Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Cette étude a été soutenue en partie par les subventions du Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, de la J. W. Kieckhefer Foundation, de la Al Nahyan Foundation, de Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) et des NIH (DK107255).

1. Fabrication de l’appareil
<ol><li>Réalisez les conceptions du dispositif de microencapsulation et du dispositif de dissociation à l’aide du logiciel de CAO10,11.</li>
	<li>Spin-coat les trois couches de résine photosensible SU-8 séquentiellement sur une plaquette de silicium (Figure 2A) pour obtenir des structures avec les hauteurs souhaitées: 60, 100 et 150 μm. REMARQUE: Le processus pour les moules supérieur et i...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Le processus d’encapsulation décrit ici entraîne la formation reproductible de sphéroïdes hPSC. Le format microcapsule facilite la distribution de sphéroïdes dans les puits d’une plaque de microtitrage pour des expériences visant à améliorer / optimiser les protocoles de différenciation ou à tester des thérapies. Les sphéroïdes de cellules souches encapsulés peuvent également être utilisés dans des cultures en suspension où l’enveloppe d’hydrogel protège les cellules contre les dommages induit...

Il existe un intérêt considérable pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation offerts par ce formatde culture 1,2,3. Les cSEh sont généralement formés en sphéroïdes ou en d’autres formats de culture 3D au moyen de bioréacteurs, de micropuits, d’hydrogels et d’échafaudages polymères 4,5,6. L’encapsulation offre un autre moyen d’organiser des hPSC simples en sphéroïdes. Une fois encapsulés, les sphéroïdes hPSC peuvent être manipulés facilement et transférés dans des plaques de microtitrage pour la différenciation, la modélisation de la maladie ou les expériences de test de médicaments. L’enrobage des CSEh dans une couche d’hydrogel protège également les cellules contre les dommages de cisaillement et permet de cultiver des sphéroïdes dans un bioréacteur à des taux d’agitation élevés7.
Notre méthodologie pour l’encapsulation des cellules souches a évolué au fil du temps. Tout d’abord, nous nous sommes concentrés sur les microparticules d’hydrogel solides et avons démontré le succès de l’encapsulation et de la culture de cellules souches embryonnaires (CSM) de souris8. Cependant, il a été noté que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avaient une faible viabilité lorsqu’elles étaient encapsulées dans de telles microparticules d’hydrogel, probablement en raison de la plus grande nécessité pour ces cellules de rétablir les contacts cellule-cellule après l’encapsulation. Nous avons estimé que la microcapsule hétérogène, possédant un noyau aqueux, pourrait être mieux adaptée à l’encapsulation de cellules qui dépendent du rétablissement rapide des contacts cellule-cellule. Le concept de dispositif microfluidique de focalisation à écoulement coaxial pour la fabrication de microcapsules à noyau aqueux / coquille d’hydrogel a été adapté de He et al.9, mais au lieu de l’alginate utilisé dans l’approche originale, un hydrogel à base de PEG a été incorporé dans la coque. Nous avons d’abord démontré avec succès l’encapsulation et la formation de sphéroïdes d’hépatocytes primaires dans des microcapsules noyau-enveloppe10 et, plus récemment, nous avons décrit l’encapsulation de cellules hES et iPS7. Comme indiqué à la figure 1A, les capsules sont fabriquées dans un dispositif