Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

تم دعم هذه الدراسة جزئيا من خلال المنح المقدمة من مركز Mayo Clinic للطب التجديدي ، ومؤسسة J. W. Kieckhefer ، ومؤسسة آل نهيان ، والطب التجديدي في مينيسوتا (RMM 101617 TR 004) ، والمعاهد الوطنية للصحة (DK107255).

1. تصنيع الجهاز
<ol><li>قم بعمل تصميمات لجهاز التغليف الدقيق وجهاز التفكك باستخدام برنامج CAD10,11.</li>
	<li>قم بتغطية الطبقات الثلاث من SU-8 المقاومة للضوء بالتتابع على رقاقة السيليكون (الشكل 2A) لتحقيق هياكل ذات ارتفاعات مطلوبة: 60 و 100 و 150 ميكرومتر. مل...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

تؤدي عملية التغليف الموصوفة هنا إلى تكوين كروي hPSC قابل للتكرار. يجعل شكل الكبسولة الدقيقة من السهل توزيع الكرويات في آبار صفيحة ميكروتيتر للتجارب التي تهدف إلى تحسين / تحسين بروتوكولات التمايز أو اختبار العلاجات. يمكن أيضا استخدام كرويات الخلايا الجذعية المغلفة في مزارع التعليق حيث تحمي ...

هناك اهتمام كبير في الثقافات ثلاثية الأبعاد للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي يوفرها تنسيق الثقافة هذا1،2،3. عادة ما يتم تشكيل hPSCs في كرويات أو تنسيقات أخرى للثقافة ثلاثية الأبعاد عن طريق المفاعلات الحيوية والآبار الدقيقة والمواد الهلامية المائية والسقالات البوليمرية4،5،6. يوفر التغليف وسيلة أخرى لتنظيم hPSCs مفردة في كرويات. بمجرد تغليف الكريات hPSC ، يمكن التعامل معها بسهولة ونقلها إلى لوحات microtiter للتمايز أو نمذجة الأمراض أو تجارب اختبار المخدرات. كما أن تغليف hPSCs في طبقة هيدروجيل يحمي الخلايا من تلف القص ويسمح بزراعة الكرويات في مفاعل حيوي بمعدلات عالية من التحريك7.
تطورت منهجيتنا لتغليف الخلايا الجذعية بمرور الوقت. أولا، ركزنا على الجسيمات الدقيقة الهيدروجيل الصلبة وأظهرنا نجاحا في تغليف وزراعة الخلايا الجذعية الجنينية للفئران (mESCs)8. ومع ذلك، لوحظ أن الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لها صلاحية منخفضة عند تغليفها في مثل هذه الجسيمات الدقيقة الهيدروجيلية، ويرجع ذلك على الأرجح إلى زيادة حاجة هذه الخلايا إلى إعادة الاتصال بين الخلايا والخلايا بعد التغليف. لقد استنتجنا أن الكبسولة الدقيقة غير المتجانسة ، التي تمتلك نواة مائية ، قد تكون أكثر ملاءمة لتغليف الخلايا التي تعتمد على إعادة التأسيس السريع لاتصالات الخلايا الخلوية. تم تكييف مفهوم جهاز الموائع الدقيقة الذي يركز على التدفق المحوري المشترك لصنع كبسولات صغيرة من الغلاف المائي الأساسي / الهيدروجيل من He et al.9 ، ولكن بدلا من الجينات المستخدمة في النهج الأصلي ، تم دمج هيدروجيل قائم على PEG في القشرة. لقد أظهرنا لأول مرة التغليف الناجح والتكوين الكروي لخلايا الكبد الأولية في الكبسولات الدقيقة ذات القشرة الأساسية10 ووصفنا مؤخرا تغليف خلايا hES و iPS7. كما هو موضح في الشكل 1A ، يتم تصنيع الكبسولات في جهاز تركيز التدفق حيث تنتقل تيارات التدفق الصدفي والأساسي من جانب إلى آخر إلى التدفق المحوري المشترك قبل الطرد إلى مرحلة الزيت. يحتوي التدفق الأساسي على خلايا وإضافات تزيد من لزوجة المحلول (PEG MW 35kD غير التفاعلي و iodixanol - الاسم التجاري OptiPrep) بينما يحتوي تيار القشرة على جزيئات تفاعلية (PEG-4-Mal). يتم فصل تيار التدفق المحوري المشترك المستمر إلى قطرات تحتفظ ببنية الغلاف الأساسي. يتم جعل بنية الغلاف الأساسي دائمة عن طريق التعرض ل di-thiol crosslinker (DTT) ، والذي يتفاعل مع PEG-4-Mal عبر كيمياء النقر ويؤدي إلى تكوين جلد هيدروجيل رقيق (~ 10 ميكرومتر) أو قذيفة. بعد كسر المستحلب ونقل الكبسولات إلى مرحلة مائية ، تنتشر جزيئات PEG من القلب ويتم استبدالها بجزيئات الماء. هذا يؤدي إلى كبسولات مائية أساسية وهيدروجيل قذيفة.
فيما يلي إرشادات خطوة بخطوة حول كيفية صنع أجهزة الموائع الدقيقة ، وكيفية تحضير الخلايا ، وكيفية إجراء تغليف hPSCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

