Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Это исследование было частично поддержано грантами Центра регенеративной медицины клиники Майо, Фонда J. W. Kieckhefer, Фонда Аль Нахайяна, Регенеративной медицины Миннесоты (RMM 101617 TR 004) и NIH (DK107255).

1. Изготовление устройств
<ol><li>Составьте конструкции устройства микроинкапсулирования и устройства диссоциации с помощью программного обеспечения CAD10,11.</li>
	<li>Раскрутите три слоя фоторезиста СУ-8 последовательно на кремниевой пластине (рису...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Описанный здесь процесс инкапсуляции приводит к воспроизводимому образованию сфероидов hPSC. Формат микрокапсул позволяет легко дозировать сфероиды в колодцы микротитровой пластины для экспериментов, направленных на улучшение/оптимизацию протоколов дифференциации или тестирование ...

Существует значительный интерес к 3D-культурам человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) из-за улучшенной плюрипотентности и дифференцировочного потенциала, обеспечиваемого этим форматом культуры 1,2,3. hPSCs обычно формируются в сфероиды или другие форматы 3D-культур с помощью биореакторов, микроэлементов, гидрогелей и полимерных каркасов 4,5,6. Инкапсуляция предлагает еще одно средство для организации отдельных HPSC в сфероиды. После инкапсулирования сфероиды hPSC могут быть легко обработаны и перенесены в микротитрные пластины для дифференцировки, моделирования заболеваний или экспериментов по тестированию лекарств. Пленение гПСК в гидрогелевом слое также защищает клетки от повреждения сдвигом и позволяет культивировать сфероиды в биореакторе при высоких скоростях перемешивания7.
Наша методология инкапсуляции стволовых клеток развивалась с течением времени. Во-первых, мы сосредоточились на твердых микрочастицах гидрогеля и продемонстрировали успешную инкапсуляцию и культивирование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs)8. Однако было отмечено, что эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) имеют низкую жизнеспособность при инкапсуляции в таких микрочастицах гидрогеля, по-видимому, из-за большей необходимости для этих клеток восстанавливать контакты между клетками после инкапсуляции. Мы рассуждали, что гетерогенная микрокапсула, обладающая водным ядром, может лучше подходить для инкапсуляции клеток, которые полагаются на быстрое восстановление клеточных контактов. Концепция коаксиального потока, фокусирующего микрофлюидное устройство для получения микрокапсул водного ядра / гидрогелевой оболочки, была адаптирована из He et al.9, но вместо альгината, используемого в первоначальном подходе, в оболочку был включен гидрогель на основе ПЭГ. Впервые мы продемонстрировали успешную инкапсуляцию и сфероидное образование первичного гепатоцита в микрокапсулахядра-оболочки 10 и совсем недавно описали инкапсуляцию hES и iPS-клеток7. Как показано на фиг.1А, капсулы изготавливаются в устройстве фокусировки потока, где потоки потока оболочки и ядра переходят из стороны в сторону в