Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Denne undersøgelse blev delvist støttet af bevillingerne fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).

1. Fremstilling af enhed
<ol><li>Lav designene til mikroindkapslingsenheden og dissociationsenheden ved hjælp af CAD-software10,11.</li>
	<li>Spin-coat de tre lag SU-8 photoresist sekventielt på en siliciumskive (figur 2A) for at opnå strukturer med de ønskede højder: 60, 100 og 150 μm. BEMÆRK: Processen for de øverste og nederste forme er identisk.<ol>
<li>Spincoat en ren 10 cm siliciumskive med SU-8 2025 negativ fotore...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Indkapslingsprocessen beskrevet her resulterer i reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gør det nemt at dispensere sfæroider i brønde på en mikrotiterplade til eksperimenter, der sigter mod at forbedre / optimere differentieringsprotokoller eller testterapier. Indkapslede stamcellesfæroider kan også anvendes i suspensionskulturer, hvor hydrogelskallen beskytter celler mod forskydningsinduceret skade7.
Der er flere kritiske trin i protokolle...

Der er stor interesse for 3D-kulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) på grund af den forbedrede pluripotens og differentieringspotentiale, som dette kulturformat 1,2,3 giver. hPSC'er dannes typisk til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjælp af bioreaktorer, mikrobrønde, hydrogeler og polymere stilladser 4,5,6. Indkapsling tilbyder et andet middel til at organisere enkelte hPSC'er i sfæroider. Når indkapslede hPSC-sfæroider kan håndteres med lethed og overføres til mikrotiterplader til differentiering, sygdomsmodellering eller lægemiddeltestforsøg. Indkapsling af hPSC'er i et hydrogellag beskytter også celler mod forskydningsskader og gør det muligt at dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høje omrøringshastigheder7.
Vores metode til indkapsling af stamceller udviklede sig over tid. For det første fokuserede vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerede vellykket indkapsling og dyrkning af museembryonale stamceller (mESC'er)8. Det blev imidlertid bemærket, at humane embryonale stamceller (hESC'er) havde lav levedygtighed, når de blev indkapslet i sådanne hydrogelmikropartikler, formodentlig på grund af det større behov for, at disse celler genoprettede celle-cellekontakter efter indkapslingen. Vi ræsonnerede, at heterogen mikrokapsel, der besidder en vandig kerne, kan være bedre egnet til indkapsling af celler, der er afhængige af hurtig genetablering af celle-cellekontakter. Konceptet med koaksial strømningsfokuserende mikrofluidisk enhed til fremstilling af vandige kerne / hydrogelskalmikrokapsler blev tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat anvendt i den oprindelige tilgang blev en PEG-baseret hydrogel inkorporeret i skallen. Vi demonstrerede først vellykket indkapsling og sfæroiddannelse af primær hepatocyt i kerneskalmikrokapsler10 og senest beskrevet indkapsling af hES- og iPS-celler7. Som skitseret i figur 1A fremstilles kapsler