توفر الثقافات ثلاثية الأبعاد (3D) أو الكروية للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) فوائد تحسين نتائج التمايز وقابلية التوسع. في هذه الورقة ، نصف استراتيجية للتكوين القوي والقابل للتكرار للكرويات hPSC حيث يتم استخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك لمحاصرة hPSCs داخل كبسولات microcapsule الأساسية shell. يحتوي الحل الأساسي على تعليق خلية واحدة من hPSCs وتم جعله لزجا من خلال دمج البولي (الإيثيلين جلايكول) عالي الوزن الجزيئي (PEG) ووسائط تدرج الكثافة. يتكون تيار القشرة من PEG-4 arm-maleimide أو PEG-4-Mal ويتدفق جنبا إلى جنب مع التيار الأساسي نحو تقاطعين نفطيين متتاليين. حدث تكوين القطيرات عند تقاطع الزيت الأول مع محلول قذيفة يلتف حول القلب. حدث التشابك الكيميائي للقذيفة عند تقاطع الزيت الثاني عن طريق إدخال رابط متقاطع ثنائي الثيول (1,4-dithiothreitol أو DTT) إلى هذه القطرات. يتفاعل الرابط المتقاطع مع المجموعات الوظيفية الماليميدية عبر كيمياء النقر ، مما يؤدي إلى تكوين قشرة هيدروجيل حول الكبسولات الدقيقة. أنتجت تقنية التغليف الخاصة بنا كبسولات قطرها 400 ميكرومتر بمعدل 10 كبسولات في الثانية. تحتوي الكبسولات الناتجة على قشرة هيدروجيل ونواة مائية سمحت للخلايا المفردة بالتجمع بسرعة في مجاميع وتشكيل كرويات. لم تؤثر عملية التغليف سلبا على صلاحية hPSCs ، حيث لوحظت قابلية >95٪ من الجدوى بعد 3 أيام من التغليف. وللمقارنة، فإن مركبات الكربون الهيدروكلورية المغلفة في جسيمات هلامية صلبة (بدون نواة مائية) لم تشكل كرويات وكان لها قابلية <50٪ قابلة للحياة بعد 3 أيام من التغليف. حدث التكوين الكروي ل hPSCs داخل الكبسولات الدقيقة ذات الغلاف الأساسي في غضون 48 ساعة بعد التغليف ، مع كون القطر الكروي دالة على كثافة تلقيح الخلايا. بشكل عام ، كانت تقنية تغليف الموائع الدقيقة الموصوفة في هذا البروتوكول مناسبة تماما لتغليف hPSCs وتشكيل كروي.

