Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Deze studie werd gedeeltelijk ondersteund door de subsidies van het Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) en NIH (DK107255).

1. Fabricage van apparaten
<ol><li>Maak de ontwerpen voor het micro-inkapselingsapparaat en dissociatieapparaat met behulp van CAD-software10,11.</li>
	<li>Spin-coat de drie lagen SU-8 fotoresist sequentieel op een silicium wafer (figuur 2A) om structuren te bereiken met de gewenste hoogtes: 60, 100 en 150 μm. OPMERKING: Het proces voor de bovenste en onderste mallen is identiek.<ol>
<li>Spin coat een schone 10 cm silicium wafe...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Het hier beschreven inkapselingsproces resulteert in reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden. Het microcapsule-formaat maakt het gemakkelijk om sferoïden in putten van een microtiterplaat te doseren voor experimenten gericht op het verbeteren / optimaliseren van differentiatieprotocollen of het testen van therapieën. Ingekapselde stamcelsferoïden kunnen ook worden gebruikt in suspensieculturen waar hydrogelschaal cellen beschermt tegen door afschuiving veroorzaakte schade7.
<p class="jo...

Er is veel belangstelling voor 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) vanwege de verbeterde pluripotentie en differentiatiemogelijkheden die dit kweekformaatbiedt 1,2,3. hPSC's worden meestal gevormd tot sferoïden of andere 3D-cultuurformaten door middel van bioreactoren, microwells, hydrogels en polymere steigers 4,5,6. Inkapseling biedt een ander middel om enkele hPSC's in sferoïden te organiseren. Eenmaal ingekapseld kunnen hPSC-sferoïden gemakkelijk worden behandeld en overgebracht naar microtiterplaten voor differentiatie, ziektemodellering of experimenten met het testen van geneesmiddelen. Het inkapselen van hPSC's in een hydrogellaag beschermt cellen ook tegen afschuifschade en maakt het mogelijk om sferoïden in een bioreactor te kweken met hoge roersnelheden7.
Onze methodologie voor stamcelinkapseling evolueerde in de loop van de tijd. Ten eerste hebben we ons gericht op vaste hydrogel-microdeeltjes en succesvolle inkapseling en kweek van embryonale stamcellen van muizen (mESCs) aangetoond)8. Er werd echter opgemerkt dat menselijke embryonale stamcellen (hESCs) een lage levensvatbaarheid hadden wanneer ze werden ingekapseld in dergelijke hydrogel-microdeeltjes, vermoedelijk vanwege de grotere behoefte van deze cellen om cel-celcontacten na de inkapseling te herstellen. We redeneerden dat heterogene microcapsule, die een waterige kern bezit, beter geschikt kan zijn voor inkapseling van cellen die afhankelijk zijn van een snel herstel van cel-celcontacten. Het concept van co-axiale flowfocus microfluïdische apparaat voor het maken van waterige kern / hydrogel shell microcapsules werd aangepast van He et al.9, maar in plaats van alginaat dat in de oorspronkelijke benadering werd gebruikt, werd een peg-gebaseerde hydrogel in de schaal opgenomen. We toonden voor het eerst succesvolle inkapseling en sferoïde vorming van primaire hepatocyten in core-shell microcapsules10 en meest recent beschreven inkapseling van hES- en iPS-cellen7. Zoals beschreven in figuur 1A, worden capsules vervaardigd