Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Questo studio è stato supportato in parte dalle sovvenzioni del Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).

1. Fabbricazione del dispositivo
<ol><li>Realizza i progetti per il dispositivo di microincapsulazione e il dispositivo di dissociazione utilizzando il software CAD10,11.</li>
	<li>Spin-coat i tre strati di SU-8 fotoresistono sequenzialmente su un wafer di silicio (Figura 2A) per ottenere strutture con le altezze desiderate: 60, 100 e 150 μm. NOTA: il processo per gli stampi superiore e inferiore è identico.<ol>
<li>Spin coat ...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Il processo di incapsulamento qui descritto si traduce nella formazione riproducibile di sferoidi hPSC. Il formato a microcapsula facilita l'erogazione di sferoidi nei pozzetti di una piastra di microtitolazione per esperimenti volti a migliorare/ottimizzare i protocolli di differenziazione o testare terapie. Gli sferoidi a cellule staminali incapsulati possono anche essere utilizzati in colture di sospensioni in cui il guscio di idrogel protegge le cellule dai danni indotti dal taglio7.
<p cl...

C'è un notevole interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione offerti da questo formatodi coltura 1,2,3. Le hPSC sono tipicamente formate in sferoidi o altri formati di coltura 3D per mezzo di bioreattori, microwell, idrogel e scaffold polimerici 4,5,6. L'incapsulamento offre un altro mezzo per organizzare singole hPSC in sferoidi. Una volta incapsulati, gli sferoidi hPSC possono essere maneggiati con facilità e trasferiti in piastre di microtitolazione per la differenziazione, la modellazione della malattia o esperimenti di test antidroga. L'involucro di hPSC in uno strato di idrogel protegge anche le cellule dai danni da taglio e consente di coltivare sferoidi in un bioreattore ad alti tassi di agitazione7.
La nostra metodologia per l'incapsulamento delle cellule staminali si è evoluta nel tempo. In primo luogo, ci siamo concentrati sulle microparticelle di idrogel solido e abbiamo dimostrato successo nell'incapsulamento e nella coltivazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC)8. Tuttavia, è stato notato che le cellule staminali embrionali umane (hESC) avevano una bassa vitalità quando incapsulate in tali microparticelle di idrogel, presumibilmente a causa della maggiore necessità per queste cellule di ristabilire i contatti cellula-cellula dopo l'incapsulamento. Abbiamo ragionato sul fatto che la microcapsula eterogenea, che possiede un nucleo acquoso, può essere più adatta per l'incapsulamento di cellule che si basano sul rapido ristabilimento dei contatti cellula-cellula. Il concetto di dispositivo microfluidico di focalizzazione del flusso coassiale per la produzione di microcapsule acquose a nucleo / guscio idrogel è stato adattato da He et al.9, ma invece dell'alginato impiegato nell'approccio originale, un idrogel a base di PEG è stato incorporato nel guscio. Abbiamo prima dimostrato il successo dell'incapsulamento e della formazione sferoide di epatociti primari in microcapsule10 del guscio centrale e più recentemente descritto incapsulamento di cellule hES e iPS7. Come delineato nella Figura 1A, le capsule sono fabbricate in un dispositivo di messa a fuoco del flusso in cui i flussi di flusso del guscio e del