Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

מחקר זה נתמך בחלקו על ידי מענקים ממרכז מאיו קליניק לרפואה רגנרטיבית, קרן J. W. Kieckhefer, קרן אל נהיאן, רפואה רגנרטיבית מינסוטה (RMM 101617 TR 004) ו- NIH (DK107255).

1. ייצור מכשירים
<ol><li>בצע את העיצובים עבור התקן המיקרו-אנקפסולציה והתקן הדיסוציאציה באמצעות תוכנת CAD10,11.</li>
	<li>ספין-ציפו את שלוש השכבות של הפוטורסיסט SU-8 ברצף על פרוסת סיליקון (איור 2A) כדי להשיג מבנים בגבהים הרצויים: 60, 100 ו-150 מיקרומטר. הערה: ה?...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

תהליך האנקפסולציה המתואר כאן מביא להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות hPSC. פורמט המיקרו-קפסולה מקל על חלוקת הספרואידים לבארות של צלחת מיקרוטיטר לניסויים שמטרתם לשפר/למטב פרוטוקולי התמיינות או לבדוק טיפולים. ניתן להשתמש בספרואידים של תאי גזע עטופים גם בתרביות תרחיפים שבהן מעטפת הידרוג'ל מג?...

יש עניין רב בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בשל הפלוריפוטנטיות המשופרת ופוטנציאל ההתמיינות שמעניקה תבנית תרבית זו 1,2,3. hPSCs נוצרים בדרך כלל לספרואידים או לפורמטים אחרים של תרבית תלת-ממדית באמצעות ביו-ריאקטורים, מיקרו-וולים, הידרוג'לים ופיגומים פולימריים 4,5,6. אנקפסולציה מציעה אמצעי נוסף לארגון hPSCs בודדים לספרואידים. לאחר עטיפת כדורי hPSC ניתן לטפל בקלות ולהעבירם ללוחות מיקרוטיטר לצורך התמיינות, מידול מחלות או ניסויים בבדיקת תרופות. עטיפת hPSCs בשכבת הידרוג'ל גם מגנה על התאים מפני נזקי גזירה ומאפשרת תרבית ספרואידים בביוריאקטור בקצבים גבוהים של ערבוב7.
המתודולוגיה שלנו לאנקפסולציה של תאי גזע התפתחה עם הזמן. ראשית, התמקדנו במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל מוצקים והדגמנו אנקפסולציה וטיפוח מוצלחים של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs)8. עם זאת, צוין כי לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הייתה יכולת קיום נמוכה כאשר הם עטופים במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל כאלה, ככל הנראה בשל הצורך הגדול יותר של תאים אלה ליצור מחדש את המגעים בין התא לתאים לאחר האנקפסולציה. סברנו כי מיקרו-קפסולות הטרוגניות, בעלות ליבה מימית, עשויות להתאים יותר לתמצות של תאים המסתמכים על התבססות מחדש מהירה של מגעים בין תאים לתאים. הרעיון של מכשיר מיקרופלואידי ממוקד זרימה צירית משותפת ליצירת מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה/הידרוג'ל מימית הותאם מ-He et al.9, אך במקום אלגינט שהופעל בגישה המקורית, הידרוג'ל מבוסס PEG שולב במעטפת. הדגמנו לראשונה אנקפסולציה מוצלחת והיווצרות כדורית של הפטוציטים ראשוניים במיקרו-קפסולות של קליפת ליבה10 ולאחרונה תיארנו אנקפסולציה של תאי hES ו-iPS7. כפי שמתואר באיור 1A, הקפסולות מיוצרות