i en flowfokuseringsanordning, hvor skal- og kernestrømstrømmene overgår fra side til side til koaksial strømning, inden de skubbes ud i oliefasen. Kernestrømmen indeholder celler og additiver, der øger opløsningens viskositet (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol - kommercielt navn OptiPrep), mens skalstrømmen indeholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm diskretiseres i dråber, der bevarer kerneskalarkitektur. Kerneskalstrukturen gøres permanent ved udsættelse for di-thiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkemi og resulterer i dannelse af en tynd (~ 10 μm) hydrogelhud eller skal. Efter at emulsionen er brudt, og kapsler overføres til en vandig fase, diffunderer molekyler af PEG fra kernen og erstattes af vandmolekyler. Dette resulterer i vandige kerne- og hydrogelskalmikrokapsler.
Nedenfor er trinvise instruktioner om, hvordan man fremstiller mikrofluidiske enheder, hvordan man forbereder celler, og hvordan man udfører indkapsling af hPSC'er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Tredimensionelle (3D) eller sfæroidkulturer af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) giver fordelene ved forbedrede differentieringsresultater og skalerbarhed. I dette papir beskriver vi en strategi for robust og reproducerbar dannelse af hPSC-sfæroider, hvor en koaksial flowfokuseringsenhed bruges til at fange hPSC'er inde i kerneskalmikrokapsler. Kerneopløsningen indeholdt enkeltcellesuspension af hPSC'er og blev gjort tyktflydende ved inkorporering af poly(ethylenglycol) (PEG) med høj molekylvægt og densitetsgradientmedie. Skalstrømmen bestod af PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og flød langs kernestrømmen mod to på hinanden følgende oliekryds. Dråbedannelse fandt sted ved det første oliekryds med skalopløsning, der viklede sig rundt om kernen. Kemisk tværbinding af skallen forekom ved det andet oliekryds ved at indføre en di-thiol-tværbinding (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråber. Tværbindingen reagerer med maleimidfunktionelle grupper via klikkemi, hvilket resulterer i dannelsen af en hydrogelskal omkring mikrokapslerne. Vores indkapslingsteknologi producerede kapsler med en diameter på 400 μm med en hastighed på 10 kapsler i sekundet. De resulterende kapsler havde en hydrogelskal og en vandig kerne, der gjorde det muligt for enkeltceller hurtigt at samle sig i aggregater og danne sfæroider. Indkapslingsprocessen påvirkede ikke hPSC'ernes levedygtighed negativt, idet >95 % levedygtighed blev observeret 3 dage efter indkapslingen. Til sammenligning dannede hPSC'er indkapslet i faste gelmikropartikler (uden en vandig kerne) ikke sfæroider og havde <50% levedygtighed 3 dage efter indkapsling. Sfæroiddannelse af hPSC'er inde i kerneskalmikrokapsler forekom inden for 48 timer efter indkapsling, hvor sfæroiddiameteren var en funktion af celleinokuleringstætheden. Samlet set var den mikrofluidiske indkapslingsteknologi, der er beskrevet i denne protokol, velegnet til hPSC'er indkapsling og sfæroiddannelse.

