Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Este estudo foi apoiado em parte pelas bolsas do Mayo Clinic Center for Regenerative Medicine, J. W. Kieckhefer Foundation, Al Nahyan Foundation, Regenerative Medicine Minnesota (RMM 101617 TR 004) e NIH (DK107255).

1. Fabricação de dispositivos
<ol><li>Faça os projetos para o dispositivo de microencapsulação e dispositivo de dissociação usando o software CAD10,11.</li>
	<li>Gire as três camadas de fotoresist SU-8 sequencialmente em um wafer de silício (Figura 2A) para alcançar estruturas com as alturas desejadas: 60, 100 e 150 μm. NOTA: O processo para os moldes superior e inferior é idêntico.<ol>
<li>Gire um wafer de silício...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

O processo de encapsulamento descrito aqui resulta na formação reprodutível de esferoides hPSC. O formato de microcápsula facilita a distribuição de esferoides em poços de uma placa de microtítiter para experimentos que visam melhorar/otimizar protocolos de diferenciação ou testar terapias. Esferoides de células-tronco encapsuladas também podem ser usados em culturas de suspensões onde a concha de hidrogel protege as células contra danos induzidos por tesoura7.
<p class="jove_con...

Há um interesse considerável nas culturas 3D das células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação proporcionada por esse formato de cultura 1,2,3. hPSCs são tipicamente formados em esferoides ou outros formatos de cultura 3D por meio de bioreatores, microwells, hidrogéis e andaimes poliméricos 4,5,6. Encapsulamento oferece outro meio para organizar hPSCs únicos em esferoides. Uma vez encapsulados spheroids hPSC podem ser tratados com facilidade e transferidos para placas de microtiter para diferenciação, modelagem de doenças ou experimentos de teste de drogas. Encostendo hPSCs em uma camada de hidrogel também protege as células contra danos à tesoura e permite cultivar esferoides em um bioreator a altas taxas de agitação7.
Nossa metodologia de encapsulamento de células-tronco evoluiu ao longo do tempo. Primeiro, focamos em micropartículas de hidrogel sólido e demonstramos o sucesso do encapsulamento e cultivo de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs)8. No entanto, observou-se que as células-tronco embrionárias humanas (hESCs) tinham baixa viabilidade quando encapsuladas em tais micropartículas de hidrogel, presumivelmente devido à maior necessidade dessas células de restabelecer contatos celulares após o encapsulamento. Argumentamos que a microcápsula heterogênea, possuindo um núcleo aquoso, pode ser mais adequada para o encapsulamento de células que dependem do rápido restaneamento de contatos celulares. O conceito de fluxo coaxial com foco de dispositivo microfluido para fazer microcápsulas de conchas de núcleo/hidrogel aquosos foi adaptado a partir de He et al.9, mas em vez de alginato empregado na abordagem original, um hidrogel à base de PEG foi incorporado à concha. Primeiro demonstramos encapsulamento bem sucedido e formação esferoide de hepatócito primário em microcápsulas de conchas núcleo10 e mais recentemente descreveu o encapsulamento das células hES e iPS7. Conforme descrito na Figura 1A, as cápsulas são fabricadas