Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

इस अध्ययन को मेयो क्लिनिक सेंटर फॉर रीजेनरेटिव मेडिसिन, जे डब्ल्यू किचेफर फाउंडेशन, अल नाहयान फाउंडेशन, पुनर्योजी चिकित्सा मिनेसोटा (आरएमएम 101617 टीआर 004), और एनआईएच (डीके 107255) से अनुदान द्वारा भाग में समर्थित किया गया था।

1. डिवाइस निर्माण
<ol><li>CAD सॉफ़्टवेयर10,11 का उपयोग करके माइक्रोएनकैप्सुलेशन डिवाइस और पृथक्करण डिवाइस के लिए डिज़ाइन बनाएं।</li>
	<li>स्पिन-कोट एक सिलिकॉन वेफर (चित्रा 2 ए) पर एसय...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

यहां वर्णित encapsulation प्रक्रिया hPSC गोलाकार के पुनरुत्पादक गठन में परिणाम है। माइक्रोकैप्सूल प्रारूप भेदभाव प्रोटोकॉल में सुधार / अनुकूलन या परीक्षण उपचार के उद्देश्य से प्रयोगों के लिए एक माइक्रोटिटर प्...

इस संस्कृति प्रारूप 1,2,3 द्वारा प्रदान की गई बेहतर प्लूरिबिलिटी और भेदभाव क्षमता के कारण मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी)की 3 डी संस्कृतियों में काफी रुचि है। hPSCs आमतौर पर बायोरिएक्टर, microwells, hydrogels, और बहुलक scaffolds 4,5,6 के माध्यम से गोलाकार या अन्य 3 डी संस्कृति प्रारूपों में गठित कर रहे हैं। Encapsulation गोलाकार में एकल hPSCs के आयोजन के लिए एक और साधन प्रदान करता है। एक बार encapsulated hPSC गोलाकार आसानी से संभाला जा सकता है और भेदभाव, रोग मॉडलिंग, या दवा परीक्षण प्रयोगों के लिए माइक्रोटिटर प्लेटों में स्थानांतरित किया जा सकता है। एक हाइड्रोजेल परत में hPSCs encasing भी कतरनी क्षति के खिलाफ कोशिकाओं की रक्षा करता है और सरगर्मी 7 की उच्च दर पर एक बायोरिएक्टर में गोलाकार संस्कृति की अनुमति देताहै।
स्टेम सेल encapsulation के लिए हमारी पद्धति समय के साथ विकसित हुई। सबसे पहले, हमने ठोस हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों पर ध्यान केंद्रित किया और माउस भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (mESCs) 8 की सफल encapsulation और खेती का प्रदर्शन किया। हालांकि, यह ध्यान दिया गया था कि मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (एचईएससी) में कम व्यवहार्यता थी जब इस तरह के हाइड्रोजेल सूक्ष्म कणों में समझाया गया था, संभवतः इन कोशिकाओं को एनकैप्सुलेशन के बाद सेल-सेल संपर्कों को फिर से स्थापित करने की अधिक आवश्यकता के कारण। हमने तर्क दिया कि विषम माइक्रोकैप्सूल, एक जलीय कोर रखने वाले, कोशिकाओं के encapsulation के लिए बेहतर अनुकूल हो सकते हैं जो सेल-सेल संपर्कों की तेजी से पुन: स्थापना पर भरोसा करते हैं। जलीय कोर / हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल बनाने के लिए माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस पर ध्यान केंद्रित करने वाले सह-अक्षीय प्रवाह की अवधारणा को He et al.9 से अनुकूलित किया गया था, लेकिन मूल दृष्टिकोण में नियोजित एल्गिनेट के बजाय, एक पीईजी-आधारित हाइड्रोजेल को खोल में शामिल किया गया था। हमने पहली बार कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल्स10 में प्राथमिक हेपेटोसाइट के सफल एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन का प्रदर्शन किया और हाल ही में एचईएस और आईपीएस कोशिकाओं केएनकैप्सुलेशन का वर्णन किया। जैसा कि चित्रा 1 ए में उल्लिखित है, कैप्सूल को एक प्रवाह फोकसिंग डिवाइस में गढ़ा जाता है जहां शेल और कोर प्रवाह धाराएं तेल चरण में इजेक्शन से पहले साइड-टू-साइड से सह-अक्षीय प्रवाह में संक्रमण करती हैं। कोर प्रवाह में कोशिकाएं और एडिटिव्स होते हैं जो समाधान की चिपचिपाहट को बढ़ाते हैं (गैर-प्रतिक्रियाशील PEG MW 35kD और iodixanol - वाणिज्यिक नाम OptiPrep) जबकि शेल स्ट्रीम में प्रतिक्रियाशील अणु (PEG-4-Mal) होते हैं। निरंतर सह-अक्षीय प्रवाह धारा को बूंदों में विभाजित किया जाता है जो कोर-शेल आर्किटेक्चर को बनाए रखते हैं। कोर-शेल संरचना को डी-थिओल क्रॉसलिंकर (डीटीटी) के संपर्क में आने से स्थायी बनाया जाता है, जो क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से PEG-4-Mal के साथ प्रतिक्रिया करता है और परिणामस्वरूप एक पतली (~ 10 μm) हाइड्रोजेल त्वचा या खोल का गठन होता है। इमल्शन टूटने के बाद और कैप्सूल को एक जलीय चरण में स्थानांतरित कर दिया जाता है, पीईजी के अणु कोर से फैलते हैं और पानी के अणुओं द्वारा प्रतिस्थापित किए जाते हैं। इसके परिणामस्वरूप जलीय कोर और हाइड्रोजेल शेल माइक्रोकैप्सूल होते हैं।
नीचे दिए गए चरण-दर-चरण निर्देश हैं कि माइक्रोफ्लुइडिक उपकरण कैसे बनाएं, कोशिकाओं को कैसे तैयार किया जाए, और एचपीएससी के एनकैप्सुलेशन को कैसे पूरा किया जाए।