de focalisation de l’écoulement où la coque et les flux d’écoulement du noyau passent d’un flux d’un côté à l’autre à l’écoulement coaxial avant l’éjection dans la phase huileuse. Le flux de noyau contient des cellules et des additifs qui augmentent la viscosité de la solution (PEG MW 35kD non réactif et iodixanol - nom commercial OptiPrep) tandis que le flux de coquille contient des molécules réactives (PEG-4-Mal). Le flux d’écoulement coaxial continu est discrétisé en gouttelettes qui conservent l’architecture noyau-coque. La structure noyau-coquille est rendue permanente par l’exposition à un réticulant di-thiol (DTT), qui réagit avec le PEG-4-Mal via la chimie du clic et entraîne la formation d’une peau ou d’une coquille d’hydrogel mince (~ 10 μm). Une fois l’émulsion brisée et les capsules transférées en phase aqueuse, les molécules de PEG diffusent du noyau et sont remplacées par des molécules d’eau. Il en résulte des microcapsules aqueuses à noyau et à enveloppe d’hydrogel.
Vous trouverez ci-dessous des instructions étape par étape sur la fabrication de dispositifs microfluidiques, la préparation des cellules et l’encapsulation des CSEh.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Les cultures tridimensionnelles (3D) ou sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) offrent les avantages d’une différenciation améliorée et d’une évolutivité améliorée. Dans cet article, nous décrivons une stratégie pour la formation robuste et reproductible de sphéroïdes hPSC où un dispositif de focalisation d’écoulement coaxial est utilisé pour piéger les hPSC à l’intérieur de microcapsules noyau-coque. La solution de base contenait une suspension unicellulaire de CSEh et a été rendue visqueuse par l’incorporation de poly(éthylène glycol) (PEG) de haut poids moléculaire et de milieux de gradient de densité. Le flux de coquille composé de maléimide de bras PEG-4 ou PEG-4-Mal et s’écoulait le long du flux de noyau vers deux jonctions pétrolières consécutives. La formation de gouttelettes s’est produite à la première jonction d’huile avec une solution de coquille s’enroulant autour du noyau. La réticulation chimique de la coquille s’est produite au deuxième carrefour d’huile en introduisant un réticulant di-thiol (1,4-dithiothréitol ou DTT) dans ces gouttelettes. Le réticulant réagit avec les groupes fonctionnels de maléimide via la chimie du clic, ce qui entraîne la formation d’une coquille d’hydrogel autour des microcapsules. Notre technologie d’encapsulation a produit des capsules de 400 μm de diamètre à raison de 10 capsules par seconde. Les capsules résultantes avaient une coquille d’hydrogel et un noyau aqueux qui permettaient aux cellules individuelles de s’assembler rapidement en agrégats et de former des sphéroïdes. Le processus d’encapsulation n’a pas eu d’effet négatif sur la viabilité des CSH, avec une viabilité de >95 % observée 3 jours après l’encapsulation. À titre de comparaison, les CSEh encapsulés dans des microparticules de gel solide (sans noyau aqueux) n’ont pas formé de sphéroïdes et avaient une viabilité de <50% 3 jours après l’encapsulation. La formation de sphéroïdes de CSEh à l’intérieur des microcapsules noyau-enveloppe s’est produite dans les 48 heures suivant l’encapsulation, le diamètre du sphéroïde étant fonction de la densité d’inoculation cellulaire. Dans l’ensemble, la technologie d’encapsulation microfluidique décrite dans ce protocole était bien adaptée à l’encapsulation des HSPC et à la formation de sphéroïdes.

