеспечивая равномерный анализ. Примеры переэкспонированных и недоэкспонированных изображений срезов сердца показаны здесь. Кроме того, неправильные настройки баланса белого приводят к смещению изображения на синий или желтый и пурпурный или зеленый оттенок.Научная макрофотография требует контролируемого освещения и соответствующей настройки изображения. Стандартизированная методология обеспечивает высококачественные, детализированные цифровые изображения. Этот метод применим ко всем экспериментальным фотографиям органов мелких животных.

Research

JoVE Journal

Medicine

Normothermic Cardiac Arrest and Cardiopulmonary Resuscitation: A Mouse Model of Ischemia-Reperfusion Injury

Нормотермической остановку сердца и сердечно-легочной реанимации: мышиной модели ишемии-реперфузии

Acute Kidney Injury (AKI) is a common, highly lethal, complication of critical illness which has a high mortality1-4 and which is most 
frequently caused ...

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury (IRI) of the Rat Cremaster Muscle

Real-time Digital Imaging of Leukocyte-endothelial Interaction in Ischemia-reperfusion Injury IRI of the Rat Cremaster Muscle

В режиме реального времени Digital Imaging лейкоцитов-эндотелиальной взаимодействия при ишемии-реперфузии (ИРИ) в мышцах Кремастер Крысы

Ischemia-reperfusion injury (IRI) has been implicated in a large array of pathological conditions such as cerebral stroke, myocardial infarction, ...

A Murine Model of Myocardial Ischemia-reperfusion Injury through Ligation of the Left Anterior Descending Artery

Мышиной модели ишемии миокарда-реперфузии через перевязки левой передней нисходящей артерии

Acute or chronic myocardial infarction (MI) are cardiovascular events resulting in high morbidity and mortality. Establishing the pathological mechanisms ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Кислород-Глюкоза Лишение и реоксигенации в<em&gt; In Vitro</em&gt; Ишемии Травмы моделью для изучения гематоэнцефалического барьера дисфункции

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Ткань Характеристика после нового метода Дезагрегирование для кожи Micro-трансплантатов поколения

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Мышиной модели кишечная ишемия-реперфузии

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Evaluation of Coronary Flow Reserve After Myocardial Ischemia Reperfusion in Rats

Оценка коронарного потока резерва после миокарда ишемия Реперфузия у крыс

Coronary artery disease is the leading cause of death worldwide. After an acute myocardial infarction, early and successful myocardial intervention via ...

Delayed Intramyocardial Delivery of Stem Cells after Ischemia Reperfusion Injury in a Murine Model

Задержка интрамиокарда Доставка стволовых клеток после травмы ишемии реперфузии в модели Murine

There is significant interest in the use of stem cells (SCs) for the recovery of cardiac function in individuals with myocardial injuries. Most commonly, ...

Organ Ischemia-Reperfusion Injury by Simulating Hemodynamic Changes in Rat Liver Transplant Model

Травма ишемии-реперфузии органов путем моделирования гемодинамических изменений в модели трансплантации печени крыс

Orthotopic liver transplantation (OLT) in rats is a tried and proven animal model used for preoperative, intraoperative, and postoperative studies, ...

Real-Time Assessment of Spinal Cord Microperfusion in a Porcine Model of Ischemia/Reperfusion

Оценка микроперфузии спинного мозга в свиной модели ишемии/реперфузии в режиме реального времени

Spinal cord injury is a devastating complication of aortic repair. Despite developments for the prevention and treatment of spinal cord injury, its ...