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) की त्रि-आयामी (3 डी) या गोलाकार संस्कृतियां बेहतर भेदभाव परिणामों और स्केलेबिलिटी के लाभ प्रदान करती हैं। इस पेपर में, हम एचपीएससी गोलाकार के मजबूत और पुनरुत्पादक गठन के लिए एक रणनीति का वर्णन करते हैं जहां एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी को फंसाने के लिए किया जाता है। कोर समाधान में एचपीएससी का एकल सेल निलंबन शामिल था और उच्च आणविक भार पॉली (एथिलीन ग्लाइकोल) (पीईजी) और घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया को शामिल करके चिपचिपा बनाया गया था। शेल स्ट्रीम में PEG-4 आर्म-मैलिमाइड या PEG-4-Mal शामिल थे और दो लगातार तेल जंक्शनों की ओर कोर स्ट्रीम के साथ बहते थे। ड्रॉपलेट गठन पहले तेल जंक्शन पर शेल समाधान के साथ कोर के चारों ओर खुद को लपेटने के साथ हुआ। इन बूंदों के लिए एक di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol या DTT) पेश करके दूसरे तेल जंक्शन पर शेल का रासायनिक क्रॉसलिंकिंग हुआ। क्रॉसलिंकर क्लिक रसायन विज्ञान के माध्यम से मैलिमाइड कार्यात्मक समूहों के साथ प्रतिक्रिया करता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोकैप्सूल के चारों ओर एक हाइड्रोजेल खोल का गठन होता है। हमारी encapsulation प्रौद्योगिकी प्रति सेकंड 10 कैप्सूल की दर से 400 μm व्यास कैप्सूल का उत्पादन किया। परिणामी कैप्सूल में एक हाइड्रोजेल खोल और एक जलीय कोर था जिसने एकल कोशिकाओं को तेजी से समुच्चय में इकट्ठा करने और गोलाकार बनाने की अनुमति दी थी। एनकैप्सुलेशन की प्रक्रिया ने एचपीएससी की व्यवहार्यता को प्रतिकूल रूप से प्रभावित नहीं किया, जिसमें >95% व्यवहार्यता 3 दिनों के बाद एनकैप्सुलेशन देखी गई। तुलना के लिए, ठोस जेल सूक्ष्म कणों (एक जलीय कोर के बिना) में encapsulated hPSCs गोलाकार नहीं बनाते थे और encapsulation के 3 दिन बाद <50% व्यवहार्यता थी। कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल के अंदर एचपीएससी का गोलाकार गठन एनकैप्सुलेशन के बाद 48 घंटे के भीतर हुआ, जिसमें गोलाकार व्यास सेल इनोक्यूलेशन घनत्व का एक कार्य था। कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल में वर्णित माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी एनकैप्सुलेशन और गोलाकार गठन के लिए अच्छी तरह से अनुकूल थी।