in een stroomfocusapparaat waarbij de shell- en kernstroomstromen overgaan van zijwaartse naar co-axiale stroom voordat ze in de oliefase worden uitgeworpen. De kernstroom bevat cellen en additieven die de viscositeit van de oplossing verhogen (niet-reactieve PEG MW 35kD en iodixanol - handelsnaam OptiPrep), terwijl de shell-stroom reactieve moleculen (PEG-4-Mal) bevat. Continue co-axiale stroomstroom wordt gediscretiseerd in druppels die de core-shell-architectuur behouden. De kern-schilstructuur wordt permanent gemaakt door blootstelling aan di-thiol crosslinker (DTT), die reageert met PEG-4-Mal via klikchemie en resulteert in de vorming van een dunne (~ 10 μm) hydrogelhuid of -schaal. Nadat de emulsie is gebroken en capsules in een waterige fase zijn overgebracht, diffunderen moleculen van PEG uit de kern en worden vervangen door watermoleculen. Dit resulteert in waterige kern en hydrogel shell microcapsules.
Hieronder vindt u stapsgewijze instructies voor het maken van microfluïdische apparaten, het voorbereiden van cellen en het inkapselen van hPSC's.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Driedimensionale (3D) of sferoïde culturen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) bieden de voordelen van verbeterde differentiatieresultaten en schaalbaarheid. In dit artikel beschrijven we een strategie voor de robuuste en reproduceerbare vorming van hPSC-sferoïden waarbij een co-axiale stroomfocusapparaat wordt gebruikt om hPSC's in kern-shell microcapsules te vangen. De kernoplossing bevatte eencellige suspensie van hPSC's en werd viskeus gemaakt door de integratie van poly(ethyleenglycol) met hoog molecuulgewicht (PEG) en dichtheidsgradiëntmedia. De schelpenstroom bestond uit PEG-4 arm-maleimide of PEG-4-Mal en stroomde langs de kernstroom naar twee opeenvolgende olieknooppunten. Druppelvorming vond plaats bij de eerste olieverbinding met shell-oplossing die zich rond de kern wikkelde. Chemische crosslinking van de schaal vond plaats bij de tweede olieverbinding door een di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol of DTT) in deze druppels te introduceren. De crosslinker reageert met maleimide functionele groepen via klikchemie, wat resulteert in de vorming van een hydrogelschaal rond de microcapsules. Onze inkapselingstechnologie produceerde capsules met een diameter van 400 μm met een snelheid van 10 capsules per seconde. De resulterende capsules hadden een hydrogel-schil en een waterige kern waarmee afzonderlijke cellen zich snel konden samenvoegen tot aggregaten en sferoïden konden vormen. Het proces van inkapseling had geen negatieve invloed op de levensvatbaarheid van hPSC's, met >95% levensvatbaarheid waargenomen 3 dagen na inkapseling. Ter vergelijking: hPSC's ingekapseld in vaste gelmicrodeeltjes (zonder een waterige kern) vormden geen sferoïden en hadden 3 dagen na inkapseling <50% levensvatbaarheid. Sferoïde vorming van hPSC's in kern-shell microcapsules vond plaats binnen 48 uur na inkapseling, waarbij de sferoïde diameter een functie was van de celinentingsdichtheid. Over het algemeen was de microfluïdische inkapselingstechnologie die in dit protocol wordt beschreven zeer geschikt voor hPSCs-inkapseling en sferoïdevorming.

