Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Este estudio fue apoyado en parte por las subvenciones del Centro de Medicina Regenerativa de Mayo Clinic, la Fundación J. W. Kieckhefer, la Fundación Al Nahyan, Medicina Regenerativa de Minnesota (RMM 101617 TR 004) y los NIH (DK107255).

1. Fabricación del dispositivo
<ol><li>Realice los diseños para el dispositivo de microencapsulación y el dispositivo de disociación utilizando el software CAD10,11.</li>
	<li>Spin-coat las tres capas de fotorresisten SU-8 secuencialmente sobre una oblea de silicio (Figura 2A) para lograr estructuras con las alturas deseadas: 60, 100 y 150 μm. NOTA: El proceso para los moldes superior e inferior es idéntico.<ol>
<li>Recubr...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

El proceso de encapsulación descrito aquí da como resultado la formación reproducible de esferoides hPSC. El formato de microcápsula facilita la dispensación de esferoides en pozos de una placa de microtitulación para experimentos destinados a mejorar / optimizar los protocolos de diferenciación o probar terapias. Los esferoides de células madre encapsuladas también se pueden usar en cultivos en suspensiones donde la cubierta de hidrogel protege las células contra el daño inducido por el cizallamiento<sup clas...

Existe un interés considerable en los cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas (hPSC) debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que ofrece este formato de cultivo 1,2,3. Las hPSC se forman típicamente en esferoides u otros formatos de cultivo 3D por medio de biorreactores, micropocillos, hidrogeles y andamios poliméricos 4,5,6. La encapsulación ofrece otro medio para organizar hPSC individuales en esferoides. Una vez encapsulados, los esferoides hPSC se pueden manejar con facilidad y transferirse a placas de microtitulación para diferenciación, modelado de enfermedades o experimentos de prueba de drogas. El recubrimiento de hPSCs en una capa de hidrogel también protege las células contra el daño por cizallamiento y permite cultivar esferoides en un biorreactor a altas tasas de agitación7.
Nuestra metodología para la encapsulación de células madre evolucionó con el tiempo. En primer lugar, nos centramos en micropartículas sólidas de hidrogel y demostramos la encapsulación y el cultivo exitosos de células madre embrionarias de ratón (mESCs)8. Sin embargo, se observó que las células madre embrionarias humanas (hESC) tenían baja viabilidad cuando se encapsulaban en tales micropartículas de hidrogel, presumiblemente debido a la mayor necesidad de que estas células restablecieran los contactos célula-célula después de la encapsulación. Razonamos que la microcápsula heterogénea, que posee un núcleo acuoso, puede ser más adecuada para la encapsulación de células que dependen del rápido restablecimiento de los contactos célula-célula. El concepto de dispositivo microfluídico de enfoque de flujo coaxial para hacer microcápsulas de núcleo acuoso / cubierta de hidrogel se adaptó de He et al.9, pero en lugar de alginato empleado en el enfoque original, se incorporó un hidrogel basado en PEG en la cáscara. Primero demostramos la encapsulación exitosa y la formación de esferoides de hepatocitos primarios en microcápsulas núcleo-cáscara10 y, más recientemente, describimos la encapsulación de células hES e iPS7. Como se describe en la Figura 1A, las cápsulas se fabrican en un dispositivo de enfoque de flujo donde las corrientes de flujo de la cáscara y el núcleo pasan de lado a lado al flujo coaxial antes de la eyección a la fase de aceite. El flujo central contiene células y aditivos que aumentan la viscosidad de la solución (PEG MW 35kD no reactivo e iodixanol - nombre comercial OptiPrep) mientras que el flujo de la cáscara contiene moléculas reactivas (PEG-4-Mal). El flujo de flujo coaxial continuo se discretiza en gotas que conservan la arquitectura core-shell. La estructura núcleo-cáscara se hace permanente por la exposición al reticulador de di-tiol (TDT), que reacciona con PEG-4-Mal a través de la química del clic y da como resultado la formación de una piel o cáscara de hidrogel delgada (~ 10 μm). Después de que la emulsión se rompe y las cápsulas se transfieren a una fase acuosa, las moléculas de PEG se difunden desde el núcleo y son reemplazadas por moléculas de agua. Esto da como resultado microcápsulas de núcleo acuoso y cáscara de hidrogel.
A continuación se proporcionan instrucciones paso a paso sobre cómo hacer dispositivos microfluídicos, cómo preparar células y cómo llevar a cabo la encapsulación de hPSC.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