Ved at følge ovennævnte protokol vil læseren være i stand til at fremstille mikrofluidiske enheder og producere cellebærende mikrokapsler. Figur 3A viser eksempler på optimale og suboptimale mikrokapsler fremstillet ved hjælp af mikrofluidisk dråbegenerering. Forskellige formuleringer af PEG-4-Mal resulterede i kapsler med varierende morfologier - rynkede kapsler var forbundet med dårlig gelering, lav mekanisk integritet og modstod ikke dyrkning i en omrørt bioreaktor. Glatte kapsl...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Denne artikel beskriver indkapsling af humane pluripotente stamceller (hPSC'er) ved hjælp af en koaksial flowfokuseringsenhed. Vi demonstrerer, at denne mikrofluidiske indkapslingsteknologi muliggør effektiv dannelse af hPSC-sfæroider.

Mikrofluidisk fremstilling af kerneskalmikrokapsler, der bærer humane pluripotente stamcellesfæroider

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Området anses for at være af interesse for 3D-kulturer af humane pluripotente stamceller på grund af forbedret pluripotens og differentieringspotentiale, som denne kultur dannede. Vi beskrev vores indkapslingsstrategi, der fører til reproducerbar dannelse af humane pluripotente stamceller sfæroider. Når de er indkapslet, er disse stamcellesfæroider modtagelige for dyrkning, enten i plader med flere brønde eller omrørte bioreaktorer.Vores indkapslingsstrategi er at optimere pestilensens overlevelsesevne og høj effektivitet af sfæroiddannelse. Indkapslede sfæroider er beskyttet mod forskydning eller mekanisk energi forbundet med omrøring eller rocking. Udvikling af stamceller afledt af cellulær terapi afhænger til dels af evnen til at generere det ønskede cellulære produkt på en skalerbar, effektiv og omkostningseffektiv måde.Indkapslingsteknologien, der er beskrevet her, repræsenterer et skridt i denne retning. Indkapslingsteknologien, der er beskrevet her, vil sandsynligvis kunne anvendes til 3D-dyrkning af forskellige celletyper fra andre celler til andre pluripotente stamceller. Begynd med at forberede 30 ml to gange kerneopløsning ved at blande 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 ml densitetsgradientmedier og 19,8 ml DMEM / F-12-medier.Filtrer derefter denne kerneopløsning ved hjælp af et 0,22 mikrometer sprøjtefilter. Forbered derefter 50 ml mineralolie med 3 procent overfladeaktivt stof ved at blande 48,5 ml mineralolie og 1,5 ml overfladeaktivt stof. Steriliser derefter opløsningen ved at føre den gennem et 0,22 mikrometer sprøjtefilter.Forbered derefter 1 molær DTT, 1 molær TEA og 1 procent PF127-opløsninger som beskrevet i tekstmanuskriptet. Derefter fremstilles en tværbindingsemulsion ved at blande 4,5 ml mineralolie med 3 procent overfladeaktivt stof og 300 mikroliter 1 molær DTT. Efter hvirvel af opløsningen i to minutter, sonikere i 45 til 60 minutter i et ultralydsbad ved 20 grader Celsius og læg det til en 5 ml sprøjte med en 27 gauge nål.Forbered derefter afskærmningsolieopløsning ved at indlæse mineralolien med 0,5 procent overfladeaktivt stof i en 5 ml sprøjte med en 27 gauge nål. For at forberede skalopløsningen tilsættes 32 mg PEG4-maleimid i 400 mikroliter DPBS. Derefter tilsættes 6 mikroliter 1 molær TEA.Vortex opløsningen i 2 minutter og centrifugering den gennem et spinfilter. Opbevar opløsningen i mørke på vippen i 30 minutter, før den lægges i en 1 milliliter sprøjte med en 27 gauge nål. Endelig forberedes den endelige kerneløsning ved at suspendere 20 millioner hPSC'er igen i 200 mikroliter medier og blandes med 30 mikroliter 1 procent PF127 og 200 mikroliter 2X kerneløsning.Indsæt en lille omrørerstang i en 1 milliliter sprøjte. Læg derefter cellen indeholdende kerneopløsning i sprøjten med en 27 gauge nål. Begynd med at placere den bundne PDMS-dråbeanordning, 4 stykker på 20 centimeter lang og 1 stk. 5 centimeter lange indløbsmikrorør, 1 stykke 10 centimeter udløbsrør og 6 stykker 0,5 centimeter monteringsrør under den bakteriedræbende lyskilde i 30 minutter til sterilisering.Tilpas nu de 4 stykker 20 centimeter lange indløbsmikrorør ind i skallen, olien, tværbindingsemulsionen og dissociationsanordningens indløb ved hjælp af tang. Indsæt derefter den modsatte ende af rørene i sprøjtenålen med den tilsvarende opløsning. I mellemtiden skal du forbinde de mikrofluidiske enheders kerneindløb og dissociationsenhedernes udløb med et 5 centimeter mikrorør.Indsæt 1 udløbsrør i den fluidiske udløbsport, og anbring den modsatte ende i et opsamlingsbeholder. Placer derefter enheden på et mikroskoptrin og fastgør slangen