باتباع البروتوكول المذكور أعلاه ، سيتمكن القارئ من تصنيع أجهزة الموائع الدقيقة وإنتاج كبسولات دقيقة حاملة للخلايا. ويبين الشكل 3 ألف أمثلة على الكبسولات الدقيقة المثلى ودون المثلى المصنعة باستخدام توليد قطرات الموائع الدقيقة. أدت التركيبات المختلفة من PEG-4-Mal إلى كبسولات ?...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

توضح هذه المقالة تغليف الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) باستخدام جهاز تركيز التدفق المحوري المشترك. نحن نثبت أن تقنية تغليف الموائع الدقيقة هذه تمكن من التكوين الفعال للكرويات hPSC.

تصنيع الموائع الدقيقة للكبسولات الدقيقة Core-Shell التي تحمل كرويات الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

تعتبر المنطقة ذات أهمية في ثقافات 3D للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات بسبب تحسين تعدد القدرات وإمكانات التمايز التي شكلتها هذه الثقافة. لقد وصفنا استراتيجية التغليف الخاصة بنا والتي تؤدي إلى تكوين كروي للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. وبمجرد تغليفها، تكون هذه الخلايا الكروية من الخلايا الجذعية قابلة للزراعة، إما في صفائح متعددة الآبار أو مفاعلات حيوية متحركة.استراتيجية التغليف لدينا هي تحسين البقاء على قيد الحياة من الوباء والكفاءة العالية لتشكيل كروية. يتم حماية الكرويات المغلفة ضد القص أو الطاقة الميكانيكية المرتبطة بالتحريك أو الهزاز. يعتمد تطوير الخلايا الجذعية المشتقة من العلاج الخلوي جزئيا على القدرة على توليد المنتج الخلوي المطلوب بطريقة قابلة للتطوير وفعالة وفعالة من حيث التكلفة.تمثل تقنية التغليف الموضحة هنا خطوة في هذا الاتجاه. من المحتمل أن تكون تقنية التغليف الموصوفة هنا قابلة للتطبيق على زراعة 3D لأنواع الخلايا المختلفة من الخلايا الأخرى إلى الخلايا الجذعية الأخرى متعددة القدرات. ابدأ بتحضير 30 ملليلتر من محلول المخزون الأساسي مرتين عن طريق خلط 4.8 جرام من 35 كيلودالتون بيج ، و 10.2 ملليلتر من وسائط تدرج الكثافة ، و 19.8 ملليلتر من وسائط DMEM / F-12.ثم قم بتصفية هذا الحل الأساسي باستخدام مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر. بعد ذلك ، قم بإعداد 50 ملليلتر من الزيت المعدني مع 3 في المائة من الفاعل بالسطح عن طريق خلط 48.5 ملليلتر من الزيت المعدني و 1.5 ملليلتر من الفاعل بالسطح. ثم قم بتعقيم المحلول عن طريق تمريره عبر مرشح حقنة 0.22 ميكرومتر.بعد ذلك ، قم بإعداد 1 مول DTT ، و 1 مول TEA ، و 1 في المائة من حلول PF127 ، كما هو موضح في مخطوطة النص. ثم قم بإعداد مستحلب متقاطع عن طريق خلط 4.5 ملليلتر من الزيوت المعدنية مع 3 في المائة من الفاعل بالسطح و 300 ميكرولتر من 1 DTT مولار. بعد دوامة المحلول لمدة دقيقتين ، سونيكات لمدة 45 إلى 60 دقيقة في حمام بالموجات فوق الصوتية عند 20 درجة مئوية وتحميله إلى حقنة 5 ملليلتر بإبرة قياس 27.بعد ذلك ، قم بإعداد محلول زيت التدريع عن طريق تحميل الزيت المعدني بنسبة 0.5 في المائة من الفاعل بالسطح في حقنة سعة 5 ملليلتر بإبرة قياس 27. لتحضير محلول القشرة ، أضف 32 ملليغرام من ماليميد PEG4 في 400 ميكرولتر من DPBS. ثم ، أضف 6 ميكرولترات من 1 شاي مولار.