Los cultivos tridimensionales (3D) o esferoides de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ofrecen los beneficios de mejorar los resultados de diferenciación y escalabilidad. En este artículo, describimos una estrategia para la formación robusta y reproducible de esferoides hPSC donde se utiliza un dispositivo de enfoque de flujo coaxial para atrapar hPSC dentro de microcápsulas de núcleo-caparazón. La solución central contenía suspensión unicelular de hPSCs y se hizo viscosa mediante la incorporación de poli(etilenglicol) de alto peso molecular (PEG) y medios de gradiente de densidad. La corriente de concha comprendía PEG-4 brazo-maleimida o PEG-4-Mal y fluía a lo largo de la corriente central hacia dos uniones de petróleo consecutivas. La formación de gotas ocurrió en la primera unión de aceite con una solución de cáscara que se envuelve alrededor del núcleo. La reticulación química de la cáscara se produjo en la segunda unión de aceite mediante la introducción de un reticulador de di-tiol (1,4-ditiotreitol o TDT) a estas gotas. El reticulante reacciona con los grupos funcionales maleimida a través de la química del clic, lo que resulta en la formación de una capa de hidrogel alrededor de las microcápsulas. Nuestra tecnología de encapsulación produjo cápsulas de 400 μm de diámetro a una velocidad de 10 cápsulas por segundo. Las cápsulas resultantes tenían una cubierta de hidrogel y un núcleo acuoso que permitía a las células individuales ensamblarse rápidamente en agregados y formar esferoides. El proceso de encapsulación no afectó negativamente la viabilidad de las hPSC, observándose una viabilidad del >95% 3 días después de la encapsulación. A modo de comparación, las hPSC encapsuladas en micropartículas de gel sólido (sin un núcleo acuoso) no formaron esferoides y tuvieron una viabilidad del <50% 3 días después de la encapsulación. La formación de esferoides de hPSC dentro de las microcápsulas de la cáscara del núcleo ocurrió dentro de las 48 h posteriores a la encapsulación, siendo el diámetro del esferoide una función de la densidad de inoculación celular. En general, la tecnología de encapsulación microfluídica descrita en este protocolo era adecuada para la encapsulación de hPSC y la formación de esferoides.

Al seguir el protocolo mencionado anteriormente, el lector podrá fabricar dispositivos microfluídicos y producir microcápsulas portadoras de células. La Figura 3A muestra ejemplos de microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas. Diferentes formulaciones de PEG-4-Mal dieron como resultado cápsulas de diferentes morfologías: las cápsulas arrugadas se asociaron con una gelificación deficiente, baja integridad mecánica y no resistiero...

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Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Este artículo describe la encapsulación de células madre pluripotentes humanas (hPSC) utilizando un dispositivo de enfoque de flujo coaxial. Demostramos que esta tecnología de encapsulación microfluídica permite la formación eficiente de esferoides hPSC.

Fabricación microfluídica de microcápsulas core-shell que transportan esferoides de células madre pluripotentes humanas