коаксиальный поток перед выбросом в масляную фазу. Основной поток содержит клетки и добавки, которые увеличивают вязкость раствора (нереакционноспособный ПЭГ MW 35кД и йодиксанол - коммерческое название OptiPrep), в то время как оболочка потока содержит реакционноспособные молекулы (ПЭГ-4-Мал). Непрерывный поток коаксиального потока дискретизируется на капли, которые сохраняют архитектуру ядра-оболочки. Структура ядра-оболочки становится постоянной путем воздействия ди-тиолового сшивателя (DTT), который реагирует с PEG-4-Mal через химию щелчка и приводит к образованию тонкой (~ 10 мкм) гидрогелевой кожи или оболочки. После того, как эмульсия нарушается и капсулы переводятся в водную фазу, молекулы ПЭГ диффундируют из ядра и заменяются молекулами воды. Это приводит к образованию микрокапсул водного ядра и гидрогелевой оболочки.
Ниже приведены пошаговые инструкции о том, как создавать микрофлюидные устройства, как подготовить клетки и как проводить инкапсуляцию гПСК.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Трехмерные (3D) или сфероидные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) предлагают преимущества улучшения результатов дифференцировки и масштабируемости. В этой статье мы описываем стратегию надежного и воспроизводимого образования сфероидов hPSC, где коаксиальное устройство фокусировки потока используется для захвата hPSC внутри микрокапсул ядра-оболочки. Основной раствор содержал одноклеточную суспензию гПСК и становился вязким путем включения высокомолекулярного поли(этиленгликоля) (ПЭГ) и среды градиента плотности. Поток оболочки состоял из ПЭГ-4 арм-малеимида или ПЭГ-4-Мал и протекал вдоль основного потока к двум последовательным нефтяным соединениям. Образование капель происходило при первом масляном соединении с раствором оболочки, обернутым вокруг ядра. Химическое сшивание оболочки происходило на втором масляном переходе путем введения в эти капли ди-тиолового сшивки (1,4-дитиотрейтола или ДТТ). Сшиватель реагирует с функциональными группами малеймидов посредством щелковой химии, в результате чего вокруг микрокапсул образуется гидрогелевая оболочка. Наша технология инкапсуляции производила капсулы диаметром 400 мкм со скоростью 10 капсул в секунду. Полученные капсулы имели гидрогелевую оболочку и водное ядро, которое позволяло отдельным клеткам быстро собираться в агрегаты и образовывать сфероиды. Процесс инкапсуляции не оказывал негативного влияния на жизнеспособность гПСК, при этом >95% жизнеспособность наблюдалась через 3 дня после инкапсуляции. Для сравнения, hPSCs, инкапсулированные в твердые гелевые микрочастицы (без водного ядра), не образовывали сфероидов и имели <50% жизнеспособность через 3 дня после инкапсуляции. Сфероидное образование hPSCs внутри микрокапсул ядра-оболочки происходило в течение 48 ч после инкапсуляции, причем диаметр сфероида был функцией плотности прививки клеток. В целом, технология микрофлюидной инкапсуляции, описанная в этом протоколе, хорошо подходила для инкапсуляции hPSCs и формирования сфероидов.

