Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
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이 연구는 Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) 및 NIH (DK107255)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

1. 장치 제작
<ol><li>CAD 소프트웨어10,11을 사용하여 마이크로 캡슐화 장치 및 해리 장치에 대한 설계를 수행합니다.</li>
	<li>SU-8 포토레지스트의 세 층을 실리콘 웨이퍼 상에 순차적으로 스핀 코팅하여(도 2A) 원하는 높이의 구조를 달성한다: 60, 100 및 150 μm. 참고: 상단 및 하단 금형의 공정은 동일합니다.<ol>
<li>깨끗한 10 cm 실리콘 ...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

여기에 설명된 캡슐화 과정은 hPSC 구상체의 재현 가능한 형성을 초래한다. 마이크로 캡슐 형식을 사용하면 분화 프로토콜 개선 / 최적화 또는 치료법 테스트를 목표로하는 실험을 위해 구상체를 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 쉽게 분배 할 수 있습니다. 캡슐화된 줄기 세포 구상체는 또한 하이드로겔 쉘이 전단-유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 현탁 배양물에서 사용될 수 있다<sup class="xre...

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3D 배양에는 이러한 배양 형식 1,2,3에 의해 제공되는 향상된 다능성 및 분화 잠재력으로 인해 상당한 관심이 있다. hPSC는 전형적으로 생물반응기, 마이크로웰, 하이드로겔 및 중합체성 스캐폴드 4,5,6을 통해 구상체 또는 다른 3D 배양 포맷으로 형성된다. 캡슐화는 단일 hPSC를 구상체로 조직하는 또 다른 방법을 제공합니다. 일단 캡슐화된 hPSC 구상체는 용이하게 처리되고 분화, 질병 모델링, 또는 약물 시험 실험을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮겨질 수 있다. 하이드로겔 층에 hPSC를 포위하는 것은 또한 전단 손상으로부터 세포를 보호하고, 높은 교반 속도로 생물반응기에서 구상체를 배양할 수 있게한다(7).
줄기 세포 캡슐화에 대한 우리의 방법론은 시간이 지남에 따라 진화했습니다. 첫째, 우리는 고체 하이드로겔 미세입자에 초점을 맞추고 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)의 성공적인 캡슐화 및 배양을 입증했습니다8. 그러나, 인간 배아줄기세포(hESCs)는 이러한 하이드로겔 마이크로입자에 캡슐화될 때 생존율이 낮으며, 아마도 캡슐화 후 세포-세포 접촉을 재확립하기 위해 이들 세포가 더 많이 필요하기 때문인 것으로 추정된다. 우리는 수성 코어를 소유하고있는 이종 마이크로 캡슐이 세포 - 세포 접촉의 신속한 재 확립에 의존하는 세포의 캡슐화에 더 적합 할 수 있다고 추론했다. 수성 코어/하이드로겔 쉘 마이크로캡슐을 제조하기 위한 동축 유동 포커싱 마이크로유체 장치의 개념은 He et al.9에서 채택되었지만, 원래의 접근법에 사용된 알지네이트 대신에, PEG 기반 하이드로겔이 쉘에 통합되었다. 