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

El área se considera de interés en cultivos 3D de células madre pluripotentes humanas debido a la mejora de la pluripotencia y el potencial de diferenciación que este cultivo formó. Describimos nuestra estrategia de encapsulación que conduce a la formación reproducible de esferoides de células madre pluripotentes humanas. Una vez encapsulados, estos esferoides de células madre son susceptibles de cultivo, ya sea en placas de múltiples pocillos o biorreactores agitados.Nuestra estrategia de encapsulación es optimizar la capacidad de supervivencia de la pestilencia y la alta eficiencia de la formación de esferoides. Los esferoides encapsulados están protegidos contra el cizallamiento o la energía mecánica asociada con la agitación o el balanceo. El desarrollo de células madre derivadas de la terapia celular depende en parte de la capacidad de generar el producto celular deseado de una manera escalable, eficiente y rentable.La tecnología de encapsulación descrita aquí representa un paso en esta dirección. La tecnología de encapsulación descrita aquí será probablemente aplicable al cultivo 3D de varios tipos de células, desde otras células hasta otras células madre pluripotentes. Comience preparando 30 mililitros de solución madre de dos veces el núcleo mezclando 4.8 gramos de PEG de 35 kilodalton, 10.2 mililitros de medios de gradiente de densidad y 19.8 mililitros de medios DMEM / F-12.A continuación, filtre esta solución central con un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros. A continuación, prepare 50 mililitros de aceite mineral con 3 por ciento de surfactante mezclando 48.5 mililitros de aceite mineral y 1.5 mililitros de surfactante. Luego esterilice la solución pasándola a través de un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros.A continuación, prepare soluciones de TDT molar 1, TEA molar y PF127 al 1 por ciento, como se describe en el manuscrito de texto. A continuación, prepare una emulsión de reticulación mezclando 4,5 mililitros de aceite mineral con un 3 por ciento de surfactante y 300 microlitros de 1 TDT molar. Después de vórtice la solución durante dos minutos, sonicar durante 45 a 60 minutos en un baño ultrasónico a 20 grados centígrados y cargarlo en una jeringa de 5 mililitros con una aguja de calibre 27.A continuación, prepare la solución de aceite de protección cargando el aceite mineral con un surfactante al 0,5 por ciento en una jeringa de 5 mililitros con una aguja calibre 27. Para preparar la solución de cáscara, agregue 32 miligramos de maleimida PEG4 en 400 microlitros de DPBS. A continuación, añadir 6 microlitros de 1 MOLAR TEA.Vórtice la solución durante 2 minutos y centrífuga a través de un filtro de centrifugado. Mantenga la solución en la oscuridad en el balancín durante 30 minutos antes de cargarla en una jeringa de 1 mililitro con una aguja calibre 27. Finalmente, prepare la solución de núcleo final volviendo a suspender 20 millones de hPSC en medios de 200 microlitros y mezcle con 30 microlitros de 1 por ciento de PF127 y 200 microlitros de solución de núcleo 2X.Inserte una pequeña barra agitadora en una jeringa de 1 mililitro. Luego, cargue la célula que contiene la solución central en la jeringa con una aguja de calibre 27. Comience colocando el dispositivo de gotas PDMS adherido, 4 piezas de 20 centímetros de largo y 1 pieza de microtubos de entrada de 5 centímetros de largo, 1 pieza de tubo de salida de 10 centímetros y 6 piezas de tubos de ajuste de 0,5 centímetros debajo de la fuente de luz germicida durante 30 minutos para la esterilización.Ahora coloque las 4 piezas de microtubos de entrada de 20 centímetros de largo en la carcasa, el aceite, la emulsión de enlace cruzado y las entradas del dispositivo de disociación utilizando fórceps. Luego, inserte el extremo opuesto de los tubos en la aguja de la jeringa con la solución correspondiente. Mientras tanto, conecte la entrada del núcleo de los dispositivos microfluídicos y la salida de los dispositivos de disociación con un microtubo de 5 centímetros.Inserte 1 tubo de salida en el puerto de salida fluídico y coloque el extremo opuesto en un depósito de recolección. A continuación, coloque el dispositivo en un escenario de microscopio y conecte el tubo para evitar cualquier movimiento. Alinee y enfoque el microscopio en la boquilla del dispositivo para la inspección de flujo.Coloque cada jeringa en diferentes bombas de jeringa y asegúrela correctamente. Programe cada bomba de acuerdo con los protocolos del fabricante a los caudales mencionados en el manuscrito de texto, e inicie el flujo en todas las bombas. Espere a que cada fluido ingrese al dispositivo y llene los canales mientras expulsa