בהתקן למיקוד זרימה שבו זרמי הזרימה של המעטפת והליבה עוברים מצד לצד לזרימה קו-צירית לפני שהם נפלטים לתוך שלב השמן. זרימת הליבה מכילה תאים ותוספים המגבירים את צמיגות התמיסה (PEG MW 35kD שאינו תגובתי ויודיקסנול - שם מסחרי OptiPrep) בעוד שזרם הקליפה מכיל מולקולות תגובתיות (PEG-4-Mal). זרם זרימה קו-צירית רציפה מחולק בנפרד לטיפות השומרות על ארכיטקטורת מעטפת הליבה. מבנה הליבה-מעטפת הופך לקבוע על ידי חשיפה ל-di-thiol crosslinker (DTT), המגיב עם PEG-4-Mal באמצעות כימיה של קליקים ומביא להיווצרות של עור או מעטפת הידרוג'ל דקים (כ-10 מיקרומטר). לאחר שהאמולסיה נשברת והקפסולות מועברות לשלב מימי, מולקולות של PEG מתפזרות מהליבה ומוחלפות במולקולות מים. התוצאה היא מיקרו-קפסולות של ליבה מימית ומעטפת הידרוג'ל.
להלן הוראות שלב אחר שלב כיצד ליצור התקנים מיקרופלואידיים, כיצד להכין תאים וכיצד לבצע אנקפסולציה של hPSCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) או ספרואידיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מציעות את היתרונות של תוצאות דיפרנציאציה משופרות ומדרגיות. במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה להיווצרות חזקה וניתנת לשחזור של כדוריות hPSC שבהן נעשה שימוש בהתקן מיקוד זרימה צירית משותפת כדי ללכוד hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה. תמיסת הליבה הכילה תרחיף של תאים בודדים של hPSCs ונעשתה צמיגת על ידי שילוב של פולי(אתילן גליקול) בעל משקל מולקולרי גבוה (PEG) ומדיה הדרגתית של צפיפות. זרם הפגזים כלל PEG-4 זרוע-מלימיד או PEG-4-Mal וזרם לצד זרם הליבה לעבר שני צמתי שמן רצופים. היווצרות טיפות התרחשה בצומת השמן הראשון כאשר תמיסת המעטפת עוטפת את עצמה סביב הליבה. הצלבה כימית של הקונכייה התרחשה בצומת השמן השני על ידי החדרת צלב די-תיול (1,4-dithiothreitol או DTT) לטיפות אלה. ההצלבה מגיבה עם קבוצות פונקציונליות של מאלימיד באמצעות כימיה של קליקים, וכתוצאה מכך נוצרת מעטפת הידרוג'ל סביב המיקרו-קפסולות. טכנולוגיית האנקפסולציה שלנו ייצרה כמוסות בקוטר 400 מיקרומטר בקצב של 10 כמוסות בשנייה. הכמוסות שהתקבלו היו בעלות קליפת הידרוג'ל ולייבה מימית שאפשרה לתאים בודדים להתקבץ במהירות לאגרגטים וליצור ספרואידים. תהליך האנקפסולציה לא השפיע לרעה על הכדאיות של hPSCs, כאשר הכדאיות >95% נצפתה 3 ימים לאחר האנקפסולציה. לשם השוואה, hPSCs עטופים במיקרו-חלקיקי ג'ל מוצקים (ללא ליבה מימית) לא יצרו כדוריות והיו בעלי כדאיות <50% 3 ימים לאחר האנקפסולציה. היווצרות כדורית של hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של קליפת ליבה התרחשה תוך 48 שעות לאחר האנקפסולציה, כאשר קוטר הספרואידים הוא פונקציה של צפיפות חיסון התא. באופן כללי, טכנולוגיית האנקפסולציה המיקרופלואידית המתוארת בפרוטוקול זה התאימה היטב לאנקפסולציה של hPSCs ולהיווצרות ספרואידים.