उपर्युक्त प्रोटोकॉल का पालन करके, पाठक माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों को बनाने और सेल-ले जाने वाले माइक्रोकैप्सूल का उत्पादन करने में सक्षम होगा। चित्रा 3A माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट पीढ़ी का उपय...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

यह आलेख एक सह-अक्षीय प्रवाह फोकसिंग डिवाइस का उपयोग करके मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (hPSCs) के encapsulation का वर्णन करता है। हम प्रदर्शित करते हैं कि यह माइक्रोफ्लुइडिक एनकैप्सुलेशन तकनीक एचपीएससी गोलाकार के कुशल गठन को सक्षम बनाती है।

मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल गोलाकार ले जाने वाले कोर-शेल माइक्रोकैप्सूल का माइक्रोफ्लुइडिक फैब्रिकेशन

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

इस क्षेत्र को मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की 3 डी संस्कृतियों में रुचि का माना जाता है क्योंकि इस संस्कृति का गठन किया गया है। हमने अपनी encapsulation रणनीति का वर्णन किया है जो मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के गोलाकार के पुनरुत्पादक गठन की ओर जाता है। एक बार encapsulated, इन स्टेम सेल गोलाकार खेती के लिए उपयुक्त हैं, या तो बहु अच्छी तरह से प्लेटों या उत्तेजित bioreactors में.हमारी encapsulation रणनीति महामारी उत्तरजीविता और गोलाकार गठन की उच्च दक्षता का अनुकूलन है। Encapsulated गोलाकार कतरनी या यांत्रिक ऊर्जा सरगर्मी या रॉकिंग के साथ जुड़े के खिलाफ संरक्षित कर रहे हैं. सेलुलर थेरेपी व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं का विकास एक स्केलेबल, कुशल और लागत प्रभावी तरीके से वांछित सेलुलर उत्पाद उत्पन्न करने की क्षमता पर निर्भर करता है।यहां वर्णित encapsulation तकनीक इस दिशा में एक कदम का प्रतिनिधित्व करती है। यहां वर्णित encapsulation तकनीक संभवतः अन्य कोशिकाओं से अन्य प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के लिए विभिन्न सेल प्रकारों की 3 डी खेती पर लागू होगी। 35 किलोडाल्टन पीईजी के 4.8 ग्राम, घनत्व ग्रेडिएंट मीडिया के 10.2 मिलीलीटर, और डीएमईएम / एफ -12 मीडिया के 19.8 मिलीलीटर को मिलाकर दो बार कोर स्टॉक समाधान के 30 मिलीलीटर तैयार करके शुरू करें।फिर 0.22 माइक्रोमीटर सिरिंज फ़िल्टर का उपयोग करके इस कोर समाधान को फ़िल्टर करें। इसके बाद, खनिज तेल के 48.5 मिलीलीटर और surfactant के 1.5 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा 3 प्रतिशत surfactant के साथ खनिज तेल के 50 milliliters तैयार करें। फिर इसे 0.22 माइक्रोमीटर सिरिंज फिल्टर के माध्यम से पारित करके समाधान को निष्फल करें।इसके बाद, 1 दाढ़ डीटीटी, 1 दाढ़ टीईए, और 1 प्रतिशत PF127 समाधान तैयार करें, जैसा कि पाठ पांडुलिपि में वर्णित है। फिर 3 प्रतिशत surfactant और 1 दाढ़ डीटीटी के 300 माइक्रोलीटर के साथ खनिज तेल के 4.5 मिलीलीटर मिश्रण द्वारा एक क्रॉस-लिंकर इमल्शन तैयार करें। दो मिनट के लिए समाधान भंवर के बाद, 20 डिग्री सेल्सियस पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में 45 से 60 मिनट के लिए sonicate और यह एक 27 गेज सुई के साथ एक 5 मिलीलीटर सिरिंज के लिए लोड।इसके बाद, 27 गेज सुई के साथ 5 मिलीलीटर सिरिंज में 0.5 प्रतिशत surfactant के साथ खनिज तेल लोड करके परिरक्षण तेल समाधान तैयार करें। खोल समाधान तैयार करने के लिए, DPBS के 400 माइक्रोलीटर में PEG4 maleimide के 32 मिलीग्राम जोड़ें। फिर, 1 दाढ़ TEA के 6 माइक्रोलीटर जोड़ें।भंवर 2 मिनट के लिए समाधान और एक स्पिन फिल्टर के माध्यम से यह centrifuge. 