Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Diese Studie wurde zum Teil durch die Zuschüsse des Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, der J. W. Kieckhefer Foundation, der Al Nahyan Foundation, der Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) und der NIH (DK107255) unterstützt.

1. Geräteherstellung
<ol><li>Erstellen Sie die Entwürfe für die Mikroverkapselungsvorrichtung und die Dissoziationsvorrichtung mit der CAD-Software10,11.</li>
	<li>Schichten Sie die drei Schichten des SU-8-Fotolacks nacheinander auf einem Siliziumwafer (Abbildung 2A), um Strukturen mit den gewünschten Höhen zu erreichen: 60, 100 und 150 μm. HINWEIS: Der Prozess für die oberen und unteren Formen ist identisch.<ol>
<li>Schi...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Der hier beschriebene Verkapselungsprozess führt zu einer reproduzierbaren Bildung von hPSC-Sphäroiden. Das Mikrokapselformat erleichtert die Abgabe von Sphäroiden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für Experimente zur Verbesserung / Optimierung von Differenzierungsprotokollen oder zum Testen von Therapien. Verkapselte Stammzellsphäroide können auch in Suspensionskulturen verwendet werden, in denen die Hydrogelhülle die Zellen vor scherinduzierten Schäden schützt7.
<p class="jove_...

Aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials dieses Kulturformats 1,2,3 besteht ein erhebliches Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPSCs). hPS-Zellen werden typischerweise mittels Bioreaktoren, Mikrotöpfen, Hydrogelen und polymeren Gerüsten zu Sphäroiden oder anderen 3D-Kulturformaten geformt 4,5,6. Die Verkapselung bietet eine weitere Möglichkeit, einzelne hPSCs in Sphäroide zu organisieren. Einmal verkapselte hPSC-Sphäroide können mit Leichtigkeit gehandhabt und in Mikrotiterplatten zur Differenzierung, Krankheitsmodellierung oder Drogentestexperimenten übertragen werden. Die Einkapselung von hPSCs in einer Hydrogelschicht schützt die Zellen auch vor Scherschäden und ermöglicht es, Sphäroide in einem Bioreaktor mit hohen Rührraten zu kultivieren7.
Unsere Methodik zur Stammzellverkapselung hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt. Zunächst konzentrierten wir uns auf feste Hydrogel-Mikropartikel und demonstrierten eine erfolgreiche Verkapselung und Kultivierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus)8. Es wurde jedoch festgestellt, dass menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen, wenn sie in solchen Hydrogel-Mikropartikeln verkapselt wurden, vermutlich aufgrund der größeren Notwendigkeit für diese Zellen, Zell-Zell-Kontakte nach der Verkapselung wiederherzustellen. Wir argumentierten, dass heterogene Mikrokapseln, die einen wässrigen Kern besitzen, besser für die Verkapselung von Zellen geeignet sein könnten, die auf einer schnellen Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten beruhen. Das Konzept der koaxialen Strömungsfokussierung mikrofluidischer Vorrichtung zur Herstellung von wässrigen Kern- / Hydrogel-Hüllen-Mikrokapseln wurde von He et al.9 übernommen, aber anstelle von Alginat, das im ursprünglichen Ansatz verwendet wurde, wurde ein PEG-basiertes Hydrogel in die Schale integriert. Wir zeigten zunächst eine erfolgreiche Verkapselung und Sphäroidbildung von primären Hepatozyten in Kernhüllen-Mikrokapseln10 und beschrieben zuletzt die Verkapselung von hES- und iPS-Zellen7. Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden Kapseln in einer Strömungsfokussierungsvorrichtung hergestellt, bei der die Schalen- und Kernströme von Seite zu Seite in koaxiale Strömung übergehen, bevor sie in die Ölphase ausgestoßen werden. Der Kernstrom enthält Zellen und Additive, die die Viskosität der Lösung erhöhen (nicht-reaktives PEG MW 35kD und Iodixanol - Handelsname OptiPrep), während der Schalenstrom reaktive Moleküle enthält (PEG-4-Mal). Der kontinuierliche koaxiale Strömungsstrom wird in Tröpfchen diskretisiert, die die Kern-Shell-Architektur beibehalten. Die Kern-Schalen-Struktur wird durch die Exposition gegenüber Di-Thiol-Vernetzer (DTT) dauerhaft, der mit PEG-4-Mal über Klickchemie reagiert und zur Bildung einer dünnen (~ 10 μm) Hydrogelhaut oder -schale führt. Nachdem die Emulsion gebrochen und die Kapseln in eine wässrige Phase überführt wurden, diffundieren Moleküle des PEG aus dem Kern und werden durch Wassermoleküle ersetzt. Dies führt zu wässrigen Kern- und Hydrogelschalen-Mikrokapseln.
Im Folgenden finden Sie Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Herstellung mikrofluidischer Geräte, zur Vorbereitung von Zellen und zur Verkapselung von hPS-Systemen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Dreidimensionale (3D) oder sphäroide Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) bieten die Vorteile verbesserter Differenzierungsergebnisse und Skalierbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine Strategie für die robuste und reproduzierbare Bildung von hPSC-Sphäroiden, bei der eine koaxiale Flussfokussierungsvorrichtung verwendet wird, um hPSCs in Kern-Shell-Mikrokapseln einzuschließen. Die Kernlösung enthielt Einzelzellsuspension von hPS-Zellen und wurde durch den Einbau von hochmolekularem Polyethylenglykol (PEG) und Dichtegradientenmedien viskos gemacht. Der Schalenstrom bestand aus PEG-4-Armmaleimid oder PEG-4-Mal und floss entlang des Kernstroms zu zwei aufeinanderfolgenden Ölverbindungen. Die Tröpfchenbildung erfolgte an der ersten Ölverbindung, wobei sich die Schalenlösung um den Kern wickelte. Die chemische Vernetzung der Schale erfolgte am zweiten Ölübergang durch Einbringen eines Dithiol-Vernetzers (1,4-Dithiothreitol oder DTT) in diese Tröpfchen. Der Vernetzer reagiert mit Malemid-funktionellen Gruppen über die Klickchemie, wodurch eine Hydrogelhülle um die Mikrokapseln gebildet wird. Unsere Verkapselungstechnologie produzierte Kapseln mit einem Durchmesser von 400 μm bei einer Rate von 10 Kapseln pro Sekunde. Die resultierenden Kapseln hatten eine Hydrogelhülle und einen wässrigen Kern, der es einzelnen Zellen ermöglichte, sich schnell zu Aggregaten zusammenzusetzen und Sphäroide zu bilden. Der Prozess der Verkapselung wirkte sich nicht negativ auf die Lebensfähigkeit von hPSCs aus, wobei 3 Tage nach der Verkapselung eine Lebensfähigkeit von >95% beobachtet wurde. Zum Vergleich: In festen Gel-Mikropartikeln (ohne wässrigen Kern) verkapselte hPS-Zellen bildeten keine Sphäroide und hatten 3 Tage nach der Verkapselung eine <50%ige Lebensfähigkeit. Die Sphäroidbildung von hPS-Zellen in Kernhüllen-Mikrokapseln erfolgte innerhalb von 48 h nach der Verkapselung, wobei der Sphäroiddurchmesser eine Funktion der Zellimpfdichte war. Insgesamt war die in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Verkapselungstechnologie für die Verkapselung und Sphäroidbildung von hPSCs gut geeignet.