על ידי ביצוע הפרוטוקול הנ"ל, הקורא יוכל לייצר התקנים מיקרופלואידיים ולייצר מיקרו-קפסולות נושאות תאים. איור 3A מציג דוגמאות למיקרו-קפסולות אופטימליות ולא אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות. פורמולציות שונות של PEG-4-Mal הביאו לכמוסות בעלות מורפולוגיות שונות...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.

ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

האזור נחשב לעניין בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים בשל שיפור הפלוריפוטנטיות ופוטנציאל ההתמיינות שתרבית זו יצרה. תיארנו את אסטרטגיית האנקפסולציה שלנו שמובילה להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. לאחר שהם מתמצתים, כדוריות תאי גזע אלה ניתנות לטיפוח, בין אם בלוחות מרובי בארות או בביוריאקטורים מעורבבים.אסטרטגיית האנקפסולציה שלנו היא לייעל את שרידות ההדברה ואת היעילות הגבוהה של היווצרות ספרואידים. כדוריות עטוף מוגנות מפני גזירה או אנרגיה מכנית הקשורה לערבוב או נדנדה. פיתוח תאי גזע שמקורם בטיפול התאי תלוי בחלקו ביכולת לייצר את המוצר התאי הרצוי באופן מדרגי, יעיל וחסכוני.טכנולוגיית האנקפסולציה המתוארת כאן מייצגת צעד בכיוון זה. טכנולוגיית האנקפסולציה המתוארת כאן תהיה ככל הנראה ישימה לטיפוח תלת-ממדי של סוגי תאים שונים מתאים אחרים לתאי גזע פלוריפוטנטיים אחרים. התחל על ידי הכנת 30 מיליליטרים של תמיסת מלאי ליבה כפולה כפולה על ידי ערבוב של 4.8 גרם של 35 קילודלטון PEG, 10.2 מיליליטרים של מדיית שיפוע צפיפות, ו-19.8 מיליליטרים של מדיית DMEM/F-12.לאחר מכן סנן פתרון ליבה זה באמצעות מסנן מזרק מיקרומטר של 0.22 מיקרומטר. לאחר מכן, להכין 50 מיליליטרים של שמן מינרלי עם 3 אחוז פעילי שטח על ידי ערבוב 48.5 מיליליטר של שמן מינרלי ו 1.5 מיליליטר של פעילי שטח. לאחר מכן לעקר את התמיסה על ידי העברתה דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.לאחר מכן, הכן 1 DTT טוחן, 1 תה טוחן, ו 1 אחוז PF127 פתרונות, כמתואר בכתב היד של הטקסט. לאחר מכן הכינו תחליב cross-linker על ידי ערבוב של 4.5 מיליליטרים של שמן מינרלי עם 3 אחוז פעילי שטח ו-300 מיקרוליטרים של 1 DTT טוחן. לאחר מערבולת התמיסה במשך שתי דקות, סוניקט במשך 45 עד 60 דקות באמבטיה קולית ב 20 מעלות צלזיוס ולהעמיס אותו למזרק 5 מיליליטר עם מחט 27 מד.לאחר מכן, הכינו תמיסת שמן מיגון על ידי העמסת השמן המינרלי בחומר פעילי שטח של 0.5 אחוז למזרק 5 מיליליטר עם מחט 27 מדים. כדי להכין את תמיסת המעטפת, הוסף 32 מיליגרם של PEG4 maleimide ב-400 מיקרוליטרים של DPBS. לאחר מכן, הוסף 6 מיקרוליטרים של 1 TEA טוחן.מערבולת את הפתרון במשך 2 דקות וצנטריפוגה אותו באמצעות מסנן ספין. שמור את התמיסה בחושך על הנדנדה במשך 30 דקות לפני טעינה לתוך מזרק 1 מיליליטר עם מחט 27 מד. לבסוף, הכן את פתרון הליבה הסופי על-ידי השעיה מחדש של 20 מיליון hPSCs במדיה של 200 מיקרוליטרים וערבב עם 30 מיקרוליטרים של 1 אחוז PF127 ו-200 מיקרוליטרים של פתרון ליבה 2X.מכניסים מוט מיקסר קטן למזרק 1 מיליליטר. לאחר מכן, טען את תמיסת הליבה המכילה את התא לתוך המזרק עם מחט של 27 מדים. התחל על ידי הצבת מכשיר הטיפות PDMS מלוכד, 4 חתיכות באורך 20 ס"מ, וחתיכה אחת של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 5 ס"מ, חתיכה אחת של צינור מוצא 10 ס"מ ו-6 חתיכות של צינורות מתאימים באורך 0.5 ס"מ מתחת למקור האור החיידקי למשך 30 דקות לצורך עיקור.כעת התאימו את 4 החלקים של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 20 ס"מ לתוך הקונכייה, השמן, תחליב ההצלבה והכניסות למכשירי הדיסוציאציה באמצעות מלקחיים. לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי של הצינורות לתוך מחט המזרק עם הפתרון המתאים. בינתיים, חברו את כניסת הליבה של המכשירים המיקרופלואידיים ואת שקע התקני הדיסוציאציה עם מיקרו-צינורית של 5 סנטימטרים.הכנס צינור יציאה אחד ליציאת היציאה הנוזלית והכניס את הקצה הנגדי למאגר איסוף. לאחר מכן, הניחו את המכשיר על במת מיקרוסקופ והצמידו את הצינורות כדי למנוע כל תנועה. יישמו את המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על זרבובית המכשיר לצורך בדיקת זרימה.