Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Denne studien ble delvis støttet av tilskuddene fra Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) og NIH (DK107255).

1. Fabrikasjon av enheter
<ol><li>Lag designene for mikroinnkapslingsenheten og dissosiasjonsenheten ved hjelp av CAD-programvare10,11.</li>
	<li>Spin-coat de tre lagene av SU-8 fotoresist sekvensielt på en silisiumskive (figur 2A) for å oppnå strukturer med ønsket høyde: 60, 100 og 150 μm. MERK: Prosessen for topp- og bunnformer er identisk.<ol>
<li>Spinn frakk en ren 10 cm silisiumskive med SU-8 2025 negativ fotoresist v...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Innkapslingsprosessen som er beskrevet her, resulterer i reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider. Mikrokapselformatet gjør det enkelt å dispensere sfæroider i brønner på en mikrotiterplate for eksperimenter som tar sikte på å forbedre / optimalisere differensieringsprotokoller eller testterapier. Innkapslede stamcellesfæroider kan også brukes i suspensjonskulturer der hydrogelskall beskytter celler mot skjærindusert skade7.
Det er flere kritiske trinn i prot...

Det er stor interesse for 3D-kulturer av menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) på grunn av forbedret pluripotens og differensieringspotensial gitt av dette kulturformatet 1,2,3. hPSCer dannes vanligvis til sfæroider eller andre 3D-kulturformater ved hjelp av bioreaktorer, mikrowells, hydrogeler og polymere stillaser 4,5,6. Innkapsling tilbyr et annet middel for å organisere enkle hPSCer i sfæroider. Når innkapslede hPSC sfæroider kan håndteres med letthett og overføres til mikrotiterplater for differensiering, sykdomsmodellering eller narkotikatesting eksperimenter. Innkapslet hPSCs i et hydrogellag beskytter også celler mot skjærskader og gjør det mulig å dyrke sfæroider i en bioreaktor ved høye omrøringshastigheter7.
Vår metodikk for stamcelleinnkapsling utviklet seg over tid. For det første fokuserte vi på faste hydrogelmikropartikler og demonstrerte vellykket innkapsling og dyrking av museembrenne stamceller (mESCs)8. Det ble imidlertid bemerket at humane embryonale stamceller (hESCs) hadde lav levedyktighet når de ble innkapslet i slike hydrogelmikropartikler, antagelig på grunn av større behov for at disse cellene gjenoppretter cellecellekontakter etter innkapslingen. Vi begrunnet det med at heterogen mikrokapsel, som har en vandig kjerne, kan være bedre egnet for innkapsling av celler som er avhengige av rask reetablering av cellecellekontakter. Konseptet med koaksial strømningsfokusering av mikrofluidisk enhet for å lage vandige mikrokapsler av kjerne/hydrogelskall ble tilpasset fra He et al.9, men i stedet for alginat ansatt i den opprinnelige tilnærmingen, ble en PEG-basert hydrogel innlemmet i skallet. Vi viste først vellykket innkapsling og sfæroiddannelse av primær hepatocytt i kjerneskallmikrokapsler10 og sist beskrevet innkapsling av hES- og iPS-celler7. Som beskrevet i figur 1A, fremstilles kapsler