우리는 먼저 코어-쉘 마이크로캡슐(10 )에서 원발성 간세포의 성공적인 캡슐화 및 스페로이드 형성을 입증하였고, 가장 최근에 hES 및 iPS 세포(7)의 캡슐화를 기술하였다. 도 1A에 요약된 바와 같이, 캡슐은 오일 페이즈로 토출되기 전에 쉘 및 코어 유동 스트림이 좌우에서 동축 흐름으로 전환되는 흐름 집속 장치로 제조된다. 코어 흐름에는 용액의 점도를 증가시키는 세포 및 첨가제 (비 반응성 PEG MW 35kD 및 iodixanol - 상업명 OptiPrep)가 포함되어 있으며 쉘 스트림에는 반응성 분자 (PEG-4-Mal)가 포함되어 있습니다. 연속 동축 흐름 스트림은 코어 쉘 아키텍처를 유지하는 물방울로 이산화됩니다. 코어-쉘 구조는 디티올 가교제(DTT)에 노출됨으로써 영구적으로 만들어지며, 이는 클릭 화학을 통해 PEG-4-Mal과 반응하여 얇은(~10 μm) 하이드로겔 피부 또는 쉘의 형성을 초래한다. 에멀젼이 깨지고 캡슐이 수성상으로 옮겨지면 PEG 분자가 코어에서 확산되어 물 분자로 대체됩니다. 이로 인해 수성 코어 및 하이드로겔 쉘 마이크로캡슐이 생성됩니다.
아래에는 미세 유체 장치를 만드는 방법, 세포를 준비하는 방법 및 hPSC의 캡슐화를 수행하는 방법에 대한 단계별 지침이 제공됩니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3차원 (3D) 또는 스페로이드 배양은 향상된 분화 결과 및 확장성의 이점을 제공한다. 이 논문에서는 동축 흐름 초점 장치를 사용하여 코어 쉘 마이크로 캡슐 내부에 hPSC를 포획하는 hPSC 구상체의 견고하고 재현 가능한 형성을위한 전략을 설명합니다. 코어 용액은 hPSCs의 단일 세포 현탁액을 함유하고, 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 밀도 구배 매질의 혼입에 의해 점성으로 만들어졌다. 쉘 스트림은 PEG-4 암-말레이미드 또는 PEG-4-Mal로 구성되고, 코어 스트림과 함께 두 개의 연속적인 오일 접합부를 향해 흘렀다. 액적 형성은 첫 번째 오일 접합부에서 발생했으며 쉘 용액은 코어 주위를 감싸고 있습니다. 쉘의 화학적 가교결합은 이들 액적에 디티올 가교결합제(1,4-디티오트레이톨 또는 DTT)를 도입함으로써 제2 오일 접합부에서 발생하였다. 가교제는 클릭 화학을 통해 말레이미드 작용기와 반응하여 마이크로 캡슐 주위에 하이드로겔 쉘을 형성합니다. 당사의 캡슐화 기술은 초당 10 캡슐의 속도로 직경 400 μm 캡슐을 생산했습니다. 결과 캡슐에는 하이드로겔 쉘과 수성 코어가있어 단일 세포가 응집체로 빠르게 조립되어 구상체를 형성 할 수있었습니다. 캡슐화 과정은 hPSCs의 생존력에 악영향을 미치지 않았으며, 캡슐화 후 3 일 동안 관찰 된 >95 %의 생존력으로 나타났습니다. 비교를 위해, (수성 코어 없이) 고체 겔 미세입자로 캡슐화된 hPSCs는 구상체를 형성하지 않았고, 캡슐화 3일 후에 <50%의 생존력을 가졌다. 코어-쉘 마이크로캡슐 내부의 hPSCs의 스페로이드 형성은 캡슐화 후 48시간 이내에 발생했으며, 스페로이드 직경은 세포 접종 밀도의 함수이다. 전반적으로, 이 프로토콜에 기술된 미세유체 캡슐화 기술은 hPSCs 캡슐화 및 스페로이드 형성에 매우 적합하였다.