Durch die Befolgung des oben genannten Protokolls wird der Leser in der Lage sein, mikrofluidische Geräte herzustellen und zelltragende Mikrokapseln herzustellen. Abbildung 3A zeigt Beispiele für optimale und suboptimale Mikrokapseln, die mittels mikrofluidischer Tröpfchenerzeugung hergestellt werden. Verschiedene Formulierungen von PEG-4-Mal führten zu Kapseln unterschiedlicher Morphologien - faltige Kapseln waren mit schlechter Gelierung, geringer mechanischer Integrität verbunden und...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.

Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Das Gebiet gilt als Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials, das diese Kultur gebildet hat. Wir haben unsere Verkapselungsstrategie beschrieben, die zur reproduzierbaren Bildung von humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden führt. Nach der Verkapselung sind diese Stammzellsphäroide für die Kultivierung geeignet, entweder in Multi-Well-Platten oder in gerührten Bioreaktoren.Unsere Verkapselungsstrategie besteht darin, die Überlebensfähigkeit der Pest und die hohe Effizienz der Sphäroidbildung zu optimieren. Verkapselte Sphäroide sind gegen Scherung oder mechanische Energie geschützt, die mit Rühren oder Schaukeln verbunden sind. Die Entwicklung von Stammzellen, die aus der Zelltherapie stammen, hängt zum Teil von der Fähigkeit ab, das gewünschte Zellprodukt skalierbar, effizient und kostengünstig zu erzeugen.Die hier beschriebene Verkapselungstechnologie stellt einen Schritt in diese Richtung dar. Die hier beschriebene Verkapselungstechnologie wird wahrscheinlich auf die 3D-Kultivierung verschiedener Zelltypen von anderen Zellen bis hin zu anderen pluripotenten Stammzellen anwendbar sein. Beginnen Sie mit der Herstellung von 30 Millilitern zweifacher Kernmateriallösung, indem Sie 4,8 Gramm 35 Kilodalton PEG, 10,2 Milliliter Dichtegradientenmedien und 19,8 Milliliter DMEM / F-12-Medien mischen.Filtern Sie dann diese Kernlösung mit einem 0,22 Mikrometer langen Spritzenfilter. Als nächstes bereiten Sie 50 Milliliter Mineralöl mit 3 Prozent Tensid vor, indem Sie 48,5 Milliliter Mineralöl und 1,5 Milliliter Tensid mischen. Dann sterilisieren Sie die Lösung, indem Sie sie durch einen 0,22 Mikrometer langen Spritzenfilter führen.Als nächstes bereiten Sie 1 molare DTT-, 1 molare TEA und 1 Prozent PF127-Lösungen vor, wie im Textmanuskript beschrieben. Bereiten Sie dann eine Vernetzeremulsion vor, indem Sie 4,5 Milliliter Mineralöl mit 3 Prozent Tensid und 300 Mikroliter 1 molaren DTT mischen. Nachdem Sie die Lösung zwei Minuten lang besprüht haben, beschallen Sie 45 bis 60 Minuten in einem Ultraschallbad bei 20 Grad Celsius und laden Sie es mit einer 27-Gauge-Nadel auf eine 5-Milliliter-Spritze.Als nächstes bereiten Sie Abschirmöllösung vor, indem Sie das Mineralöl mit 0,5 Prozent Tensid in eine 5-Milliliter-Spritze mit einer 27-Gauge-Nadel laden. Um die Schalenlösung vorzubereiten, fügen Sie 32 Milligramm PEG4-Maleimid in 400 Mikroliter DPBS hinzu. Dann fügen Sie 6 Mikroliter 1 molaren TEA hinzu.Wirbeln Sie die Lösung für 2 Minuten und zentrifugieren Sie sie durch einen Spinfilter. Bewahren Sie die Lösung im Dunkeln 30 Minuten lang auf der Wippe auf, bevor Sie sie mit einer 27-Gauge-Nadel in eine 1-Milliliter-Spritze laden. Bereiten Sie schließlich die endgültige Kernlösung vor, indem Sie 20 Millionen hPSCs in 200-Mikroliter-Medien erneut suspendieren und mit 30 Mikrolitern 1 Prozent PF127 und 200 Mikrolitern 2X-Kernlösung mischen.Führen Sie eine kleine Rührstange in eine 1-Milliliter-Spritze ein. Dann laden Sie die Zelle, die die Kernlösung enthält, mit einer 27-Gauge-Nadel in die Spritze. Beginnen Sie damit, das geklebte PDMS-Tröpfchengerät, 4 Stück 20 Zentimeter lang und 1 Stück 5 Zentimeter lange Einlassmikroröhrchen, 1 Stück 10 Zentimeter Auslassrohr und 6 Stück 0,5 Zentimeter Montagerohre für 30 Minuten zur Sterilisation unter die keimtötende Lichtquelle zu legen.Passen Sie nun die 4 Stück 20 Zentimeter langer Einlassmikroröhrchen mit einer Pinzette in die Schale, das Öl, die Vernetzeremulsion und die Einlässe der Dissoziationsvorrichtung. Führen Sie dann das gegenüberliegende Ende der Schläuche mit der entsprechenden Lösung in die Spritzennadel ein. Verbinden Sie in der Zwischenzeit den Kerneingang der mikrofluidischen Geräte und den Auslass der Dissoziationsgeräte mit einem 5 Zentimeter großen Mikroröhrchen.Stecken Sie 1 Auslassrohr in den Fluidic-Auslassanschluss und legen Sie das gegenüberliegende Ende in einen Auffangbehälter. Als nächstes stellen Sie das Gerät auf eine Mikroskopstufe und befestigen Sie den Schlauch, um jede Bewegung zu vermeiden. Richten und fokussieren Sie das Mikroskop zur Durchflusskontrolle auf die Gerätedüse.Legen Sie jede Spritze auf verschiedene Spritzenpumpen und befestigen Sie sie ordnungsgemäß. Programmieren Sie jede Pumpe nach den Protokollen des Herstellers auf die im Textmanuskript genannten