nucleo passano da un lato all'altro al flusso coassiale prima dell'espulsione nella fase dell'olio. Il flusso del nucleo contiene cellule e additivi che aumentano la viscosità della soluzione (PEG MW 35kD non reattivo e iodixanolo - nome commerciale OptiPrep) mentre il flusso del guscio contiene molecole reattive (PEG-4-Mal). Il flusso continuo coassiale viene discretizzato in goccioline che mantengono l'architettura core-shell. La struttura del guscio centrale è resa permanente dall'esposizione al reticolante di-tiolo (DTT), che reagisce con PEG-4-Mal tramite la chimica del clic e provoca la formazione di una pelle o di un guscio di idrogel sottile (~ 10 μm). Dopo che l'emulsione è stata rotta e le capsule sono state trasferite in una fase acquosa, le molecole di PEG si diffondono dal nucleo e vengono sostituite da molecole d'acqua. Ciò si traduce in microcapsule a nucleo acquoso e guscio idrogel.
Di seguito sono fornite istruzioni dettagliate su come realizzare dispositivi microfluidici, come preparare le cellule e come eseguire l'incapsulamento delle hPSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Le colture tridimensionali (3D) o sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) offrono i vantaggi di migliori risultati di differenziazione e scalabilità. In questo articolo, descriviamo una strategia per la formazione robusta e riproducibile di sferoidi hPSC in cui un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale viene utilizzato per intrappolare le hPSC all'interno di microcapsule core-shell. La soluzione principale conteneva sospensione monocellulare di hPSC ed è stata resa viscosa dall'incorporazione di poli(glicole etilenico) ad alto peso molecolare (PEG) e mezzi gradienti di densità. Il flusso di guscio comprendeva PEG-4 braccio-maleimmide o PEG-4-Mal e scorreva lungo il flusso centrale verso due giunzioni petrolifere consecutive. La formazione di goccioline si è verificata alla prima giunzione dell'olio con la soluzione del guscio che si avvolge attorno al nucleo. La reticolazione chimica del guscio si è verificata alla seconda giunzione dell'olio introducendo un reticolante di-tiolo (1,4-ditiotreitolo o DTT) a queste goccioline. Il reticolante reagisce con i gruppi funzionali della maleimmide tramite la chimica dei clic, con conseguente formazione di un guscio di idrogel attorno alle microcapsule. La nostra tecnologia di incapsulamento ha prodotto capsule da 400 μm di diametro ad una velocità di 10 capsule al secondo. Le capsule risultanti avevano un guscio di idrogel e un nucleo acquoso che permetteva alle singole cellule di assemblarsi rapidamente in aggregati e formare sferoidi. Il processo di incapsulamento non ha influenzato negativamente la vitalità delle hPSC, con una vitalità >95% osservata 3 giorni dopo l'incapsulamento. Per confronto, le hPSC incapsulate in microparticelle di gel solido (senza un nucleo acquoso) non formavano sferoidi e avevano una vitalità <50% 3 giorni dopo l'incapsulamento. La formazione sferoide di hPSC all'interno di microcapsule core-shell si è verificata entro 48 ore dall'incapsulamento, con il diametro sferoide in funzione della densità di inoculazione cellulare. Nel complesso, la tecnologia di incapsulamento microfluidico descritta in questo protocollo era adatta per l'incapsulamento delle hPSC e la formazione di sferoidi.