i en strømningsfokuseringsenhet der skall- og kjernestrømstrømmene går fra side til side til koaksial strømning før utkast til oljefasen. Kjernestrømmen inneholder celler og tilsetningsstoffer som øker viskositeten til løsningen (ikke-reaktiv PEG MW 35kD og iodixanol - kommersielt navn OptiPrep) mens skallstrømmen inneholder reaktive molekyler (PEG-4-Mal). Kontinuerlig koaksial strømningsstrøm er atskilt i dråper som beholder kjerneskallarkitektur. Kjerneskallstrukturen gjøres permanent ved eksponering for di-tiol crosslinker (DTT), som reagerer med PEG-4-Mal via klikkkjemi og resulterer i dannelse av en tynn (~ 10 μm) hydrogelhud eller skall. Etter at emulsjonen er brutt og kapsler overføres til en vandig fase, diffuse molekyler av PEG fra kjernen og erstattes av vannmolekyler. Dette resulterer i vandig kjerne og hydrogel skall mikrokapsler.
Nedenfor finner du trinnvise instruksjoner om hvordan du lager mikrofluidiske enheter, hvordan du klargjør celler og hvordan du utfører innkapsling av hPSCer.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Tredimensjonale (3D) eller sfæroidkulturer av humane pluripotente stamceller (hPSCer) gir fordelene med forbedrede differensieringsresultater og skalerbarhet. I dette dokumentet beskriver vi en strategi for robust og reproduserbar dannelse av hPSC-sfæroider der en koaksial strømningsfokuseringsenhet brukes til å fange hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall. Kjerneløsningen inneholdt encellet suspensjon av hPSCer og ble gjort viskøst ved inkorporering av høymolekylær poly (etylenglykol) (PEG) og tetthet gradient media. Skallstrømmen består av PEG-4 arm-maleimid eller PEG-4-Mal og strømmet sammen med kjernestrømmen mot to påfølgende oljekryss. Dråpeformasjonen skjedde ved det første oljekrysset med skallløsning som pakket seg rundt kjernen. Kjemisk krysskobling av skallet skjedde ved det andre oljekrysset ved å introdusere en di-tiol crosslinker (1,4-dithiothreitol eller DTT) til disse dråpene. Crosslinker reagerer med maleimid funksjonelle grupper via klikkkjemi, noe som resulterer i dannelsen av et hydrogelskall rundt mikrokapsler. Vår innkapslingsteknologi produserte kapsler med 400 μm diameter med en hastighet på 10 kapsler per sekund. De resulterende kapslene hadde et hydrogelskall og en vandig kjerne som gjorde det mulig for enkeltceller å raskt montere seg i aggregater og danne sfæroider. Innkapslingsprosessen påvirket ikke levedyktigheten til hPSCer negativt, med >95% levedyktighet observert 3 dager etter innkapsling. Til sammenligning dannet hPSCs innkapslet i faste gelmikropartikler (uten en vandig kjerne) ikke sfæroider og hadde <50% levedyktighet 3 dager etter innkapsling. Sfæroiddannelse av hPSCer inne i mikrokapsler av kjerneskall oppstod innen 48 timer etter innkapsling, med sfæroiddiameteren som en funksjon av celleinokuleringstetthet. Samlet sett var den mikrofluidiske innkapslingsteknologien beskrevet i denne protokollen godt egnet for hPSCs innkapsling og sfæroiddannelse.