Door het bovengenoemde protocol te volgen, kan de lezer microfluïdische apparaten fabriceren en celdragende microcapsules produceren. Figuur 3A toont voorbeelden van optimale en suboptimale microcapsules vervaardigd met behulp van microfluïdische druppelgeneratie. Verschillende formuleringen van PEG-4-Mal resulteerden in capsules met verschillende morfologieën - gerimpelde capsules werden geassocieerd met slechte gelation, lage mechanische integriteit en waren niet bestand tegen teelt in ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Dit artikel beschrijft de inkapseling van menselijke pluripotente stamcellen (hPSC's) met behulp van een co-axiale stroomfocusapparaat. We tonen aan dat deze microfluïdische inkapselingstechnologie een efficiënte vorming van hPSC-sferoïden mogelijk maakt.

Microfluïdische fabricage van core-shell microcapsules met menselijke pluripotente stamcelsferoïden

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Het gebied wordt beschouwd als van belang in 3D-culturen van menselijke pluripotente stamcellen vanwege de verbeterde pluripotentie en het differentiatiepotentieel dat deze cultuur heeft gevormd. We beschreven onze inkapselingsstrategie die leidt tot reproduceerbare vorming van menselijke pluripotente stamcellen sferoïden. Eenmaal ingekapseld, zijn deze stamcelsferoïden vatbaar voor teelt, hetzij in multi-well platen of geroerde bioreactoren.Onze inkapselingsstrategie is het optimaliseren van de overlevingskansen van pestilentie en de hoge efficiëntie van sferoïdevorming. Ingekapselde sferoïden worden beschermd tegen afschuiving of mechanische energie geassocieerd met roeren of schommelen. De ontwikkeling van stamcellen afgeleid van de cellulaire therapie hangt gedeeltelijk af van het vermogen om het gewenste cellulaire product op een schaalbare, efficiënte en kosteneffectieve manier te genereren.De hier beschreven inkapselingstechnologie vertegenwoordigt een stap in deze richting. De hier beschreven inkapselingstechnologie zal waarschijnlijk toepasbaar zijn op 3D-cultivatie van verschillende celtypen van andere cellen naar andere pluripotente stamcellen. Begin met het bereiden van 30 milliliter twee keer de kernvoorraadoplossing door 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 milliliter dichtheidsgradiëntmedia en 19,8 milliliter DMEM / F-12-media te mengen.Filter vervolgens deze kernoplossing met behulp van een spuitfilter van 0,22 micrometer. Bereid vervolgens 50 milliliter minerale olie met 3 procent oppervlakteactieve stof door 48,5 milliliter minerale olie en 1,5 milliliter oppervlakteactieve stof te mengen. Steriliseer vervolgens de oplossing door deze door een spuitfilter van 0,22 micrometer te laten gaan.Bereid vervolgens 1 molaire DTT, 1 molaire TEA en 1 procent PF127-oplossingen, zoals beschreven in het teksthandschrift. Bereid vervolgens een cross-linker emulsie door 4,5 milliliter minerale olie te mengen met 3 procent oppervlakteactieve stof en 300 microliter 1 molaire DTT. Na het vortexen van de oplossing gedurende twee minuten, soniceer gedurende 45 tot 60 minuten in een ultrasoon bad bij 20 graden Celsius en laad het op een spuit van 5 milliliter met een naald van 27 gauge.Bereid vervolgens een afschermende olieoplossing voor door de minerale olie met 0,5 procent oppervlakteactieve stof in een spuit van 5 milliliter met een naald van 27 gauge te laden. Om de shell-oplossing te bereiden, voegt u 32 milligram PEG4-maleimide toe aan 400 microliter DPBS. Voeg vervolgens 6 microliter van 1 kies TEA toe.Vortex de oplossing gedurende 2 minuten en centrifugeer deze door een spinfilter. Houd de oplossing in het donker op de wip gedurende 30 minuten voordat u deze in een spuit van 1 milliliter met een naald van 27 gauge laadt. Bereid ten slotte de uiteindelijke kernoplossing voor door 20 miljoen hPSC's opnieuw op te schorten in media van 200 microliters en te mengen met 30 microliter van 1 procent PF127 en 200 microliter 2X-kernoplossing.Steek een kleine roerstaaf in een spuit van 1 milliliter. Laad vervolgens de cel met kernoplossing in de spuit met een naald van 27 gauge. Begin met het plaatsen van het gebonden PDMS-druppelapparaat, 4 stuks van 20 centimeter lang en 1 stuk van 5 centimeter lange inlaatmicrobuisjes, 1 stuk uitlaatbuis van 10 centimeter en 6 stuks van 0,5 centimeter fittingbuizen onder de kiemdodende lichtbron gedurende 30 minuten voor sterilisatie.Plaats nu de 4 stuks van 20 centimeter lange inlaatmicrobuisjes in de schaal, olie, cross-linker emulsie en dissociatie-apparaatinlaten met behulp van een tang. Steek vervolgens het andere uiteinde van de buisjes in de naald van de spuit met de bijbehorende oplossing. Verbind ondertussen de kerninlaat van de microfluïdische apparaten en de uitlaat van de dissociatieapparaten met een microbuis van 5 centimeter.Steek 1 uitlaatbuis in de vloeistofuitlaatpoort en plaats het andere uiteinde in een opvangreservoir. Plaats het apparaat vervolgens op een microscooptrap en bevestig de slang om beweging