27 गेज सुई के साथ 1 मिलीलीटर सिरिंज में लोड होने से पहले 30 मिनट के लिए रॉकर पर अंधेरे में समाधान रखें। अंत में, 200 माइक्रोलीटर मीडिया में 20 मिलियन एचपीएससी को फिर से निलंबित करके अंतिम कोर समाधान तैयार करें और 1 प्रतिशत पीएफ 127 के 30 माइक्रोलीटर और 2एक्स कोर समाधान के 200 माइक्रोलीटर के साथ मिश्रण करें।एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में एक छोटा सा हलचल पट्टी डालें। फिर, कोर समाधान वाले सेल को 27 गेज सुई के साथ सिरिंज में लोड करें। बंधुआ PDMS ड्रॉपलेट डिवाइस, 20 सेंटीमीटर लंबे के 4 टुकड़े, और 5 सेंटीमीटर लंबे इनलेट माइक्रोट्यूब के 1 टुकड़े, 10 सेंटीमीटर आउटलेट ट्यूब का 1 टुकड़ा और नसबंदी के लिए 30 मिनट के लिए कीटाणुनाशक प्रकाश स्रोत के नीचे 0.5 सेंटीमीटर फिटिंग ट्यूब के 6 टुकड़े रखकर शुरू करें।अब 20 सेंटीमीटर लंबे इनलेट माइक्रोट्यूब के 4 टुकड़ों को शेल, तेल, क्रॉस-लिंकर इमल्शन, और संदंश का उपयोग करके पृथक्करण डिवाइस इनलेट्स में फिट करें। फिर, संबंधित समाधान के साथ सिरिंज सुई में ट्यूबों के विपरीत छोर को डालें। इस बीच, माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों कोर इनलेट और पृथक्करण उपकरणों को 5 सेंटीमीटर माइक्रोट्यूब के साथ कनेक्ट करें।Fluidic आउटलेट पोर्ट में 1 आउटलेट ट्यूब डालें और एक संग्रह जलाशय में विपरीत छोर जगह। इसके बाद, डिवाइस को माइक्रोस्कोप चरण पर रखें और किसी भी आंदोलन से बचने के लिए टयूबिंग को संलग्न करें। संरेखित करें और प्रवाह निरीक्षण के लिए डिवाइस नोजल पर माइक्रोस्कोप पर ध्यान केंद्रित करें।प्रत्येक सिरिंज को अलग-अलग सिरिंज पंपों पर रखें और ठीक से सुरक्षित करें। पाठ पांडुलिपि में उल्लिखित प्रवाह दरों के लिए निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार प्रत्येक पंप को प्रोग्राम करें, और सभी पंपों में प्रवाह शुरू करें। डिवाइस में प्रवेश करने के लिए प्रत्येक तरल पदार्थ की प्रतीक्षा करें और शेष हवा को धक्का देते हुए चैनलों को भरें।जब कैप्सूल गठन स्थिर हो जाता है, तो संग्रह ट्यूब के विपरीत छोर को एक नई शंक्वाकार ट्यूब में रखें जिसमें mTeSR मीडिया के 5 मिलीलीटर होते हैं। एक बार पर्याप्त कैप्सूल एकत्र होने के बाद, उन्हें 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। तेल चरण में रहने वाले कैप्सूल ट्यूब के शीर्ष पर होंगे, जो ट्यूब को धीरे से टैप करने पर नीचे की ओर तलछट करते हैं।कैप्सूल को पुनः प्राप्त करने के लिए, संग्रह ट्यूब से तेल को हटाकर शुरू करें। फिर, कैप्सूल को 100 माइक्रोमीटर रंध्र आकार के सेल छलनी पर रखें और मीडिया की प्रचुर मात्रा के साथ छलनी को धोएं। एक 6-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट के एक कुएं के शीर्ष पर फिल्टर को उलटें और फिल्टर के माध्यम से मीडिया के 2 मिलीलीटर पारित करके माइक्रोकैप्सूल एकत्र करें।स्टेम सेल कैप्सूल को 5 प्रतिशत कार्बन डाइऑक्साइड के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 6-अच्छी तरह से संस्कृति डिश में इनक्यूबेट करें। एक सेल छलनी फिल्टर पर कैप्सूल एकत्र करके हर दूसरे दिन मीडिया को बदलें, उन्हें अतिरिक्त मीडिया के साथ धोएं और उन्हें 2 मिलीलीटर मीडिया के साथ 6-अच्छी तरह से प्लेटों में एक नए कुएं पर फिर से निलंबित करें। बाँझ DPBS के 2 milliliters के लिए 4 micromolar Ethidium Homodimer-1 और 4 micromolar Calcein-AM समाधान के 1 माइक्रोलीटर के 4 माइक्रोलीटर जोड़कर व्यवहार्यता परख प्रदर्शन करें।