Ved å følge ovennevnte protokoll vil leseren kunne fremstille mikrofluidiske enheter og produsere cellebærende mikrokapsler. Figur 3A viser eksempler på optimale og suboptimale mikrokapsler fremstilt ved hjelp av mikrofluid dråpegenerering. Ulike formuleringer av PEG-4-Mal resulterte i kapsler med varierende morfologier - rynkete kapsler var forbundet med dårlig gelering, lav mekanisk integritet, og motsto ikke dyrking i en rørt bioreaktor. Glatte kapsler observert ved PEG-innhold av ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Denne artikkelen beskriver innkapsling av humane pluripotente stamceller (hPSCer) ved hjelp av en koaksial strømningsfokuseringsenhet. Vi viser at denne mikrofluidiske innkapslingsteknologien muliggjør effektiv dannelse av hPSC-sfæroider.

Mikrofluidisk fabrikasjon av kjerneskallmikrokapsler som bærer humane pluripotente stamcellesfæroider

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Området regnes som en interesse for 3D-kulturer av menneskelige pluripotente stamceller på grunn av forbedret pluripotens og differensieringspotensial denne kulturen dannet. Vi beskrev vår innkapslingsstrategi som fører til reproduserbar dannelse av humane pluripotente stamceller sfæroider. Når de er innkapslet, er disse stamcellesfæroidene egnet til dyrking, enten i multi-brønnplater eller rørte bioreaktorer.Vår innkapslingsstrategi er å optimalisere pestilence overlevelsesevne og høy effektivitet av sfæroiddannelse. Innkapslede sfæroider er beskyttet mot skjær eller mekanisk energi forbundet med omrøring eller gynging. Utvikling av stamceller avledet cellulær terapi avhenger delvis av evnen til å generere ønsket cellulært produkt på en skalerbar, effektiv og kostnadseffektiv måte.Innkapslingsteknologien som er beskrevet her, representerer et skritt i denne retningen. Innkapslingsteknologien som er beskrevet her, vil sannsynligvis gjelde for 3D-dyrking av ulike celletyper fra andre celler til andre pluripotente stamceller. Begynn med å forberede 30 milliliter to ganger kjernebestandsløsning ved å blande 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 milliliter tetthetsgradientmedier og 19,8 milliliter DMEM / F-12 media.Filtrer deretter denne kjerneløsningen ved hjelp av et 0,22 mikrometer sprøytefilter. Deretter forbereder du 50 milliliter mineralolje med 3 prosent overflateaktivt middel ved å blande 48,5 milliliter mineralolje og 1,5 milliliter overflateaktivt middel. Steriliser deretter oppløsningen ved å sende den gjennom et 0,22 mikrometer sprøytefilter.Deretter forbereder du 1 molar DTT, 1 molar TEA og 1 prosent PF127 løsninger, som beskrevet i tekstmanuskriptet. Lag deretter en krysskoblingsemulsjon ved å blande 4,5 milliliter mineralolje med 3 prosent overflateaktivt middel og 300 mikroliter 1 molar DTT. Etter å ha vortexing løsningen i to minutter, soniker i 45 til 60 minutter i et ultralydbad ved 20 grader Celsius og last den til en 5 milliliter sprøyte med en 27 gauge nål.Deretter forbereder du dekkoljeløsningen ved å laste mineraloljen med 0,5 prosent overflateaktivt middel inn i en 5 milliliter sprøyte med en 27 gauge nål. For å forberede skallløsningen, tilsett 32 milligram PEG4 maleimid i 400 mikroliter DPBS. Tilsett deretter 6 mikroliter 1 molar TEA.Virvel løsningen i 2 minutter og sentrifuger den gjennom et spinnfilter. Oppbevar oppløsningen i mørket på vippen i 30 minutter før den lastes inn i en 1 milliliter sprøyte med en 27 gauge nål. Til slutt, forbered den endelige kjerneløsningen ved å suspendere 20 millioner hPSCer i 200 mikrolitermedier og bland med 30 mikroliter 1 prosent PF127 og 200 mikroliter 2X kjerneløsning.Sett en liten rørestang inn i en 1 milliliter sprøyte. Last deretter cellen som inneholder kjerneoppløsningen inn i sprøyten med en 27 gauge nål. Begynn med å plassere den limte PDMS-dråpeenheten, 4 stykker 20 centimeter lang og 1 stykke 5 centimeter lange innløpsmikrorør, 1 stykke 10 centimeter utløpsrør og 6 stykker 0,5 centimeter monteringsrør under den bakteriedrepende lyskilden i 30 minutter for sterilisering.Monter nå de 4 delene av 20 centimeter lange innløpsmikrorør i skallet, oljen, krysskoblingsemulsjonen og dissosiasjonsenhetsinntakene ved hjelp av tang. Sett deretter motsatt ende av rørene inn i sprøytenålen med den tilsvarende løsningen. I mellomtiden kobler du kjerneinntaket for mikrofluidiske enheter og dissosiasjonsenhetene med et 5 centimeter mikrorør.Sett 1 utløpsrør inn i den fluidiske utløpsporten og plasser den motsatte enden i et oppsamlingsreservoar. Plasser deretter enheten på et mikroskopstadium og fest slangen for å unngå bevegelse. Juster og fokuser mikroskopet på enhetsdysen for