em um dispositivo de focalizar o fluxo onde os fluxos de fluxo da concha e do núcleo transitam de fluxo lateral para o coaxial antes da ejeção para a fase do óleo. O fluxo do núcleo contém células e aditivos que aumentam a viscosidade da solução (PEG MW 35kD não reativo e iodixanol - nome comercial OptiPrep), enquanto o fluxo de conchas contém moléculas reativas (PEG-4-Mal). O fluxo de fluxo coaxial contínuo é discretizado em gotículas que retêm a arquitetura de conchas de núcleo. A estrutura do núcleo-shell é permanente pela exposição ao di-thiol crosslinker (DTT), que reage com PEG-4-Mal via química de clique e resulta na formação de uma fina (~10 μm) pele ou concha de hidrogel. Depois que a emulsão é quebrada e as cápsulas são transferidas para uma fase aquosa, moléculas de PEG se difundem do núcleo e são substituídas por moléculas de água. Isso resulta em microcápsulas aquosas do núcleo e da concha de hidrogel.
Fornecidos abaixo estão instruções passo a passo sobre como fazer dispositivos microfluidos, como preparar células e como realizar o encapsulamento de hPSCs.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Culturas tridimensionais (3D) ou esferoides de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) oferecem os benefícios de melhores resultados de diferenciação e escalabilidade. Neste artigo, descrevemos uma estratégia para a formação robusta e reprodutível de esferoides hPSC onde um dispositivo de foco de fluxo coaxial é utilizado para prender hPSCs dentro de microcápsulas de conchas centrais. A solução central continha suspensão celular única de hPSCs e foi feita viscosa pela incorporação de poli de alto peso molecular (etileno glicol) (PEG) e mídia gradiente de densidade. O fluxo de conchas era composto por PEG-4 arm-maleimide ou PEG-4-Mal e fluiu ao lado do fluxo central em direção a duas junções de óleo consecutivas. A formação de gotículas ocorreu na primeira junção de óleo com a solução shell envolvendo-se em torno do núcleo. A interligação química da casca ocorreu na segunda junção de óleo introduzindo um crosslinker di-thiol (1,4-dithiothreitol ou DTT) nessas gotículas. O crosslinker reage com grupos funcionais de maleimiide via química de clique, resultando na formação de uma concha de hidrogel ao redor das microcápsulas. Nossa tecnologia de encapsulamento produziu cápsulas de 400 μm de diâmetro a uma taxa de 10 cápsulas por segundo. As cápsulas resultantes tinham uma concha de hidrogel e um núcleo aquoso que permitia que células únicas se reunissem rapidamente em agregados e formassem esferoides. O processo de encapsulamento não afetou negativamente a viabilidade dos hPSCs, com viabilidade >95% observada 3 dias após o encapsulamento. Para comparação, os hPSCs encapsulados em micropartículas de gel sólido (sem núcleo aquoso) não formavam esferoides e tinham <50% de viabilidade 3 dias após o encapsulamento. A formação esferoide de hPSCs dentro de microcápsulas de conchas núcleo ocorreu dentro de 48 h após o encapsulamento, com o diâmetro esferoide sendo uma função da densidade de inoculação celular. No geral, a tecnologia de encapsulamento microfluido descrita neste protocolo foi adequada para encapsulamento de hPSCs e formação de esferoides.