Следуя вышеупомянутому протоколу, считыватель сможет изготавливать микрофлюидные устройства и производить микрокапсулы, несущие клетки. На рисунке 3А показаны примеры оптимальных и субоптимальных микрокапсул, изготовленных с использованием микрофлюидной генерации ...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

В этой статье описывается инкапсуляция плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) с использованием коаксиального устройства фокусировки потока. Мы демонстрируем, что эта технология микрофлюидной инкапсуляции позволяет эффективно формировать сфероиды hPSC.

Микрофлюидное изготовление микрокапсул Core-Shell, несущих сфероиды плюрипотентных стволовых клеток человека

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Считается, что область представляет интерес к 3D-культурам плюрипотентных стволовых клеток человека из-за улучшенной плюрипотентности и дифференцировочного потенциала, сформированного этой культурой. Мы описали нашу стратегию инкапсуляции, которая приводит к воспроизводимому образованию сфероидов плюрипотентных стволовых клеток человека. После инкапсуляции эти сфероиды стволовых клеток поддаются культивированию, либо в многолуночных пластинах, либо в перемешиваемых биореакторах.Наша стратегия инкапсуляции заключается в оптимизации живучести мора и высокой эффективности образования сфероидов. Инкапсулированные сфероиды защищены от сдвига или механической энергии, связанной с перемешиванием или раскачиванием. Развитие стволовых клеток, полученных при клеточной терапии, частично зависит от способности генерировать желаемый клеточный продукт масштабируемым, эффективным и экономичным способом.Описанная здесь технология инкапсуляции представляет собой шаг в этом направлении. Технология инкапсуляции, описанная здесь, вероятно, будет применима к 3D-культивированию различных типов клеток от других клеток к другим плюрипотентным стволовым клеткам. Начните с приготовления 30 миллилитров двухкратного основного раствора, смешивая 4,8 грамма 35 килодалтон ПЭГ, 10,2 миллилитра среды градиента плотности и 19,8 миллилитра среды DMEM/F-12.Затем отфильтруйте этот основной раствор с помощью шприцевого фильтра длиной 0,22 микрометра. Далее готовят 50 миллилитров минерального масла с 3-процентным поверхностно-активным веществом, смешивая 48,5 миллилитра минерального масла и 1,5 миллилитра поверхностно-активного вещества. Затем стерилизуют раствор, пропуская его через шприцевой фильтр длиной 0,22 микрометра.Затем подготовьте 1 молярный DTT, 1 моляр TEA и 1-процентный раствор PF127, как описано в текстовой рукописи. Затем готовят поперечно-линкерную эмульсию, смешивая 4,5 миллилитра минерального масла с 3-процентным поверхностно-активным веществом и 300 микролитрами 1 молярного ДТТ. После вихревания раствора в течение двух минут обжарьте ультразвуком в течение 45-60 минут в ультразвуковой ванне при температуре 20 градусов Цельсия и загрузите его в шприц длиной 5 миллилитров и иглой 27 калибра.Затем приготовьте защитный масляный раствор, загрузив минеральное масло с 0,5-процентным поверхностно-активным веществом в шприц длиной 5 миллилитров с иглой 27 калибра. Для приготовления раствора оболочки добавляют 32 миллиграмма ПЭГ4 малеимида в 400 микролитра дПБС. Затем добавьте 6 микролитров 1 молярного ЧАЯ.Вращайте раствор в течение 2 минут и центрифугируйте его через спиновый фильтр. Держите раствор в темноте на коромысле в течение 30 минут перед загрузкой в шприц длиной 1 миллилитр с иглой 27 калибра. Наконец, подготовьте окончательное решение ядра путем повторной приостановки 20 миллионов гПСК в среде 200 микролитров и смешайте с 30 микролитрами 1 процента PF127 и 200 микролитрами 2-кратного раствора.Вставьте небольшой стержень мешалки в шприц объемом 1 миллилитр. Затем загрузите ячейку, содержащую основной раствор, в шприц с помощью иглы 27 калибра. Начните с размещения связанного капельного устройства PDMS, 4 куска длиной 20 сантиметров и 1 куска впускных микротрубок длиной 5 сантиметров, 1 куска 10-сантиметровой выходной трубки и 6 штук 0,5-сантиметровых соединительных трубок под бактерицидным источником света в течение 30 минут для стерилизации.Теперь поместите 4 куска входных микротрубок длиной 20 сантиметров в оболочку, масло, эмульсию поперечного линкера и входные отверстия диссоциационного устройства с помощью щипцов. Затем вставьте противоположный конец трубок в шприцевую иглу с соответствующим раствором. Между тем, соедините входное отверстие микрофлюидных устройств и выходное отверстие устройств диссоциации с 5-сантиметровой микропробиркой.Вставьте 1 выходную трубку в выходное отверстие для жидкости и поместите противоположный конец в коллекторный резервуар. Затем поместите устройство на ступень микроскопа и прикрепите трубку, чтобы избежать каких-либо движений. Выровняйте и сфокусируйте микроскоп на сопле прибора для контроля потока.