strømningsinspeksjon.Plasser hver sprøyte på forskjellige sprøytepumper og fest den ordentlig. Programmer hver pumpe i henhold til produsentens protokoller til strømningshastighetene som er nevnt i tekstmanuskriptet, og start strømmen i alle pumpene. Vent til hver væske kommer inn i enheten og fyll opp kanalene mens du skyver ut gjenværende luft.Når kapselformasjonen er stabilisert, plasser den motsatte enden av oppsamlingsrøret i et nytt konisk rør som inneholder 5 milliliter mTeSR-medier. Når nok kapsler er samlet, inkuber dem i 10 minutter. Kapslene som ligger i oljefasen vil være på toppen av røret, som sedimenterer til bunnen ved forsiktig å banke på røret.For å hente kapslene, begynn med å fjerne olje fra oppsamlingsrøret. Plasser deretter kapslene på en 100 mikrometer pore størrelse cellesil og vask silen med store mengder medier. Snu filteret på toppen av en brønn av en 6-brønns kulturplate og samle mikrokapsler ved å passere 2 milliliter medier gjennom filteret.Inkuber stamcellekapsler i en 6-brønns kulturrett ved 37 grader Celsius med 5 prosent karbondioksid. Bytt media annenhver dag ved å samle kapslene på et cellesilfilter, vaske dem med overflødige medier og suspendere dem til en ny brønn i 6-brønnsplater med 2 millilitermedier. Utfør levedyktighetsanalyse ved å tilsette 4 mikroliter av 2 mikromolar Ethidium Homodimer-1 og 1 mikroliter av de 4 mikromolar Calcein-AM-løsningene til 2 milliliter sterile DPBS.Virvel for å sikre fullstendig blanding. Samle ca. 100 mikrokapsler på en cellesil og skyll dem med steril DPBS for å tillate middels diffusjon ut fra kapslene. Samle dem igjen i en 12-brønns kulturplate ved hjelp av 1 milliliter av den tilberedte løsningen som inneholder Ethidium Homodimer-1 og calcein AM og inkuber ved 37 grader Celsius i 20 minutter.Visualiser cellene under et fluorescensmikroskop. De optimale og suboptimale mikrokapsler fremstilt ved hjelp av mikrofluidisk dråpegenerering viste forskjeller i kapselmorfologi som en funksjon av PEG4-Maleimide innhold i skallet. Glatte kapsler med lyse kanter er forbundet med ønsket mekanisk integritet.Aggregering av perler i midten av kapslene indikerer at kjernen var vandig og perlene var frie til å bevege seg rundt. Den fluorescerende annulus indikerte tilstedeværelsen av et hydrogelskall og ble brukt til å bestemme skalltykkelsen. Levende eller døde flekker 6 timer etter innkapsling av H9-celler viste at cellene oppnådde mer enn 95 prosent levedyktighet rutinemessig under innkapslingen.Ved sammenligning av vekstrate og differensieringspotensial for innkapslede kontra uinnkapslede sfæroider. Det ble fastslått at innkapslingsprosessen ikke har noen negative effekter på hPSCer. Husk at det er viktig å etablere optimalt strømningshastighetsforhold mellom kjerneskallet og oljestrømmene.Hvis du ikke gjør dette, kan det føre til kapsler som ikke vil være mekanisk sterke og kan sprekke under håndtering. Vi vil påpeke at denne innkapslingsteknikken var for andre celletyper enn humane pluripotente stamceller. Vi har innkapslet, først og fremst hypoteset, kreftcellelinjer og mesenchymale stamceller ved hjelp av en lignende strategi.For tiden utvikler teamet vårt neste generasjon mikrokapsler. Disse mikrokapslene er bioaktive og kan lastes med kryssfaktorer for innkapslet differensiering av stamceller.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Utvikling, utvidelse, og<em&gt; In vivo</em&gt; Overvåking of Human NK-celler fra humane embryonale stamceller (hESCs) og og Induced pluripotent stamceller (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplantasjon av indusert pluripotent stamcelle-avledet Mesoangioblast-lignende myogene forfedre i musemodeller av muskelregenerering

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

Microfluidic pikoliter bioreaktor for Microbial Encellede Analyse: Fabrikasjon, System Setup, og drift

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Ved hjelp av lim Mønstring å konstruere 3D Paper microfluidic enheter

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Menneskelige Pluripotent stamceller kultur på polyvinylacetat alkohol-Co-Itaconic syre Hydrogels med varierende stivhet Under Xeno-gratis forhold

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Core/Shell Printing stillaser for vev engineering av rørformede strukturer

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Enkeltcellet optisk virkningspotensial måling i humane induserte pluripotente stamcelleavledede kardiomyocytter

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

En kulturmetode for å opprettholde quiescent humane hematopoietiske stamceller

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...