पूर्ण मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए भंवर. एक सेल छलनी पर लगभग 100 microcapsules ले लीजिए और कैप्सूल से बाहर मध्यम प्रसार की अनुमति देने के लिए बाँझ DPBS के साथ उन्हें कुल्ला। उन्हें फिर से एक 12-अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में इकट्ठा करें, जिसमें एथिडियम होमोडिमर -1 और कैल्सीन एएम युक्त तैयार समाधान के 1 मिलीलीटर का उपयोग किया जाता है और 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट किया जाता है।प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की कल्पना करें। माइक्रोफ्लुइडिक ड्रॉपलेट पीढ़ी का उपयोग करके निर्मित इष्टतम और सबऑप्टिमल माइक्रोकैप्सूल ने शेल में PEG4-Maleimide सामग्री के एक समारोह के रूप में कैप्सूल आकृति विज्ञान में अंतर दिखाया। उज्ज्वल किनारों के साथ चिकनी कैप्सूल वांछित यांत्रिक अखंडता के साथ जुड़े हुए हैं।कैप्सूल के केंद्र में मोतियों का एकत्रीकरण इंगित करता है कि कोर जलीय था और मोती चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए स्वतंत्र थे। फ्लोरोसेंट एनुलस ने हाइड्रोजेल शेल की उपस्थिति का संकेत दिया और शेल मोटाई निर्धारित करने के लिए इसका उपयोग किया गया था। एच 9 कोशिकाओं को एनकैप्सुलेट करने के 6 घंटे बाद जीवित या मृत धुंधला होने से पता चला है कि कोशिकाओं ने एनकैप्सुलेशन रन के दौरान नियमित रूप से 95 प्रतिशत से अधिक व्यवहार्यता हासिल की।विकास दर और encapsulated बनाम unencapsulated गोलाकार की विभेदन क्षमता की तुलना पर. यह निर्धारित किया गया था कि encapsulation की प्रक्रिया hPSCs पर कोई प्रतिकूल प्रभाव नहीं पड़ता है। कृपया याद रखें, कोर शेल और तेल धाराओं के बीच इष्टतम प्रवाह दर अनुपात स्थापित करना महत्वपूर्ण है।ऐसा न करने से कैप्सूल हो सकते हैं जो यांत्रिक रूप से मजबूत नहीं होंगे और हैंडलिंग के दौरान टूट सकते हैं। हम यह इंगित करना चाहते हैं कि यह एनकैप्सुलेशन तकनीक मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं के अलावा अन्य सेल प्रकारों के लिए थी। हमने एक समान रणनीति का उपयोग करके encapsulated, मुख्य रूप से परिकल्पना, कैंसर सेल लाइनों, और मेसेनकाइमल स्टेम कोशिकाओं को शामिल किया है।वर्तमान में, हमारी टीम माइक्रोकैप्चर की अगली पीढ़ी विकसित कर रही है। ये माइक्रोकैप्चर बायोएक्टिव हैं और स्टेम कोशिकाओं के एनकैप्सुलेटेड भेदभाव के लिए क्रॉस कारकों से भरे हो सकते हैं।

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

विकास, विस्तार, और<em&gt; विवो में</em&gt; मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) से मानव एन.के. कोशिकाओं की निगरानी और और प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

मांसपेशियों के उत्थान के माउस मॉडल में प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न मेसोंगियोब्लास्ट की तरह मायोजेनिक प्रोजेनिटर का प्रत्यारोपण

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3 डी कागज microfluidic उपकरणों का निर्माण करने के लिए चिपकने वाला patterning के उपयोग करना

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Polyvinyl शराब पर मानव Pluripotent स्टेम सेल संस्कृति-सह-Itaconic एसिड Hydrogels के तहत अलग कठोरता के साथ एक्सो-मुक्त शर्तों

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

ट्यूबलर संरचनाओं के ऊतक इंजीनियरिंग के लिए कोर/

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

मानव प्रेरित Pluripotent स्टेम सेल-व्युत्पन्न कार्डियोमायोसाइट्स में एकल सेल ऑप्टिकल एक्शन संभावित माप

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

शांत मानव हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल को बनाए रखने के लिए एक संस्कृति विधि

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...