te voorkomen. Lijn en richt de microscoop op het mondstuk van het apparaat voor stroominspectie.Plaats elke spuit op verschillende spuitpompen en zet goed vast. Programmeer elke pomp volgens de protocollen van de fabrikant volgens de stroomsnelheden die in het tekstmanuscript worden vermeld en start de stroom in alle pompen. Wacht tot elke vloeistof het apparaat binnenkomt en vul de kanalen terwijl u de resterende lucht naar buiten duwt.Wanneer de capsulevorming is gestabiliseerd, plaatst u het andere uiteinde van de opvangbuis in een nieuwe conische buis met 5 milliliter mTeSR-media. Zodra voldoende capsules zijn verzameld, incubeer ze gedurende 10 minuten. De capsules die zich in de oliefase bevinden, bevinden zich aan de bovenkant van de buis, die naar de bodem sedimenteert bij het zachtjes tikken op de buis.Om de capsules op te halen, begint u met het verwijderen van olie uit de opvangbuis. Plaats vervolgens de capsules op een celzeef van 100 micrometer poriegrootte en was de zeef met overvloedige hoeveelheden media. Keer het filter om bovenop een put van een 6-well kweekplaat en vang de microcapsules door 2 milliliter media door het filter te laten gaan.Incubeer de stamcelcapsules in een 6-well kweekschaal bij 37 graden Celsius met 5 procent koolstofdioxide. Vervang de media om de dag door de capsules op een celzeeffilter te verzamelen, ze te wassen met overtollige media en ze opnieuw op te hangen in een nieuwe put in 6-putplaten met 2 milliliter media. Voer de levensvatbaarheidstest uit door 4 microliter van de 2 micromolaire Ethidium Homodimer-1 en 1 microliter van de 4 micromolaire Calcein-AM-oplossingen toe te voegen aan 2 milliliter steriele DPBS.Vortex om een volledige menging te garanderen. Verzamel ongeveer 100 microcapsules op een celzeef en spoel ze af met steriele DPBS om mediumdiffusie uit de capsules mogelijk te maken. Verzamel ze opnieuw in een 12-well kweekplaat met behulp van 1 milliliter van de bereide oplossing met Ethidium Homodimer-1 en calceïne AM en incubeer bij 37 graden Celsius gedurende 20 minuten.Visualiseer de cellen onder een fluorescentiemicroscoop. De optimale en suboptimale microcapsules vervaardigd met behulp van microfluïdische druppelgeneratie vertoonden verschillen in capsulemorfologie als functie van peg4-maleimidegehalte in de schaal. Gladde capsules met heldere randen worden geassocieerd met de gewenste mechanische integriteit.Aggregatie van kralen in het midden van de capsules geeft aan dat de kern waterig was en dat de kralen vrij waren om te bewegen. De fluorescerende annulus duidde op de aanwezigheid van een hydrogelschaal en werd gebruikt om de dikte van de schaal te bepalen. Levende of dode kleuringen 6 uur na het inkapselen van H9-cellen toonden aan dat de cellen routinematig meer dan 95 procent levensvatbaarheid bereikten tijdens de inkapselingsruns.Bij het vergelijken van de groeisnelheid en het differentiatiepotentieel van ingekapselde versus niet-ingekapselde sferoïden. Er werd vastgesteld dat het proces van inkapseling geen nadelige effecten heeft op hPSC's. Houd er rekening mee dat het belangrijk is om een optimale stroomsnelheidsverhouding vast te stellen tussen de kernschil en oliestromen.Als u dit niet doet, kan dit resulteren in capsules die niet mechanisch sterk zijn en kunnen scheuren tijdens het hanteren. We willen erop wijzen dat deze inkapselingstechniek voor andere celtypen was dan menselijke pluripotente stamcellen. We hebben, voornamelijk verondersteld, kankercellijnen en mesenchymale stamcellen ingekapseld met behulp van een vergelijkbare strategie.Momenteel ontwikkelt ons team de volgende generatie microcaptures. Deze microcaptures zijn bioactief en kunnen worden geladen met kruisfactoren voor ingekapselde differentiatie van stamcellen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Ontwikkeling, uitbreiding en<em&gt; In vivo</em&gt; Controle van Human NK cellen uit menselijke embryonale stamcellen (hESC &#39;s) en en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantatie van geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide mesoangioblast-achtige myogene voorlopers in muismodellen van spierregeneratie

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Met behulp van Adhesive gestructureerd om Construct 3D Paper microfluïdische apparaten

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Menselijke pluripotente stamcel cultuur op Polyvinyl Alcohol-Co-itacon zuur Hydrogels met verschillende stijfheid onder voorwaarden Xeno-gratis

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Kern/shell druk steigers voor weefsel engineering van buisvormige constructies

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Eencellige optische actiepotentiaalmeting in door de mens geïnduceerde pluripotente van stamcellen afgeleide cardiomyocyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Een kweekmethode om rustgevende menselijke hematopoëtische stamcellen te behouden

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...