En suivant le protocole mentionné ci-dessus, le lecteur sera en mesure de fabriquer des dispositifs microfluidiques et de produire des microcapsules porteuses de cellules. La figure 3A montre des exemples de microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques. Différentes formulations de PEG-4-Mal ont donné lieu à des capsules de morphologies variables - les capsules ridées étaient associées à une mauvaise gélification...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Cet article décrit l’encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) à l’aide d’un dispositif de focalisation à flux coaxial. Nous démontrons que cette technologie d’encapsulation microfluidique permet la formation efficace de sphéroïdes hPSC.

Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

La zone est considérée comme intéressant pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation que cette culture a formé. Nous avons décrit notre stratégie d’encapsulation qui conduit à la formation reproductible de sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines. Une fois encapsulés, ces sphéroïdes de cellules souches se prêtent à la culture, soit dans des plaques multi-puits, soit dans des bioréacteurs agités.Notre stratégie d’encapsulation consiste à optimiser la capacité de survie à la peste et la haute efficacité de la formation de sphéroïdes. Les sphéroïdes encapsulés sont protégés contre le cisaillement ou l’énergie mécanique associée à l’agitation ou au balancement. Le développement de cellules souches dérivées de la thérapie cellulaire dépend en partie de la capacité à générer le produit cellulaire souhaité de manière évolutive, efficace et rentable.La technologie d’encapsulation décrite ici représente un pas dans cette direction. La technologie d’encapsulation décrite ici sera probablement applicable à la culture 3D de divers types de cellules, d’autres cellules à d’autres cellules souches pluripotentes. Commencez par préparer 30 millilitres de solution mère de deux fois le noyau en mélangeant 4,8 grammes de PEG de 35 kilodaltons, 10,2 millilitres de milieux à gradient de densité et 19,8 millilitres de milieux DMEM/F-12.Ensuite, filtrez cette solution de base à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 micromètre. Ensuite, préparez 50 millilitres d’huile minérale avec 3% de tensioactif en mélangeant 48,5 millilitres d’huile minérale et 1,5 millilitre de tensioactif. Ensuite, stérilisez la solution en la faisant passer à travers un filtre à seringue de 0,22 micromètre.Ensuite, préparez 1 TNT molaire, 1 solution molaire de TEA et 1% de PF127, comme décrit dans le manuscrit du texte. Ensuite, préparez une émulsion de réticulation en mélangeant 4,5 millilitres d’huile minérale avec 3% de tensioactif et 300 microlitres de 1 molaire DTT. Après avoir vortexé la solution pendant deux minutes, soniquer pendant 45 à 60 minutes dans un bain à ultrasons à 20 degrés Celsius et charger dans une seringue de 5 millilitres avec une aiguille de calibre 27.Ensuite, préparez une solution d’huile de protection en chargeant l’huile minérale avec 0,5% de tensioactif dans une seringue de 5 millilitres avec une aiguille de calibre 27. Pour préparer la solution de coquille, ajouter 32 milligrammes de maléimide PEG4 dans 400 microlitres de DPBS. Ensuite, ajoutez 6 microlitres de 1 molaire TEA.Vortex la solution pendant 2 minutes et centrifugez-la à travers un filtre à rotation. Conservez la solution dans l’obscurité sur la bascule pendant 30 minutes avant de la charger dans une seringue de 1 millilitre avec une aiguille de calibre 27. Enfin, préparez la solution de base finale en re-suspendant 20 millions de hPSC dans 200 microlitres et mélangez avec 30 microlitres de 1% PF127 et 200 microlitres de solution de noyau 2X.Insérez une petite barre d’agitation dans une seringue de 1 millilitre. Ensuite, chargez la solution de noyau contenant la cellule dans la seringue avec une aiguille de calibre 27. Commencez par placer le dispositif de gouttelettes PDMS collé, 4 pièces de 20 centimètres de long et 1 pièce de microtubes d’entrée de 5 centimètres de long, 1 pièce de tube de sortie de 10 centimètres et 6 pièces de tubes d’ajustement de 0,5 centimètre sous la source de lumière germicide pendant 30 minutes pour la stérilisation.Maintenant, insérez les 4 pièces de microtubes d’entrée de 20 centimètres de long dans la coque, l’huile, l’émulsion de réticulation et les entrées de dispositif de dissociation à l’aide de pinces. Ensuite, insérez l’extrémité opposée des tubes dans l’aiguille de la seringue avec la solution correspondante. Pendant ce temps, connectez l’entrée du noyau des dispositifs microfluidiques et la sortie des dispositifs de dissociation avec un microtube de 5 centimètres.Insérez 1 tube de sortie dans l’orifice de sortie fluidique et placez l’extrémité opposée dans un réservoir de collecte. Ensuite, placez l’appareil sur une scène de microscope et fixez le tube pour éviter tout mouvement. Alignez et concentrez le microscope sur la buse de l’appareil pour l’inspection du débit.Placez chaque seringue sur différentes pompes à seringue et fixez-la correctement. Programmez