Durchflussraten und starten Sie den Durchfluss in allen Pumpen. Warten Sie, bis jede Flüssigkeit in das Gerät gelangt ist, und füllen Sie die Kanäle auf, während Sie die verbleibende Luft herausdrücken.Wenn die Kapselbildung stabilisiert ist, legen Sie das gegenüberliegende Ende des Auffangrohrs in ein neues konisches Röhrchen, das 5 Milliliter mTeSR-Medien enthält. Sobald genügend Kapseln gesammelt sind, inkubieren Sie sie für 10 Minuten. Die Kapseln, die sich in der Ölphase befinden, befinden sich oben auf der Röhre, die sich beim sanften Klopfen der Röhre nach unten sedimentiert.Um die Kapseln zu entnehmen, entfernen Sie zunächst Öl aus dem Auffangrohr. Legen Sie die Kapseln dann auf ein porengroßes Zellsieb von 100 Mikrometern und waschen Sie das Sieb mit reichlich Medien. Drehen Sie den Filter auf einer Vertiefung einer 6-Well-Kulturplatte um und sammeln Sie die Mikrokapseln, indem Sie 2 Milliliter Medien durch den Filter leiten.Inkubieren Sie die Stammzellkapseln in einer 6-Well-Kulturschale bei 37 Grad Celsius mit 5 Prozent Kohlendioxid. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Kapseln auf einem Zellsiebfilter sammeln, mit überschüssigen Medien waschen und sie in 6-Well-Platten mit 2-Milliliter-Medien wieder an einem neuen Vertiefungsfach aufhängen. Führen Sie einen Rentabilitätstest durch, indem Sie 4 Mikroliter der 2 mikromolaren Ethidium Homodimer-1 und 1 Mikroliter der 4 mikromolaren Calcein-AM-Lösungen zu 2 Milliliter sterilem DPBS hinzufügen.Vortex, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten. Sammeln Sie etwa 100 Mikrokapseln auf einem Zellsieb und spülen Sie sie mit sterilem DPBS ab, damit das Medium aus den Kapseln heraus diffundieren kann. Sammeln Sie sie erneut in einer 12-Well-Kulturplatte mit 1 Milliliter der vorbereiteten Lösung, die Ethidium Homodimer-1 und Calcein AM enthält, und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius für 20 Minuten.Visualisieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop. Die optimalen und suboptimalen Mikrokapseln, die unter Verwendung der mikrofluidischen Tröpfchenerzeugung hergestellt wurden, zeigten Unterschiede in der Kapselmorphologie in Abhängigkeit vom PEG4-Maleimidgehalt in der Schale. Glatte Kapseln mit hellen Kanten sind mit der gewünschten mechanischen Integrität verbunden.Die Aggregation von Perlen in der Mitte der Kapseln zeigt an, dass der Kern wässrig war und die Perlen sich frei bewegen konnten. Der fluoreszierende Ring zeigte das Vorhandensein einer Hydrogelhülle an und wurde verwendet, um die Schalendicke zu bestimmen. Lebende oder tote Färbungen 6 Stunden nach der Verkapselung von H9-Zellen zeigten, dass die Zellen während der Verkapselungsläufe routinemäßig mehr als 95 Prozent Lebensfähigkeit erreichten.Beim Vergleich der Wachstumsrate und des Differenzierungspotenzials von verkapselten und unverkapselten Sphäroiden Es wurde festgestellt, dass der Prozess der Verkapselung keine nachteiligen Auswirkungen auf hPS hat. Bitte denken Sie daran, dass es wichtig ist, ein optimales Durchflussverhältnis zwischen der Kernschale und den Ölströmen festzulegen.Wenn Sie dies nicht tun, kann dies zu Kapseln führen, die mechanisch nicht stark sind und während der Handhabung reißen können. Wir möchten darauf hinweisen, dass diese Verkapselungstechnik für andere Zelltypen als humane pluripotente Stammzellen gedacht war. Wir haben Krebszelllinien und mesenchymale Stammzellen mit einer ähnlichen Strategie gekapselt, hauptsächlich hypothetisch.Derzeit entwickelt unser Team die nächste Generation von Mikrofängen. Diese Mikrofänge sind bioaktiv und können mit Kreuzfaktoren für die verkapselte Differenzierung von Stammzellen belastet sein.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Entwicklung, Erweiterung und<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoring von humanen NK Zellen aus humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und und induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Forschung

Biotechnik

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantation von induzierten pluripotenten Stammzellen-abgeleiteten mesoangioblast-ähnlichen myogenen Vorläufern in Mausmodellen der Muskelregeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Mit Adhesive Patterning 3D Paper Mikrofluidik-Vorrichtungen bauen

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Menschlichen pluripotenten Stammzelle-Kultur auf Polyvinyl Alkohol-Co-Itaconic Säure Hydrogele mit unterschiedlicher Steifigkeit Xeno-freien Bedingungen

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Core/Shell DruckGerüste für Tissue Engineering von Röhrenstrukturen

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Einzelzellige optische Aktionspotentialmessung in human induzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Eine Kulturmethode zur Erhaltung von quiescent Human Hematopoietic Stammzellen

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...