Seguindo o protocolo acima mencionado, o leitor poderá fabricar dispositivos microfluidos e produzir microcápsulas portadoras de células. A Figura 3A mostra exemplos de microcápsulas ótimas e subótimas fabricadas usando geração de gotículas microfluídicas. Diferentes formulações de PEG-4-Mal resultaram em cápsulas de morfologias variadas - cápsulas enrugadas estavam associadas à má gelação, baixa integridade mecânica e não resistivam ao cultivo em um bioreator mexido. Cá...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Este artigo descreve o encapsulamento de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) usando um dispositivo de foco de fluxo coaxial. Demonstramos que essa tecnologia de encapsulamento microfluido permite a formação eficiente de esferoides hPSC.

Fabricação microfluida de microcápsulas core-shell carregando esferoides de células-tronco pluripotentes humanas

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

A área é considerada de interesse em culturas 3D de células-tronco pluripotentes humanas devido à melhoria da pluripotência e potencial de diferenciação que essa cultura formou. Descrevemos nossa estratégia de encapsulamento que leva à formação reprodutível de células-tronco pluripotentes humanas esferoides. Uma vez encapsulados, esses esferoides de células-tronco são favoráveis ao cultivo, seja em placas multi-poços ou bioreatores mexidos.Nossa estratégia de encapsulamento é otimizar a sobrevivência da peste e a alta eficiência da formação de esferoides. Os esferoides encapsulados são protegidos contra tesouras ou energia mecânica associada à agitação ou balança. O desenvolvimento de células-tronco derivadas da terapia celular depende, em parte, da capacidade de gerar o produto celular desejado de forma escalável, eficiente e econômica.A tecnologia de encapsulamento descrita aqui representa um passo nessa direção. A tecnologia de encapsulamento descrita aqui provavelmente será aplicável ao cultivo 3D de vários tipos de células de outras células para outras células-tronco pluripotentes. Comece preparando 30 mililitros de duas vezes a solução de estoque núcleo misturando 4,8 gramas de 35 kilodalton PEG, 10,2 mililitros de mídia gradiente de densidade e 19,8 mililitros de mídia DMEM/F-12.Em seguida, filtre esta solução principal usando um filtro de seringa de 0,22 micrômetros. Em seguida, prepare 50 mililitros de óleo mineral com 3% de surfactante, misturando 48,5 mililitros de óleo mineral e 1,5 mililitros de surfactante. Em seguida, esterilize a solução passando-a através de um filtro de seringa de 0,22 micrômetros.Em seguida, prepare 1 molar DTT, 1 MOLAR TEA e 1% de soluções PF127, conforme descrito no manuscrito do texto. Em seguida, prepare uma emulsão de ligação cruzada misturando 4,5 mililitros de óleo mineral com 3% de surfactante e 300 microliters de 1 molar DTT. Depois de vórtice da solução por dois minutos, sonicize por 45 a 60 minutos em um banho ultrassônico a 20 graus Celsius e carregue-a em uma seringa de 5 mililitros com uma agulha calibre 27.Em seguida, prepare a solução de óleo de proteção carregando o óleo mineral com 0,5% de surfactante em uma seringa de 5 mililitros com uma agulha calibre 27. Para preparar a solução shell, adicione 32 miligramas de peg4 maleimídeos em 400 microliters de DPBS. Em seguida, adicione 6 microliters de 1 CHÁ molar.Vortex a solução por 2 minutos e centrifuá-la através de um filtro de giro. Mantenha a solução no escuro no roqueiro por 30 minutos antes de carregar em uma seringa de 1 mililitro com uma agulha calibre 27. Finalmente, prepare a solução final do núcleo, suspendendo 20 milhões de hPSCs em 200 microliters de mídia e misture com 30 microliters de 1% PF127 e 200 microliters de solução núcleo 2X.Insira uma pequena barra de agitador em uma seringa de 1 mililitro. Em seguida, carregue a célula contendo solução central na seringa com uma agulha de calibre 27. Comece colocando o dispositivo de gotícula PDMS ligado, 4 peças de 20 centímetros de comprimento e 1 peça de microtubos de entrada de 5 centímetros de comprimento, 1 pedaço de tubo de saída de 10 centímetros e 6 peças de tubos de 0,5 centímetros de montagem sob a fonte de luz germicidal por 30 minutos para esterilização.Agora, coloque as 4 peças de microtubos de entrada de 20 centímetros de comprimento na concha, óleo, emulsão transversal e entradas de dispositivos de dissociação usando fórceps. Em seguida, insira a extremidade oposta dos tubos na agulha da seringa com a solução correspondente. Enquanto isso, conecte a entrada central dos dispositivos microfluidos e a saída dos dispositivos de dissociação com um microtubo de 5 centímetros.Insira 1 tubo de saída na porta de saída fluida e coloque a extremidade oposta em um reservatório de coleta. Em seguida, coloque o dispositivo em um estágio