מניחים כל מזרק על משאבות מזרק שונות ואובטחים כראוי. תכנת כל משאבה על פי פרוטוקולי היצרן לקצבי הזרימה המוזכרים בכתב היד של הטקסט, והתחל את הזרימה בכל המשאבות. המתן עד שכל נוזל ייכנס למכשיר ומלא את הערוצים תוך כדי דחיפת האוויר הנותר.כאשר היווצרות הקפסולה מתייצבת, מניחים את הקצה הנגדי של צינור האיסוף לתוך צינור חרוטי חדש המכיל 5 מיליליטרים של מדיית mTeSR. לאחר שנאספות מספיק כמוסות, דגירה אותם במשך 10 דקות. הכמוסות הנמצאות בשלב השמן יהיו בחלק העליון של הצינור, אשר משקעים לתחתית בעת הקשה עדינה על הצינור.כדי לאחזר את הכמוסות, התחילו בהסרת שמן מצינור האיסוף. לאחר מכן, מניחים את הכמוסות על מסננת תאים בגודל נקבובית של 100 מיקרומטר ושוטפים את המסננת בכמויות אדירות של מדיה. הפכו את המסנן על גבי באר של צלחת תרבית בת 6 בארות ואספו את המיקרו-קפסולות על ידי העברת 2 מיליליטרים של מדיה דרך המסנן.דגירה של כמוסות תאי הגזע בצלחת תרבית של 6 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5 אחוז פחמן דו חמצני. החליפו את המדיה אחת ליומיים על ידי איסוף הכמוסות על מסנן מסנני תאים, שטיפתן במדיה עודפת ותלייתן מחדש לבאר חדשה בצלחות 6 בארות עם 2 מיליליטר מדיה. בצע בדיקת כדאיות על ידי הוספת 4 מיקרוליטרים של 2 מיקרומולר Ethidium Homodimer-1 ומיקרוליטר אחד של 4 תמיסות Calcein-AM מיקרומולריות ל -2 מיליליטרים של DPBS סטרילי.מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא. אספו כ-100 מיקרו-קפסולות על מסננת תאים ושטפו אותן ב-DPBS סטרילי כדי לאפשר דיפוזיה בינונית החוצה מהכמוסות. אספו אותם שוב בצלחת תרבית של 12 בארות באמצעות מיליליטר אחד של התמיסה המוכנה המכילה אתידיום הומודימר-1 וקלצין AM ודגירה ב-37 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. המיקרו-קפסולות האופטימליות והתת-אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות הראו הבדלים במורפולוגיה של הקפסולה כפונקציה של תכולת PEG4-Maleimide במעטפת. כמוסות חלקות עם קצוות בהירים קשורות לשלמות המכנית הרצויה.צבירה של חרוזים במרכז הכמוסות מצביעה על כך שהליבה הייתה מימית והחרוזים היו חופשיים לנוע. האנולוס הפלואורסצנטי הצביע על נוכחות של מעטפת הידרוג'ל ושימש לקביעת עובי הקונכייה. כתמים חיים או מתים 6 שעות לאחר עטיפת תאי H9 הראו שהתאים השיגו יותר מ-95 אחוזי כדאיות באופן שגרתי במהלך ריצות האנקפסולציה.על ידי השוואת קצב הצמיחה ופוטנציאל ההבחנה של כדוריות עטופות לעומת לא מכוסות. נקבע כי לתהליך האנקפסולציה אין השפעות שליליות על hPSCs. זכור, חשוב לקבוע יחס קצב זרימה אופטימלי בין מעטפת הליבה לזרמי הנפט.הימנעות מכך עלולה לגרום לכמוסות שלא יהיו חזקות מכנית ועלולות להיקרע במהלך הטיפול. ברצוננו לציין שטכניקת אנקפסולציה זו נועדה לסוגי תאים שאינם תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. עטפנו, בעיקר השערות, קווי תאים סרטניים ותאי גזע מזנכימליים באמצעות אסטרטגיה דומה.נכון לעכשיו, הצוות שלנו מפתח את הדור הבא של מיקרו-לכידות. מיקרו-לכידות אלה הן ביו-אקטיביות ועשויות להיות עמוסות בגורמים צולבים להתמיינות עטופה של תאי גזע.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

פיתוח, הרחבה, ו<em&gt; בvivo</emתאי גזע pluripotent&gt; ניטור של תאי NK אדם מתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ומושרה (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

השתלה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרה נגזר Mesoangioblast כמו אבות מיוגניים במודלים עכבר של התחדשות שרירים

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

באמצעות דפוסים דבקים כדי לבנות התקני 3D נייר Microfluidic

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

התרבות תאי גזע Pluripotent אנושי על פוליויניל אלכוהול-Co-Itaconic Hydrogels חומצה עם קשיות שונות בתנאים קסנו-חופשית

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

ליבה/פגז הדפסה פיגומים קפלים להנדסת רקמות של מבנים צינורי

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

שיטת תרבות לשמירה על תאי גזע ההמטוטופיאטיים האנושיים

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...