دوامة الحل لمدة 2 دقيقة والطرد المركزي من خلال مرشح الدوران. احتفظ بالمحلول في الظلام على الروك لمدة 30 دقيقة قبل تحميله في حقنة 1 ملليلتر بإبرة قياس 27. وأخيرا، قم بإعداد الحل الأساسي النهائي عن طريق إعادة تعليق 20 مليون hPSCs في وسائط 200 ميكرولتر ومزجها مع 30 ميكرولتر من 1 في المائة PF127 و 200 ميكرولتر من الحل الأساسي 2X.أدخل قضيب تحريك صغير في حقنة 1 ملليلتر. ثم قم بتحميل الخلية التي تحتوي على محلول أساسي في المحقنة بإبرة قياس 27. ابدأ بوضع جهاز قطرات PDMS المستعبدة ، و 4 قطع بطول 20 سم ، وقطعة واحدة من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل بطول 5 سم ، وقطعة واحدة من أنبوب مخرج 10 سم و 6 قطع من أنابيب تركيب 0.5 سم تحت مصدر الضوء المبيد للجراثيم لمدة 30 دقيقة للتعقيم.الآن قم بتركيب 4 قطع من الأنابيب الدقيقة ذات المدخل الطويل 20 سم في القشرة والزيت ومستحلب الوصلة المتقاطعة ومداخل جهاز التفكك باستخدام الملقط. ثم ، أدخل الطرف الآخر من الأنابيب في إبرة المحقنة مع المحلول المقابل. وفي الوقت نفسه ، قم بتوصيل المدخل الأساسي لأجهزة الموائع الدقيقة ومخرج أجهزة التفكك بأنبوب دقيق 5 سم.أدخل 1 أنبوب مخرج في منفذ مخرج السوائل وضع الطرف الآخر في خزان التجميع. بعد ذلك ، ضع الجهاز على مرحلة المجهر وقم بإرفاق الأنابيب لتجنب أي حركة. قم بمحاذاة المجهر وتركيزه على فوهة الجهاز لفحص التدفق.ضع كل حقنة على مضخات حقنة مختلفة وقم بتأمينها بشكل صحيح. قم ببرمجة كل مضخة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة لمعدلات التدفق المذكورة في مخطوطة النص ، وابدأ التدفق في جميع المضخات. انتظر حتى يدخل كل سائل إلى الجهاز واملأ القنوات أثناء دفع الهواء المتبقي للخارج.عندما يتم تثبيت تكوين الكبسولة ، ضع الطرف الآخر من أنبوب التجميع في أنبوب مخروطي جديد يحتوي على 5 ملليلتر من وسائط mTeSR. بمجرد جمع كبسولات كافية ، احتضنها لمدة 10 دقائق. ستكون الكبسولات الموجودة في مرحلة الزيت في الجزء العلوي من الأنبوب ، والتي تنتقل الرواسب إلى الأسفل عند النقر بلطف على الأنبوب.لاسترداد الكبسولات ، ابدأ بإزالة الزيت من أنبوب التجميع. ثم ضع الكبسولات على مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر بحجم المسام واغسل المصفاة بكميات وفيرة من الوسائط. عكس المرشح فوق بئر من لوحة ثقافة 6 آبار وجمع الكبسولات الدقيقة عن طريق تمرير 2 ملليلتر من الوسائط عبر الفلتر.احتضان كبسولات الخلايا الجذعية في طبق من 6 آبار عند 37 درجة مئوية مع 5 في المئة من ثاني أكسيد الكربون. قم بتغيير الوسائط كل يومين عن طريق جمع الكبسولات على مرشح مصفاة الخلايا ، وغسلها بالوسائط الزائدة وإعادة تعليقها إلى بئر جديد في ألواح 6 آبار مع وسائط 2 ملليلتر. قم بإجراء فحص الجدوى عن طريق إضافة 4 ميكرولترات من 2 ميكرومولار إيثيديوم هوموديمر-1 وميكرولتر من 4 ميكرومولار كالسين-AM المحاليل إلى 2 ملليلتر من DPBS المعقمة.