for at undgå bevægelse. Juster og fokuser mikroskopet på enhedens dyse til flowinspektion.Anbring hver sprøjte på forskellige sprøjtepumper og fastgør den korrekt. Programmer hver pumpe i henhold til producentens protokoller til de strømningshastigheder, der er nævnt i tekstmanuskriptet, og start flowet i alle pumperne. Vent på, at hver væske kommer ind i enheden, og fyld kanalerne op, mens du skubber den resterende luft ud.Når kapseldannelsen er stabiliseret, placeres den modsatte ende af opsamlingsrøret i et nyt konisk rør indeholdende 5 ml mTeSR-medier. Når nok kapsler er opsamlet, inkuber dem i 10 minutter. Kapslerne, der befinder sig i oliefasen, vil være øverst på røret, som sedimenterer til bunden, når de forsigtigt tapper røret.For at hente kapslerne skal du starte med at fjerne olie fra opsamlingsrøret. Anbring derefter kapslerne på en 100 mikrometer porestørrelse cellesil og vask silen med rigelige mængder medier. Omvendt filteret oven på en brønd af en 6-brønds kulturplade og opsaml mikrokapslerne ved at føre 2 ml medier gennem filteret.Inkuber stamcellekapslerne i en 6-brønds kulturskål ved 37 grader Celsius med 5 procent kuldioxid. Skift medier hver anden dag ved at samle kapslerne på et cellesilfilter, vaske dem med overskydende medier og suspendere dem igen til en ny brønd i 6-brønds plader med 2 ml medier. Udfør levedygtighedsanalyse ved at tilsætte 4 mikroliter af de 2 mikromolære Ethidium Homodimer-1 og 1 mikroliter af de 4 mikromolære Calcein-AM-opløsninger til 2 ml steril DPBS.Vortex for at sikre fuldstændig blanding. Saml ca. 100 mikrokapsler på en cellesil og skyl dem med sterile DPBS for at tillade medium diffusion ud fra kapslerne. Saml dem igen i en 12-brønds kulturplade ved anvendelse af 1 ml af den tilberedte opløsning indeholdende Ethidium Homodimer-1 og calcein AM og inkuber ved 37 grader Celsius i 20 minutter.Visualiser cellerne under et fluorescensmikroskop. De optimale og suboptimale mikrokapsler fremstillet ved hjælp af mikrofluidisk dråbegenerering viste forskelle i kapselmorfologi som en funktion af PEG4-Maleimidindholdet i skallen. Glatte kapsler med lyse kanter er forbundet med ønsket mekanisk integritet.Aggregering af perler i midten af kapslerne indikerer, at kernen var vandig, og perlerne var frie til at bevæge sig rundt. Den fluorescerende annulus indikerede tilstedeværelsen af en hydrogelskal og blev brugt til at bestemme skaltykkelsen. Levende eller døde farvninger 6 timer efter indkapsling af H9-celler viste, at cellerne opnåede mere end 95 procent levedygtighed rutinemæssigt under indkapslingskørslerne.Ved sammenligning af vækstraten og differentieringspotentialet for indkapslede versus uindkapslede sfæroider. Det blev fastslået, at indkapslingsprocessen ikke har nogen negative virkninger på hPSC'er. Husk, at det er vigtigt at etablere optimalt strømningshastighedsforhold mellem kerneskallen og oliestrømmene.Hvis du ikke gør dette, kan det resultere i kapsler, der ikke vil være mekanisk stærke og kan briste under håndtering. Vi vil gerne påpege, at denne indkapslingsteknik var til andre celletyper end humane pluripotente stamceller. Vi har indkapslet, primært hypotetiske, kræftcellelinjer og mesenkymale stamceller ved hjælp af en lignende strategi.I øjeblikket udvikler vores team den næste generation af mikrofangst. Disse mikrofangst er bioaktive og kan være fyldt med krydsfaktorer til indkapslet differentiering af stamceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Udvikling, Expansion, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvågning af menneskerettigheder NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs), og og induceret pluripotente stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation af induceret pluripotente stamcelle-afledt Mesoangioblast-lignende Myogenic Stamfadere i Mouse Modeller af muskel regenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Brug Adhesive mønstret Konstruér 3D Paper mikrofluidenheder

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Humane pluripotente stamceller kultur på Polyvinyl alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhed på Xeno-fri betingelser

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Core/Shell trykning stilladser til vævs konstruktion af rørformede konstruktioner

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Single-Cell Optisk Action Potentiel måling i human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kultur metode til at opretholde hvilende humane hæmatopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...