Seguendo il protocollo sopra menzionato, il lettore sarà in grado di fabbricare dispositivi microfluidici e produrre microcapsule portatrici di cellule. La Figura 3A mostra esempi di microcapsule ottimali e non ottimali fabbricate utilizzando la generazione di goccioline microfluidiche. Diverse formulazioni di PEG-4-Mal hanno portato a capsule di morfologia variabile: le capsule rugose erano associate a scarsa gelificazione, bassa integrità meccanica e non resistevano alla coltivazione in ...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Questo articolo descrive l'incapsulamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) utilizzando un dispositivo di messa a fuoco del flusso coassiale. Dimostriamo che questa tecnologia di incapsulamento microfluidico consente una formazione efficiente di sferoidi hPSC.

Fabbricazione microfluidica di microcapsule Core-Shell che trasportano sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

L'area è considerata di interesse per le colture 3D di cellule staminali pluripotenti umane a causa del miglioramento della pluripotenza e del potenziale di differenziazione che questa cultura ha formato. Abbiamo descritto la nostra strategia di incapsulamento che porta alla formazione riproducibile di sferoidi di cellule staminali pluripotenti umane. Una volta incapsulati, questi sferoidi di cellule staminali sono suscettibili di coltivazione, sia in piastre multi-pozzo che in bioreattori mescolati.La nostra strategia di incapsulamento è ottimizzare la capacità di sopravvivenza della pestilenza e l'alta efficienza della formazione di sferoidi. Gli sferoidi incapsulati sono protetti contro il taglio o l'energia meccanica associata all'agitazione o al dondolo. Lo sviluppo di cellule staminali derivate dalla terapia cellulare dipende in parte dalla capacità di generare il prodotto cellulare desiderato in modo scalabile, efficiente ed economico.La tecnologia di incapsulamento qui descritta rappresenta un passo in questa direzione. La tecnologia di incapsulamento qui descritta sarà probabilmente applicabile alla coltivazione 3D di vari tipi di cellule da altre cellule ad altre cellule staminali pluripotenti. Iniziare preparando 30 millilitri di soluzione madre due volte core mescolando 4,8 grammi di 35 kilodalton PEG, 10,2 millilitri di fluidi gradienti di densità e 19,8 millilitri di supporti DMEM/F-12.Quindi filtrare questa soluzione di base utilizzando un filtro a siringa da 0,22 micrometri. Quindi, preparare 50 millilitri di olio minerale con tensioattivo al 3% mescolando 48,5 millilitri di olio minerale e 1,5 millilitri di tensioattivo. Quindi sterilizzare la soluzione facendola passare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micrometri.Quindi, preparare 1 DTT molare, 1 TEA molare e 1% di soluzioni PF127, come descritto nel manoscritto di testo. Quindi preparare un'emulsione reticolante mescolando 4,5 millilitri di olio minerale con tensioattivo al 3% e 300 microlitri di 1 DTT molare. Dopo aver vorticoso la soluzione per due minuti, sonicare per 45-60 minuti in un bagno ad ultrasuoni a 20 gradi Celsius e caricarla su una siringa da 5 millilitri con un ago calibro 27.Quindi, preparare la soluzione di olio schermante caricando l'olio minerale con tensioattivo allo 0,5% in una siringa da 5 millilitri con un ago calibro 27. Per preparare la soluzione di guscio, aggiungere 32 milligrammi di peg4 maleimide in 400 microlitri di DPBS. Quindi, aggiungere 6 microlitri di 1 TEA molare.Vortice la soluzione per 2 minuti e centrifugandola attraverso un filtro di centrifuga. Tenere la soluzione al buio sul bilanciere per 30 minuti prima di caricarla in una siringa da 1 millilitro con un ago calibro 27. Infine, preparare la soluzione di base finale sospendendo nuovamente 20 milioni di hPSC in 200 microlitri e mescolare con 30 microlitri dell'1% PF127 e 200 microlitri di soluzione core 2X.Inserire una piccola barra agitatrice in una siringa da 1 millilitro. Quindi, caricare la soluzione di nucleo contenente la cella nella siringa con un ago calibro 27. Iniziare posizionando il dispositivo a goccia PDMS incollato, 4 pezzi di 20 centimetri di lunghezza e 1 pezzo di microtubi di ingresso lunghi 5 centimetri, 1 pezzo di tubo di uscita da 10 centimetri e 6 pezzi di tubi di montaggio da 0,5 centimetri sotto la sorgente luminosa germicida per 30 minuti per la sterilizzazione.Ora inserisci i 4 pezzi di microtubi di ingresso lunghi 20 centimetri nel guscio, nell'olio, nell'emulsione reticolante e nelle prese d'ingresso del dispositivo di dissociazione usando una pinza. Quindi, inserire l'estremità opposta dei tubi nell'ago della siringa con la soluzione corrispondente. Nel frattempo, collegare l'ingresso principale dei dispositivi microfluidici e l'uscita dei dispositivi di dissociazione con un microtubo di 5 centimetri.Inserire 1 tubo di uscita nella porta di uscita fluidica e posizionare l'estremità opposta in un serbatoio di raccolta. Quindi, posizionare il dispositivo su uno stadio del microscopio e collegare il tubo per evitare qualsiasi movimento. Allineare e focalizzare il microscopio sull'ugello del dispositivo per l'ispezione del