دوامة لضمان الخلط الكامل. جمع ما يقرب من 100 كبسولة صغيرة على مصفاة الخلايا وشطفها مع DPBS معقمة للسماح بانتشار متوسط من الكبسولات. اجمعها مرة أخرى في صفيحة استزراع مكونة من 12 بئرا باستخدام 1 ملليلتر من المحلول المحضر الذي يحتوي على Ethidium Homodimer-1 و calcein AM واحتضنها عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.تصور الخلايا تحت المجهر الفلوري. أظهرت الكبسولات الدقيقة المثلى ودون المثلى المصنعة باستخدام توليد قطرات الموائع الدقيقة اختلافات في مورفولوجيا الكبسولة كدالة لمحتوى PEG4-Maleimide في القشرة. ترتبط الكبسولات الملساء ذات الحواف الساطعة بالسلامة الميكانيكية المطلوبة.يشير تجميع الخرز في وسط الكبسولات إلى أن النواة كانت مائية وأن الخرز كان حرا في الحركة. أشارت الحلقة الفلورية إلى وجود قشرة هيدروجيل وتم استخدامها لتحديد سمك القشرة. أظهرت البقع الحية أو الميتة بعد 6 ساعات من تغليف خلايا H9 أن الخلايا حققت أكثر من 95 في المائة من الجدوى بشكل روتيني أثناء عمليات التغليف.عند مقارنة معدل النمو وإمكانات التمايز للكرويات المغلفة مقابل الكروية غير المغلفة. وتقرر أن عملية التغليف ليس لها أي آثار ضارة على مركبات الكربون الهيدروكلورية فلورية. يرجى تذكر أنه من المهم تحديد نسبة معدل التدفق المثلى بين الغلاف الأساسي وتيارات النفط.قد يؤدي عدم القيام بذلك إلى كبسولات لن تكون قوية ميكانيكيا وقد تتمزق أثناء المناولة. نود أن نشير إلى أن تقنية التغليف هذه كانت لأنواع الخلايا الأخرى غير الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. لقد قمنا بتغليف خطوط الخلايا السرطانية والخلايا الجذعية الوسيطة باستخدام استراتيجية مماثلة.حاليا، يقوم فريقنا بتطوير الجيل القادم من اللقطات الدقيقة. هذه اللقطات الدقيقة نشطة بيولوجيا ويمكن تحميلها بعوامل متقاطعة للتمايز المغلف للخلايا الجذعية.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

التنمية، والتوسع، و<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; رصد خلايا NK الإنسان من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وافرة القوة والتي يسببها الخلايا الجذعية (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

زرع المستحثة متعددة القدرات الخلايا الجذعية المشتقة من Mesoangioblast مثل السلف الميوجينيك في نماذج الماوس من تجديد العضلات

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

باستخدام لاصق الزخرفة لانشاء 3D ورقة أجهزة ميكروفلويديك

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

ثقافة الخلايا الجذعية Pluripotent البشرية على حمض البولي فينيل الكحول-Co-إيتاكونيك الهلاميات المائية مع صلابة متفاوتة تحت ظروف خالية من كرة

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

الاساسيه/شل السقالات الطباعة للهندسة الانسجه من الهياكل أنبوبي

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

طريقة ثقافية للحفاظ على الخلايا الجذعية الدموية البشرية الكويسنت

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...