Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

この研究は、メイヨー・クリニック再生医療センター、J・W・キークヘファー財団、アル・ナヒヤン財団、ミネソタ州再生医療(RMM 101617 TR 004)、NIH(DK107255)からの助成金によって部分的に支援された。

1. デバイス製造
<ol><li>マイクロカプセル化装置及び解離装置の設計は、CADソフトウェア10,11を用いて行う。</li>
	<li>SU-8フォトレジストの3層をシリコンウェーハ上に順次スピンコートし(図2A)、所望の高さ(60、100、および150μm)の構造を達成する。 メモ: 上部金型と下部金型のプロセスは同じです。<ol>
<li>SU-8 2025ネガ型フォト?...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

ここで説明するカプセル化プロセスは、hPSCスフェロイドの再現性のある形成をもたらす。マイクロカプセル形式により、分化プロトコルの改善/最適化または治療法の試験を目的とした実験のために、マイクロタイタープレートのウェルにスフェロイドを簡単に分配できます。封入幹細胞スフェロイドは、ヒドロゲルシェルが剪断誘発損傷から細胞を保護する懸濁培養においても使用され得?...

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の3D培養には、この培養フォーマットによってもたらされる改善された多能性および分化能のためにかなりの関心がある1、2、3。hPSCは、典型的には、バイオリアクター、マイクロウェル、ヒドロゲル、およびポリマー足場4、5、6によってスフェロイドまたは他の3D培養フォーマットに成形される。カプセル化は、単一のhPSCを回転楕円体に編成するための別の手段を提供する。一旦カプセル化されたhPSCスフェロイドは、容易に取り扱い、分化、疾患モデリング、または薬物検査実験のためにマイクロタイタープレートに移され得る。ヒドロゲル層にhPSCを包み込むと、剪断損傷から細胞を保護し、バイオリアクター内でスフェロイドを高い攪拌速度で培養することができます7。
幹細胞カプセル化のための私たちの方法論は、時間の経過とともに進化しました。まず、固体ヒドロゲル微粒子に着目し、マウス胚性幹細胞(mESC)の内包・培養に成功したことを実証しました8。しかし、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、このようなヒドロゲル微粒子に封入した場合の生存率が低いことが注目されたが、これはおそらく、これらの細胞が封入後に細胞間接触を再確立する必要性が大きいためである。我々は、水性コアを有する不均一なマイクロカプセルが、細胞間接触の迅速な再確立に依存する細胞のカプセル化に適している可能性があると推論した。水性コア/ヒドロゲルシェルマイクロカプセルを製造するための同軸流集束マイクロ流体装置の概念は、He et al.9から適応されたが、元のアプローチで採用されたアルギン酸塩の代わりに、PEGベースのヒドロゲルがシェルに組み込まれた。我々はまず、コアシェル型マイクロカプセル10 における初代肝細胞のカプセル化およびスフェロイド形成の成功を実証し、最近ではhESおよびiPS細胞のカプセル化7について説明した。 図1Aで概説されているように、カプセルは、シェルおよびコアの流れが油相に放出される前に、左右から同軸の流れに移行するフロー集束装置内で製造される。コアフローには溶液の粘度を増加させる細胞および添加剤(非反応性PEG MW 35kDおよびイオジキサノール - 商品名OptiPrep)が含まれ、シェルストリームには反応性分子(PEG-4-Mal)が含まれています。連続的な同軸流流は、コアシェルアーキテクチャを保持する液滴に離散化される。コアシェル構造は、クリック化学 を介して PEG-4-Malと反応し、薄い(〜10μm)ヒドロゲルスキンまたはシェルの形成をもたらすジチオール架橋剤(DTT)への曝露によって恒久的になる。エマルジョンが破壊され、カプセルが水相に移された後、PEGの分子はコアから拡散し、水分子によって置き換えられる。これは、水性コアおよびヒドロゲルシェルマイクロカプセルをもたらす。
以下に、マイクロ流体デバイスの製造方法、細胞の調製方法、およびhPSCのカプセル化方法に関するステップバイステップの手順を示します。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の三次元(3D)またはスフェロイド培養は、分化転帰およびスケーラビリティの改善という利点を提供する。本稿では、コアシェルマイクロカプセル内にhPSCを閉じ込めるために同軸流集束装置を利用するhPSCスフェロイドの堅牢で再現性のある形成のための戦略を説明する。コア溶液はhPSCsの単一細胞懸濁液を含み、高分子量ポリ(エチレングリコール)(PEG)および密度勾配培地の混入によって粘性を持たせた。シェルストリームはPEG-4アームマレイミドまたはPEG-4-Malで構成され、コアストリームに沿って2つの連続したオイルジャンクションに向かって流れました。液滴形成は、シェル溶液がコアの周りに自分自身を包み込む最初のオイル接合部で起こった。シェルの化学的架橋は、これらの液滴にジチオール架橋剤(1,4−ジチオスレイトールまたはDTT)を導入することによって、第2の油接合部で起こった。架橋剤は、クリック化学 を介して マレイミド官能基と反応し、マイクロカプセルの周囲にヒドロゲルシェルを形成する。当社のカプセル化技術は、直径400μmのカプセルを毎秒10カプセルの割合で製造しました。得られたカプセルは、ヒドロゲルシェルと水性コアを有し、単一細胞が迅速に凝集体に集合し、スフェロイドを形成することを可能にする。カプセル化のプロセスはhPSCの生存率に悪影響を及ぼさず、カプセル化後3日目に>95%の生存率が観察された。比較のために、固体ゲル微粒子(水性コアなし)に封入されたhPSCはスフェロイドを形成せず、封入後3日目に<50%の生存率を有していた。コアシェル型マイクロカプセル内のhPSCのスフェロイド形成は、封入後48時間以内に起こり、スフェロイド直径は細胞接種密度の関数である。全体として、このプロトコルに記載されているマイクロ流体カプセル化技術は、hPSCsカプセル化および回転楕円体形成に適していた。