de microscópio e conecte a tubulação para evitar qualquer movimento. Alinhe e concentre o microscópio no bocal do dispositivo para inspeção de fluxo.Coloque cada seringa em diferentes bombas de seringa e proteja corretamente. Programe cada bomba de acordo com os protocolos do fabricante para as taxas de fluxo mencionadas no manuscrito do texto, e inicie o fluxo em todas as bombas. Aguarde que cada fluido entre no dispositivo e encha os canais enquanto empurra o ar restante.Quando a formação da cápsula estiver estabilizada, coloque a extremidade oposta do tubo de coleta em um novo tubo cônico contendo 5 mililitros de mídia mTeSR. Uma vez coletadas cápsulas suficientes, incuba-as por 10 minutos. As cápsulas que residem na fase do óleo estarão na parte superior do tubo, que sedimenta até o fundo ao tocar suavemente o tubo.Para recuperar as cápsulas, comece removendo o óleo do tubo de coleta. Em seguida, coloque as cápsulas em um coador de células de tamanho de poros de 100 micrômetros e lave o coador com quantidades abundantes de mídia. Inverta o filtro em cima de um poço de uma placa de cultura de 6 poços e colete as microcápsulas passando 2 mililitros de mídia através do filtro.Incubar as cápsulas de células-tronco em um prato de cultura de 6 poços a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono. Mude a mídia a cada dois dias coletando as cápsulas em um filtro de filtro de coador celular, lavando-as com excesso de mídia e reinstando-as para um novo poço em placas de 6 poços com mídia de 2 mililitros. Realize o teste de viabilidade adicionando 4 microlitres dos 2 micromolares Ethidium Homodimer-1 e 1 microliter das 4 soluções micromolar Calcein-AM a 2 mililitros de DPBS estéreis.Vórtice para garantir a mistura completa. Colete aproximadamente 100 microcápsulas em um coador de células e enxágue-as com DPBS estéreis para permitir a difusão média das cápsulas. Colete-os novamente em uma placa de cultura de 12 poços usando 1 mililitro da solução preparada contendo Ethidium Homodimer-1 e calcein AM e incubar a 37 graus Celsius por 20 minutos.Visualize as células sob um microscópio de fluorescência. As microcápsulas ideais e subótimas fabricadas usando a geração de gotículas microfluidas mostraram diferenças na morfologia da cápsula em função do conteúdo PEG4-Maleimide na casca. Cápsulas lisas com bordas brilhantes estão associadas à integridade mecânica desejada.A agregação de contas no centro das cápsulas indica que o núcleo era aquoso e as contas estavam livres para se mover. O anulo fluorescente indicou a presença de uma concha de hidrogel e foi usado para determinar a espessura da casca. Manchas vivas ou mortas 6 horas após encapsular células H9 mostraram que as células alcançaram mais de 95% de viabilidade rotineiramente durante as corridas de encapsulamento.Ao comparar a taxa de crescimento e o potencial de diferenciação dos esferoides encapsulados versus não encapsulados. Foi determinado que o processo de encapsulamento não tem efeitos adversos sobre os hPSCs. Lembre-se, é importante estabelecer uma relação de fluxo ideal entre a camada central e as correntes de óleo.Não fazer isso pode resultar em cápsulas que não serão mecanicamente fortes e podem romper durante o manuseio. Gostaríamos de salientar que esta técnica de encapsulamento era para tipos celulares que não fossem células-tronco pluripotentes humanas. Encapsulamos, principalmente hipóteses, linhas de células cancerígenas, e células-tronco mesenquimais usando uma estratégia semelhante.Atualmente, nossa equipe está desenvolvendo a próxima geração de microcapaturas. Essas microcapaturas são bioativas e podem ser carregadas com fatores cruzados para diferenciação encapsulada de células-tronco.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desenvolvimento, expansão e<em&gt; In vivo</em&gt; Monitorização das células NK humanas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs) e e induziu células-tronco pluripotentes (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Bioengenharia

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Transplante de Progenitores Miogênicos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos em modelos de regeneração muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

Usando Adhesive Padronização Construir 3D de papel microfluídicos

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Cultura de células-tronco pluripotentes humanas em polivinil álcool-Co-itacónico ácido hidrogel com rigidez diferentes condições Xeno-livre

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Núcleo/Shell impressão scaffolds para engenharia de tecidos de estruturas tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Um método cultural para manter células-tronco hematopoiéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...