상기 언급된 프로토콜에 따라, 리더는 미세유체 장치를 제조하고 세포 운반 마이크로캡슐을 생산할 수 있을 것이다. 도 3A는 마이크로유체 액적 생성을 사용하여 제조된 최적 및 차선책의 마이크로캡슐의 예를 도시한다. PEG-4-Mal의 상이한 제형은 다양한 형태의 캡슐을 초래하였다 - 주름진 캡슐은 불량한 겔화, 낮은 기계적 완전성과 관련되었고, 교반된 생물반응기에서의 배?...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.

인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

이 영역은 개선된 다능성 및 분화 가능성으로 인해 인간 다능성 줄기 세포의 3D 배양에 대한 관심으로 간주되며, 이러한 배양물이 형성되었다. 우리는 인간 다능성 줄기 세포 구상체의 재현 가능한 형성으로 이어지는 캡슐화 전략을 설명했습니다. 일단 캡슐화되면,이 줄기 세포 구상체는 다중 웰 플레이트 또는 교반 된 생물 반응기에서 재배 할 수 있습니다.우리의 캡슐화 전략은 역병 생존 가능성과 스페로이드 형성의 높은 효율성을 최적화합니다. 캡슐화된 구상체는 교반 또는 흔들림과 관련된 전단 또는 기계적 에너지로부터 보호됩니다. 줄기 세포 유래 세포 요법의 개발은 부분적으로 확장 가능하고 효율적이며 비용 효율적인 방식으로 원하는 세포 생성물을 생성하는 능력에 달려 있다.여기에 설명된 캡슐화 기술은 이러한 방향으로 나아가는 단계를 나타냅니다. 여기에 설명된 캡슐화 기술은 아마도 다른 세포로부터 다른 만능 줄기 세포에 이르기까지 다양한 세포 유형의 3D 배양에 적용될 것이다. 먼저 35 킬로달톤 PEG 4.8 그램, 밀도 구배 매체 10.2 밀리리터 및 DMEM / F-12 배지 19.8 밀리리터를 혼합하여 2 배 코어 원액 30 밀리리터를 준비하십시오.그런 다음 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 사용하여 이 코어 용액을 여과한다. 다음으로, 48.5 밀리리터의 미네랄 오일과 1.5 밀리리터의 계면활성제를 혼합하여 3 % 계면 활성제로 50 밀리리터의 미네랄 오일을 준비하십시오. 그런 다음 용액을 0.22 마이크로미터 시린지 필터를 통과시켜 멸균한다.다음으로, 텍스트 원고에 설명된 대로 1몰 DTT, 1몰 TEA 및 1% PF127 용액을 준비한다. 그런 다음 4.5 밀리리터의 광유와 3 % 계면활성제 및 300 마이크로리터의 1 몰 DTT를 혼합하여 가교제 에멀젼을 제조하였다. 용액을 2 분 동안 볼텍싱 한 후 섭씨 20 도의 초음파 욕조에서 45 ~ 60 분 동안 초음파 처리하고 27 게이지 바늘이있는 5 밀리리터 주사기에 로딩하십시오.다음으로, 0.5 % 계면 활성제를 가진 광유를 27 게이지 바늘이있는 5 밀리리터 주사기에 로딩하여 차폐 오일 용액을 준비하십시오. 쉘 용액을 제조하기 위해, 400 마이크로리터의 DPBS에 32 밀리그램의 PEG4 말레이미드를 첨가한다. 그런 다음 1 몰 TEA 6 마이크로 리터를 첨가하십시오.용액을 2분 동안 볼텍스하고 스핀 필터를 통해 원심분리한다. 용액을 로커의 어둠 속에 30 분 동안 보관한 다음 27 게이지 바늘이있는 1 밀리리터 주사기에 적재하십시오. 마지막으로, 200 마이크로 리터 매체에 20 백만 hPSC를 재현탁하고 1 % PF127 및 200 마이크로 리터의 2X 코어 용액 30 마이크로 리터와 혼합하여 최종 코어 용액을 준비하십시오.작은 교반기 막대를 1 밀리리터 주사기에 넣으십시오. 이어서, 코어 용액을 함유하는 세포를 27 게이지 바늘로 주사기에 로딩한다. 먼저 멸균을 위해 접합된 PDMS 액적 장치, 길이 20센티미터 4개, 길이 5센티미터 입구 마이크로튜브 1개, 10센티미터 출구 튜브 1개 및 0.5센티미터 피팅 튜브 6개를 살균 광원 아래에 30분 동안 배치하여 시작합니다.이제 포셉을 사용하여 20cm 길이의 입구 마이크로 튜브 4 개를 쉘, 오일, 가교 에멀젼 및 해리 장치 입구에 맞 춥니 다. 그런 다음 튜브의 반대쪽 끝을 해당 용액으로 주사기 바늘에 삽입하십시오. 한편, 미세 유체 장치 코어 입구와 해리 장치 출구를 5 센티미터 마이크로 튜브로 연결하십시오.1개의 출구 튜브를 유체 배출구 포트에 삽입하고 반대쪽 끝을 수집 저장소에 넣습니다. 