el aire restante.Cuando la formación de la cápsula se estabilice, coloque el extremo opuesto del tubo de recolección en un nuevo tubo cónico que contenga 5 mililitros de medios mTeSR. Una vez que se hayan recolectado suficientes cápsulas, incube durante 10 minutos. Las cápsulas que residen en la fase de aceite estarán en la parte superior del tubo, que sedimenta hacia la parte inferior al golpear suavemente el tubo.Para recuperar las cápsulas, comience por eliminar el aceite del tubo de recolección. Luego, coloque las cápsulas en un colador celular de 100 micrómetros de tamaño de poro y lave el colador con grandes cantidades de medios. Invierta el filtro en la parte superior de un pozo de una placa de cultivo de 6 pocillos y recoja las microcápsulas pasando 2 mililitros de medios a través del filtro.Incubar las cápsulas de células madre en un plato de cultivo de 6 pocillos a 37 grados centígrados con un 5 por ciento de dióxido de carbono. Cambie los medios cada dos días recogiendo las cápsulas en un filtro colador celular, lavándolas con exceso de medios y volviéndolas a suspender a un nuevo pozo en placas de 6 pocillos con medios de 2 mililitros. Realizar el ensayo de viabilidad añadiendo 4 microlitros de los 2 micromolares Ethidium Homodimer-1 y 1 microlitro de las 4 soluciones micromolares de Calceína-AM a 2 mililitros de DPBS estériles.Vórtice para asegurar una mezcla completa. Recolecte aproximadamente 100 microcápsulas en un colador celular y enjuáguelas con DPBS estériles para permitir la difusión del medio de las cápsulas. Recójalos nuevamente en una placa de cultivo de 12 pocillos usando 1 mililitro de la solución preparada que contiene Ethidium Homodimer-1 y calceína AM e incube a 37 grados Celsius durante 20 minutos.Visualice las células bajo un microscopio de fluorescencia. Las microcápsulas óptimas y subóptimas fabricadas mediante la generación de gotas microfluídicas mostraron diferencias en la morfología de la cápsula en función del contenido de PEG4-Maleimida en la cáscara. Las cápsulas lisas con bordes brillantes se asocian con la integridad mecánica deseada.La agregación de cuentas en el centro de las cápsulas indica que el núcleo era acuoso y las cuentas eran libres de moverse. El anillo fluorescente indicó la presencia de una cáscara de hidrogel y se utilizó para determinar el grosor de la cáscara. Las tinciones vivas o muertas 6 horas después de encapsular las células H9 mostraron que las células lograron más del 95 por ciento de viabilidad de forma rutinaria durante las ejecuciones de encapsulación.Al comparar la tasa de crecimiento y el potencial de diferenciación de los esferoides encapsulados frente a los no encapsulados. Se determinó que el proceso de encapsulación no tiene efectos adversos sobre las hPSC. Recuerde que es importante establecer una relación de caudal óptima entre la carcasa del núcleo y las corrientes de aceite.No hacer esto puede resultar en cápsulas que no serán mecánicamente fuertes y pueden romperse durante la manipulación. Nos gustaría señalar que esta técnica de encapsulación fue para tipos de células distintas de las células madre pluripotentes humanas. Hemos encapsulado, principalmente hipotetizados, líneas celulares de cáncer y células madre mesenquimales utilizando una estrategia similar.Actualmente, nuestro equipo está desarrollando la próxima generación de microcapturas. Estas microcapturas son bioactivas y pueden estar cargadas con factores cruzados para la diferenciación encapsulada de células madre.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Desarrollo, la expansión y<em&gt; En vivo</em&gt; Monitoreo de las células NK humanas a partir de células madre embrionarias humanas (hESCs) y y células madre pluripotentes inducidas (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Investigación

Bioingeniería

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Trasplante De InducidaS Pluripotentes Derivadas De Células Madre Mesoangioblastos Como Progenitores Miógenos En Modelos De Ratón De La Regeneración Muscular

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

El uso de adhesivo Patrones para construir dispositivos de microfluidos de papel 3D

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

Cultura de células madre humanas pluripotentes en polivinilos hidrogeles ácidos itacónico-Co-Alcohol con rigidez variable en condiciones libres de Xeno

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Andamios de impresión de núcleo/concha para la ingeniería de tejidos de estructuras tubulares

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Un método de cultivo para mantener las células madre hematopoyéticas humanas quiescentes

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...