chaque pompe selon les protocoles du fabricant aux débits mentionnés dans le manuscrit textuel, et démarrez le débit dans toutes les pompes. Attendez que chaque fluide pénètre dans l’appareil et remplissez les canaux tout en poussant l’air restant.Lorsque la formation de la capsule est stabilisée, placez l’extrémité opposée du tube de collecte dans un nouveau tube conique contenant 5 millilitres de milieu mTeSR. Une fois que suffisamment de capsules sont collectées, incuubez-les pendant 10 minutes. Les capsules résidant dans la phase huileuse seront en haut du tube, qui sédimente vers le bas en tapotant doucement le tube.Pour récupérer les capsules, commencez par retirer l’huile du tube de collecte. Ensuite, placez les capsules sur une passoire cellulaire de 100 micromètres de la taille d’un pore et lavez la passoire avec de grandes quantités de support. Inverser le filtre sur le dessus d’un puits d’une plaque de culture à 6 puits et recueillir les microcapsules en faisant passer 2 millilitres de média à travers le filtre.Incuber les capsules de cellules souches dans un plat de culture à 6 puits à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone. Changez le média tous les deux jours en collectant les capsules sur un filtre à tamis cellulaire, en les lavant avec un excès de média et en les remettant en suspension dans un nouveau puits dans des plaques à 6 puits avec un support de 2 millilitres. Effectuer un test de viabilité en ajoutant 4 microlitres de 2 micromolaires d’Ethidium Homodimer-1 et 1 microlitre des 4 solutions micromolaires de Calcein-AM à 2 millilitres de DPBS stérile.Vortex pour assurer un mélange complet. Recueillir environ 100 microcapsules sur une passoire cellulaire et les rincer avec du DPBS stérile pour permettre la diffusion du milieu hors des capsules. Les recueillir à nouveau dans une plaque de culture à 12 puits en utilisant 1 millilitre de la solution préparée contenant De l’homodimère d’éthidium 1 et de la calcéine AM et incuber à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes.Visualisez les cellules sous un microscope à fluorescence. Les microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques ont montré des différences dans la morphologie de la capsule en fonction de la teneur en PEG4-Maléimide dans la coquille. Les capsules lisses aux bords brillants sont associées à l’intégrité mécanique souhaitée.L’agrégation des perles au centre des capsules indique que le noyau était aqueux et que les perles étaient libres de se déplacer. L’anneau fluorescent indiquait la présence d’une coquille d’hydrogel et était utilisé pour déterminer l’épaisseur de la coque. Des colorations vivantes ou mortes 6 heures après l’encapsulation des cellules H9 ont montré que les cellules atteignaient régulièrement plus de 95% de viabilité pendant les cycles d’encapsulation.En comparant le taux de croissance et le potentiel de différenciation des sphéroïdes encapsulés par rapport aux sphéroïdes non encapsulés. Il a été déterminé que le processus d’encapsulation n’a pas d’effets néfastes sur les CSEh. N’oubliez pas qu’il est important d’établir un rapport de débit optimal entre la coque du noyau et les flux de pétrole.Ne pas le faire peut entraîner des capsules qui ne seront pas mécaniquement solides et peuvent se rompre pendant la manipulation. Nous tenons à souligner que cette technique d’encapsulation était destinée à des types de cellules autres que les cellules souches pluripotentes humaines. Nous avons encapsulé, principalement hypothétisé, des lignées cellulaires cancéreuses et des cellules souches mésenchymateuses à l’aide d’une stratégie similaire.Actuellement, notre équipe développe la prochaine génération de microcaptures. Ces microcaptures sont bioactives et peuvent être chargées de facteurs croisés pour la différenciation encapsulée des cellules souches.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Le développement, l&#39;expansion et<em&gt; In vivo</em&gt; Suivi des cellules NK humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et et induit des cellules souches pluripotentes (CISP)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Recherche

Bio-ingénierie

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidique picolitres bioréacteur pour Analyse microbienne unicellulaire: Fabrication, configuration du système, et l&#39;opération

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Utilisation de l&#39;adhésif Patterning de construire papier dispositifs microfluidiques 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Culture de cellules souches pluripotentes humaines sur Polyvinyl alcool-Co-itaconique acides Hydrogels avec raideur variable dans des Conditions sans Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Échafaudages d'impression de noyau/coquille pour l'ingénierie tissulaire des structures tubulaires

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Mesure du potentiel d’action optique unicellulaire dans les cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Une méthode de culture pour maintenir les cellules souches hématopoïétiques humaines quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...