Поместите каждый шприц на разные шприцевые насосы и закрепите их должным образом. Запрограммируйте каждый насос в соответствии с протоколами производителя в соответствии со скоростями потока, упомянутыми в тексте рукописи, и запустите поток во всех насосах. Подождите, пока каждая жидкость войдет в устройство, и заполните каналы, выталкивая оставшийся воздух.Когда образование капсулы стабилизируется, поместите противоположный конец коллекторной трубки в новую коническую трубку, содержащую 5 миллилитров среды mTeSR. Как только будет собрано достаточное количество капсул, высиживайте их в течение 10 минут. Капсулы, находящиеся в масляной фазе, будут находиться в верхней части трубки, которая опускается на дно при осторожном постукивании по трубке.Чтобы извлечь капсулы, начните с удаления масла из коллекционной трубки. Затем поместите капсулы на ситечко размером с поры 100 микрометров и промойте ситечко обильным количеством среды. Инвертируйте фильтр поверх колодца 6-луночной культуральной пластины и соберите микрокапсулы, пропуская через фильтр 2 миллилитра среды.Инкубируйте капсулы стволовых клеток в 6-луночной чашке для культивирования при температуре 37 градусов Цельсия с 5 процентами углекислого газа. Меняйте среду через день, собирая капсулы на фильтре клеточного сетчатого фильтра, промывая их избыточной средой и повторно подвешивая их в новую скважину в 6-луночных пластинах с 2 миллилитрами среды. Проводят анализ жизнеспособности путем добавления 4 микролитров 2 микромолярного гомодимера этидия-1 и 1 микролитра 4 микромоляльных растворов Calcein-AM к 2 миллилитрам стерильных DPBS.Вихрь для обеспечения полного перемешивания. Соберите приблизительно 100 микрокапсул на клеточном ситечке и промойте их стерильным DPBS, чтобы обеспечить диффузию среды из капсул. Соберите их снова в 12-луночную культуральную пластину, используя 1 миллилитр приготовленного раствора, содержащего гомодимер этидия-1 и кальцеин AM, и инкубируйте при 37 градусах Цельсия в течение 20 минут.Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом. Оптимальные и субоптимальные микрокапсулы, изготовленные с использованием генерации микрофлюидных капель, показали различия в морфологии капсул в зависимости от содержания ПЭГ4-малеймида в оболочке. Гладкие капсулы с яркими краями связаны с желаемой механической целостностью.Скопление бусин в центре капсул указывает на то, что ядро было водным и бусины могли свободно передвигаться. Флуоресцентное кольцо указывало на наличие гидрогелевой оболочки и использовалось для определения толщины оболочки. Живые или мертвые окрашивания через 6 часов после инкапсуляции клеток H9 показали, что клетки достигли более 95 процентов жизнеспособности регулярно во время инкапсуляции.При сравнении скорости роста и дифференциационного потенциала инкапсулированных и неинкапсулированных сфероидов. Установлено, что процесс инкапсуляции не оказывает неблагоприятного воздействия на гПСК. Пожалуйста, помните, что важно установить оптимальное соотношение расхода между оболочкой ядра и нефтяными потоками.Невыполнение этого требования может привести к тому, что капсулы не будут механически прочными и могут разорваться во время обработки. Мы хотели бы отметить, что этот метод инкапсуляции был для типов клеток, отличных от человеческих плюрипотентных стволовых клеток. Мы инкапсулировали, в первую очередь гипотетические, линии раковых клеток и мезенхимальные стволовые клетки, используя аналогичную стратегию.В настоящее время наша команда разрабатывает следующее поколение микрозахваток. Эти микрозахватки являются биологически активными и могут быть загружены перекрестными факторами для инкапсулированной дифференцировки стволовых клеток.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Развитие, расширение и<em&gt; В естественных условиях</em&gt; Контроль за соблюдением NK-клетки из человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) и и индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Трансплантация индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, полученных Мезоангиобласт-как миогенные прогениторы в мышиных моделях мышечной регенерации

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

С помощью клея паттернирования Построить 3D бумаги микрожидком устройств

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Культура человека плюрипотентных стволовых клеток на поливинилового спирта Co Итаконовая кислоты гидрогели с различной жесткости Xeno свободных условиях

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Ядро / оболочка Печать Scaffolds для ткани инженерных трубчатых структур

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Измерение потенциала оптического действия одной клетки в кардиомиоцитах, полученных из человеческих плюрипотентных стволовых клеток

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Метод культуры для поддержания тихие человеческие гематопоэтические стволовые клетки

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...