上記のプロトコルに従うことによって、読者はマイクロ流体デバイスを作製し、細胞運搬マイクロカプセルを製造することができるであろう。 図3A は、マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルの例を示す。PEG−4−Malの異なる製剤は、様々な形態のカプセルをもたらした - しわのあるカプセルは、貧弱なゲル化、低い機械的完全性?...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。

ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

この領域は、この培養物が形成した多能性および分化能の向上によるヒト多能性幹細胞の3D培養において興味深いと考えられる。我々は、ヒト多能性幹細胞スフェロイドの再現性のある形成をもたらす我々のカプセル化戦略を説明した。一旦封入されると、これらの幹細胞スフェロイドは、マルチウェルプレートまたは撹拌バイオリアクターのいずれかで、培養に適している。私たちのカプセル化戦略は、スフェロイド形成の疫病の生存性と高効率を最適化することです。カプセル化されたスフェロイドは、攪拌または揺動に関連するせん断または機械的エネルギーから保護される。細胞療法から誘導された幹細胞の開発は、スケーラブルで効率的かつ費用対効果の高い方法で所望の細胞産物を生成する能力に部分的に依存する。ここで説明するカプセル化技術は、この方向への一歩を表しています。ここで説明するカプセル化技術は、おそらく他の細胞から他の多能性幹細胞まで様々な細胞型の3D培養に適用できるだろう。まず、4.8グラムの35キロダルトンPEG、10.2ミリリットルの密度勾配媒体、および19.8ミリリットルのDMEM/F-12媒体を混合することによって、30ミリリットルの2倍のコアストック溶液を調製することから始めます。次に、このコア溶液を0.22マイクロメートルのシリンジフィルターを使用してろ過します。次に、48.5ミリリットルの鉱物油と1.5ミリリットルの界面活性剤を混合することによって、50ミリリットルの鉱物油と3%の界面活性剤を調製する。次いで、0.22マイクロメートルのシリンジフィルターに通すことによって溶液を滅菌する。次に、テキスト原稿に記載されているように、1モルDTT、1モルTEA、および1%PF127溶液を調製する。次いで、4.5ミリリットルの鉱物油を3%の界面活性剤および300マイクロリットルの1モルDTTと混合することによって架橋剤エマルジョンを調製する。溶液を2分間ボルテックスした後、摂氏20度の超音波浴中で45〜60分間超音波処理し、27ゲージ針で5ミリリットルのシリンジにロードする。次に、鉱物油に0.5%の界面活性剤を27ゲージ針を備えた5ミリリットルのシリンジに装填して遮蔽油溶液を調製する。シェル溶液を調製するために、400マイクロリットルのDPBSに32ミリグラムのPEG4マレイミドを加える。次いで、6マイクロリットルの1モルTEAを加える。溶液を2分間渦巻きにし、スピンフィルターを通して遠心分離する。溶液をロッカーの暗闇に30分間保持してから、27ゲージの針で1ミリリットルのシリンジにロードします。最後に、2,000万hPSCを200マイクロリットルの媒体に再懸濁し、30マイクロリットルの1%PF127および200マイクロリットルの2倍コア溶液と混合することによって、最終的なコア溶液を調製する。小さなスターラーバーを1ミリリットルのシリンジに挿入します。次に、コア溶液を含むセルを27ゲージの針でシリンジにロードします。まず、結合されたPDMS液滴装置、長さ20センチメートルの4本、長さ5センチメートルの入口マイクロチューブ1本、出口チューブ1本、および0.5センチメートルのフィッティングチューブ6個を殺菌光源の下に30分間置いて滅菌します。次に、長さ20センチメートルの入口マイクロチューブ4本を、鉗子を使用してシェル、オイル、架橋剤エマルジョン、および解離装置入口に合わせます。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液とともにシリンジ針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスコア入口と解離デバイス出口とを5センチメートルのマイクロチューブで接続する。1本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバに入れます。次に、デバイスを顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動きを避けます。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します。メーカーのプロトコルに従って各ポンプをテキスト原稿に記載されている流量にプログラムし、すべてのポンプでフローを開始します。各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。