flusso.Posizionare ogni siringa su diverse pompe a siringa e fissarla correttamente. Programmare ogni pompa secondo i protocolli del produttore alle portate menzionate nel manoscritto di testo e avviare il flusso in tutte le pompe. Attendere che ogni fluido entri nel dispositivo e riempire i canali mentre si spinge fuori l'aria rimanente.Quando la formazione della capsula è stabilizzata, posizionare l'estremità opposta del tubo di raccolta in un nuovo tubo conico contenente 5 millilitri di mezzi mTeSR. Una volta raccolte abbastanza capsule, incubarle per 10 minuti. Le capsule che risiedono nella fase oleosa saranno nella parte superiore del tubo, che si deposita sul fondo dopo aver toccato delicatamente il tubo.Per recuperare le capsule, iniziare rimuovendo l'olio dal tubo di raccolta. Quindi, posizionare le capsule su un filtro cellulare di dimensioni dei pori di 100 micrometri e lavare il filtro con abbondanti quantità di mezzi. Invertire il filtro sopra un pozzetto di una piastra di coltura a 6 pozzetti e raccogliere le microcapsule facendo passare 2 millilitri di terreno attraverso il filtro.Incubare le capsule di cellule staminali in un piatto di coltura a 6 pozzetti a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Cambiare i supporti a giorni alterni raccogliendo le capsule su un filtro filtrante cellulare, lavandole con i mezzi in eccesso e sospendendole nuovamente in un nuovo pozzo in piastre a 6 pozzetti con mezzi da 2 millilitri. Eseguire il test di vitalità aggiungendo 4 microlitri dei 2 micromolari Ethidium Homodimer-1 e 1 microlitro delle 4 soluzioni micromolari di Calcein-AM a 2 millilitri di DPBS sterile.Vortice per garantire la miscelazione completa. Raccogliere circa 100 microcapsule su un filtro cellulare e risciacquarle con DPBS sterile per consentire la diffusione del mezzo dalle capsule. Raccoglierli nuovamente in una piastra di coltura a 12 pozzetti usando 1 millilitro della soluzione preparata contenente Ethidium Homodimer-1 e calceina AM e incubare a 37 gradi Celsius per 20 minuti.Visualizza le cellule al microscopio a fluorescenza. Le microcapsule ottimali e subottimali fabbricate utilizzando la generazione di goccioline microfluidiche hanno mostrato differenze nella morfologia della capsula in funzione del contenuto di PEG4-Maleimide nel guscio. Le capsule lisce con bordi luminosi sono associate all'integrità meccanica desiderata.L'aggregazione di perline al centro delle capsule indica che il nucleo era acquoso e le perline erano libere di muoversi. L'anulus fluorescente indicava la presenza di un guscio di idrogel ed era usato per determinare lo spessore del guscio. Le macchie vive o morte 6 ore dopo l'incapsulamento delle cellule H9 hanno dimostrato che le cellule hanno raggiunto una vitalità superiore al 95% durante le corse di incapsulamento.Confrontando il tasso di crescita e il potenziale di differenziazione degli sferoidi incapsulati rispetto a quelli non incapsulati. È stato determinato che il processo di incapsulamento non ha effetti negativi sulle hPSC. Ricorda che è importante stabilire un rapporto di portata ottimale tra il guscio centrale e i flussi di olio.Non farlo può causare capsule che non saranno meccanicamente forti e potrebbero rompersi durante la manipolazione. Vorremmo sottolineare che questa tecnica di incapsulamento era per tipi di cellule diversi dalle cellule staminali pluripotenti umane. Abbiamo incapsulato, principalmente ipotizzato, linee cellulari tumorali e cellule staminali mesenchimali utilizzando una strategia simile.Attualmente, il nostro team sta sviluppando la prossima generazione di microcapture. Queste microcatture sono bioattive e possono essere caricate con fattori incrociati per la differenziazione incapsulata delle cellule staminali.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Sviluppo, di espansione, e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitoraggio delle cellule NK umane da cellule staminali embrionali umane (hESC) ed e cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Ricerca

Bioingegneria

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trapianto di progenitori miogenici pluripotenti derivati da cellule staminali indotte simili a mesoangioblasti nei modelli di topo di rigenerazione muscolare

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Utilizzando adesivo Patterning per costruire dispositivi microfluidici di carta 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Cultura di cellule staminali pluripotenti umane il polivinil alcool-Co-itaconico acido idrogel con diverse rigidità nelle circostanze senza Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

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Scaffold di stampa Core/shell per l'ingegneria dei tessuti di strutture tubolari

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

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Misurazione del potenziale d'azione ottico a singola cellula in cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Un metodo di coltura per mantenere le cellule staminali ematopoietiche umane quiescenti

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...