그런 다음 장치를 현미경 스테이지에 놓고 튜브를 부착하여 움직이지 않도록하십시오. 유량 검사를 위해 현미경을 장치 노즐에 맞추고 초점을 맞춥니다.각 주사기를 다른 주사기 펌프에 놓고 제대로 고정하십시오. 각 펌프를 제조업체의 프로토콜에 따라 텍스트 원고에 언급 된 유량에 따라 프로그래밍하고 모든 펌프에서 흐름을 시작하십시오. 각 유체가 장치에 들어갈 때까지 기다렸다가 나머지 공기를 밀어내는 동안 채널을 채 웁니다.캡슐 형성이 안정화되면 수집 튜브의 반대쪽 끝을 5 밀리리터의 mTeSR 배지가 들어있는 새로운 원뿔형 튜브에 넣으십시오. 충분한 캡슐이 수집되면 10 분 동안 배양하십시오. 유상에 상주하는 캡슐은 튜브의 상단에 있으며, 튜브를 부드럽게 두드리면 바닥으로 퇴적됩니다.캡슐을 회수하려면 먼저 수집 튜브에서 오일을 제거하십시오. 이어서, 캡슐을 100 마이크로미터 공극 크기의 세포 스트레이너 상에 놓고, 풍부한 양의 배지로 스트레이너를 세척한다. 6-웰 배양 플레이트의 웰 위에 있는 필터를 반전시키고, 필터를 통해 2밀리리터의 배지를 통과시켜 마이크로캡슐을 수집한다.줄기 세포 캡슐을 섭씨 37도의 6-웰 배양 접시에 5 % 이산화탄소로 배양하십시오. 세포 스트레이너 필터에 캡슐을 모으고 과도한 배지로 세척한 다음 2밀리리터 배지가 있는 6웰 플레이트의 새로운 웰에 다시 매달아 배지를 격일로 교체합니다. 2 마이크로몰의 에티듐 호모디머-1 및 4 마이크로몰의 칼세인-AM 용액 1 마이크로리터를 2 밀리리터의 멸균 DPBS에 첨가함으로써 생존성 검정을 수행한다.완벽한 혼합을 보장하는 소용돌이. 세포 스트레이너에 약 100 개의 마이크로 캡슐을 모으고 멸균 DPBS로 헹구어 캡슐에서 배지가 확산 될 수 있도록하십시오. 이들을 다시 12-웰 배양 플레이트에서 수집하여 에티듐 호모디머-1 및 칼세인 AM을 함유하는 제조된 용액 1 밀리리터를 사용하여 섭씨 37도에서 20분 동안 인큐베이션한다.세포를 형광 현미경으로 시각화합니다. 미세유체 액적 생성을 사용하여 제조된 최적 및 차선책의 마이크로캡슐은 쉘 내의 PEG4-말레이미드 함량의 함수로서 캡슐 형태학의 차이를 보였다. 밝은 가장자리를 가진 부드러운 캡슐은 원하는 기계적 무결성과 관련이 있습니다.캡슐의 중앙에 비드가 응집되어 코어가 수성이고 비드가 자유롭게 움직일 수 있음을 나타냅니다. 형광 환부는 하이드로겔 쉘의 존재를 나타내었고 쉘 두께를 결정하기 위해 사용되었다. H9 세포를 캡슐화한 후 6시간 후에 생사 또는 사신 염색은 세포가 캡슐화 실행 동안 일상적으로 95% 이상의 생존력을 달성한다는 것을 보여주었다.캡슐화된 구상체 대 캡슐화되지 않은 구상체의 성장 속도 및 분화 잠재력을 비교한 경우. 캡슐화 과정이 hPSCs에 악영향을 미치지 않는 것으로 결정되었다. 코어 쉘과 오일 스트림 사이의 최적의 유량 비율을 설정하는 것이 중요하다는 것을 기억하십시오.이렇게 하지 않으면 캡슐이 기계적으로 강하지 않고 취급 중에 파열될 수 있습니다. 우리는이 캡슐화 기술이 인간 다능성 줄기 세포 이외의 세포 유형을위한 것임을 지적하고자합니다. 우리는 유사한 전략을 사용하여 주로 가설화 된 암 세포주와 중간엽 줄기 세포를 캡슐화했습니다.현재 우리 팀은 차세대 마이크로 캡처를 개발 중입니다. 이들 마이크로포획은 생체활성이며 줄기 세포의 캡슐화된 분화를 위한 교차 인자로 로딩될 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3D 종이 미세 유체 장치를 구축하기 위해 접착제 패터닝을 사용하여

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

폴 리 비닐 알코올-Co-Itaconic 산 Hydrogels 이종 없는 조건 하에서 다양 한 강성에 인간의 Pluripotent 줄기 세포 문화

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

관 구조의 조직 공학을 위한 코어/쉘 인쇄 비계

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

정지 인간 조혈 줄기 세포를 유지하는 배양 방법

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...