カプセル形成が安定したら、収集チューブの反対側の端を、5ミリリットルのmTeSR媒体を含む新しい円錐形チューブに入れます。十分なカプセルが集められたら、それらを10分間インキュベートする。油相に存在するカプセルはチューブの上部にあり、チューブを軽く叩くと底に沈降します。カプセルを取り出すには、まず回収チューブから油を取り除きます。次に、100マイクロメートルの孔径のセルストレーナーにカプセルを置き、大量の培地でストレーナーを洗浄します。6ウェル培養プレートのウェルの上にフィルターを反転させ、フィルターに2ミリリットルの培地を通すことによってマイクロカプセルを集める。幹細胞カプセルを6ウェル培養皿に入れ、摂氏37度で5%の二酸化炭素でインキュベートする。1日おきに、カプセルをセルストレーナーフィルターで回収し、余分な培地で洗浄し、2ミリリットルの培地を含む6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁することによって、培地を交換します。2マイクロリットルの滅菌DPBSに4マイクロリットルの2マイクロモルのエチジウムホモダイマー−1および1マイクロリットルの4マイクロモルのカルセイン−AM溶液を加えることによって生存率アッセイを行う。完全な混合を確実にするための渦。セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから媒体拡散できるようにします。エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAMを含む調製溶液1ミリリットルを用いて、それらを12ウェル培養プレートに再度収集し、摂氏37度で20分間インキュベートする。蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルは、シェル中のPEG4−マレイミド含量の関数としてのカプセル形態に違いを示した。明るいエッジを有する滑らかなカプセルは、所望の機械的完全性に関連する。カプセルの中央におけるビーズの凝集は、コアが水性であり、ビーズが自由に動き回っていたことを示している。蛍光環状はヒドロゲルシェルの存在を示し、シェルの厚さを決定するために使用した。H9細胞を封入してから6時間後の生染色または死染色は、細胞が封入実行中に日常的に95%以上の生存率を達成したことを示した。カプセル化スフェロイドと非カプセル化スフェロイドの増殖速度および分化能を比較した。カプセル化のプロセスはhPSCに悪影響を及ぼさないことが決定された。コアシェルとオイルストリーム間の最適な流量比を確立することが重要です。これを行わないと、カプセルが機械的に強くならず、取り扱い中に破裂する可能性があります。このカプセル化技術は、ヒト多能性幹細胞以外の細胞型に対するものであったことを指摘しておきたい。我々は、同様の戦略を用いて、主に仮説上の癌細胞株および間葉系幹細胞をカプセル化した。現在、私たちのチームは次世代のマイクロキャプチャを開発しています。これらのマイクロキャプチャーは生理活性であり、幹細胞のカプセル化された分化のための交差因子を負荷してもよい。

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

開発、展開、および<em生体内で&gt;</em&gt;ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）からヒトNK細胞のモニタリングとや人工多能性幹細胞（性IPSC）

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

筋肉再生のマウスモデルにおける誘導多能性幹細胞由来メソアンジオ芽細胞様筋原性前駆細胞の移植

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

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3Dペーパーマイクロ流体デバイスを構築するために接着剤パターニングを使用して、

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Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Xeno 無料条件下におけるさまざまな剛性とポリビニル アルコール Co イタコン酸ゲルのひと多能性幹細胞文化

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Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

ヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞における単細胞光学作用電位測定

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

静止ヒト造血幹細胞を維持する培養法

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...