Name: microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids
Uploaded: 2021-10-13T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Bu çalışma kısmen Mayo Clinic Rejeneratif Tıp Merkezi, J. W. Kieckhefer Vakfı, Al Nahyan Vakfı, Rejeneratif Tıp Minnesota (RMM 101617 TR 004) ve NIH (DK107255) tarafından desteklenmiştir.

1. Cihaz imalatı
<ol><li>CAD yazılımı10,11'i kullanarak mikrokapsülleme cihazı ve ayrışma cihazı için tasarımlar yapın.</li>
	<li>İstenilen yüksekliklere sahip yapılar elde etmek için SU-8 fotodirencinin üç katmanını silikon gofret üzerinde sırayla (Şekil 2A) spin-co'layın: 60, 100 ve 150 μm. NOT: Üst ve alt kalıplar için işlem aynıdır.<ol>
<li>İlk 60 μm katmanı oluşturmak için 1.100 rpm'de SU...

<ol>
	<li>Zhu, Z., Huangfu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pluripotent+stem+cells:+an+emerging+model+in+developmental+biology.">Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology.</a> Development. 140 (4), 705-717 (2013).</li><li>Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+pluripotent+stem+cells:+history,+mechanisms,+technologies,+and+applications.">Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).</li><li>Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+methods+for+enhancing+pluripotent+stem+cell+expansion.">Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).</li><li>Lei, Y., Schaffer, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fully+defined+and+scalable+3D+culture+system+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+differentiation.">A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).</li><li>Olmer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suspension+culture+of+human+pluripotent+stem+cells+in+controlled,+stirred+bioreactors.">Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors.</a> Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).</li><li>Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+biomaterials+for+the+study+of+human+pluripotent+stem+cells.">Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells.</a> Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).</li><li>Fattahi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Core-shell+hydrogel+microcapsules+enable+formation+of+human+pluripotent+stem+cell+spheroids+and+their+cultivation+in+a+stirred+bioreactor.">Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor.</a> Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+fabrication+of+bioactive+microgels+for+rapid+formation+and+enhanced+differentiation+of+stem+cell+spheroids.">Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).</li><li>Agarwal, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+microfluidic+generation+of+pre-hatching+embryo-like+core-shell+microcapsules+for+miniaturized+3D+culture+of+pluripotent+stem+cells.">One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells.</a> Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).</li><li>Siltanen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+step+fabrication+of+hydrogel+microcapsules+with+hollow+core+for+assembly+and+cultivation+of+hepatocyte+spheroids.">One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids.</a> Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).</li><li>Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulated+immunoassays+for+detection+of+cytokines+in+human+blood.">Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood.</a> ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).</li><li>Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparin-based+hydrogel+as+a+matrix+for+encapsulation+and+cultivation+of+primary+hepatocytes.">Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes.</a> Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).</li><li>Shin, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodegradable+hydrogels+for+capture,+detection,+and+release+of+live+cells.">Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells.</a> Angewandte Chemie International Edition. , (2014).</li><li>You, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+photodegradable+hydrogel+for+cultivation+and+retrieval+of+embryonic+stem+cells.">Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells.</a> Advanced Functional Materials. , (2015).</li></ol>

Burada açıklanan kapsülleme işlemi, hPSC sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumu ile sonuçlanır. Mikrokapsül formatı, farklılaşma protokollerini iyileştirmeyi / optimize etmeyi veya tedavileri test etmeyi amaçlayan deneyler için sferoidlerin bir mikrotitre plakasının kuyucuklarına dağıtılmasını kolaylaştırır. Kapsüllenmiş kök hücre sferoidleri, hidrojel kabuğun hücreleri kesme kaynaklı hasara karşı koruduğu süspansiyon kültürlerinde de kullanılabilir7.
<p ...

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) 3D kültürlerine, bu kültür formatı 1,2,3'ün sağladığı gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle büyük ilgi vardır. hPSC'ler tipik olarak biyoreaktörler, mikrokuyular, hidrojeller ve polimerik iskeleler 4,5,6 aracılığıyla sferoidler veya diğer 3D kültür formatları halinde oluşturulur. Kapsülleme, tek hPSC'leri sferoidler halinde düzenlemek için başka bir yol sunar. Kapsüllendikten sonra hPSC sferoidleri kolaylıkla ele alınabilir ve farklılaşma, hastalık modelleme veya ilaç testi deneyleri için mikrotitre plakalarına aktarılabilir. hPSC'lerin bir hidrojel tabakası içinde muhafaza edilmesi ayrıca hücreleri kesme hasarına karşı korur ve sferoidlerin bir biyoreaktörde yüksek karıştırma oranlarındakültürlenmesine izin verir 7.
Kök hücre kapsülleme metodolojimiz zamanla gelişti. İlk olarak, katı hidrojel mikropartiküllerine odaklandık ve fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler) başarılı bir şekilde kapsüllendiğini ve yetiştirildiğini gösterdik8. Bununla birlikte, insan embriyonik kök hücrelerinin (hESC'ler), muhtemelen bu hücrelerin kapsüllemeden sonra hücre-hücre temaslarını yeniden kurmalarına duyulan ihtiyaç nedeniyle, bu tür hidrojel mikropartiküllerde kapsüllendiğinde düşük canlılığa sahip oldukları belirtildi. Sulu bir çekirdeğe sahip heterojen mikrokapsülün, hücre-hücre temaslarının hızlı bir şekilde yeniden kurulmasına dayanan hücrelerin kapsüllenmesi için daha uygun olabileceğini düşündük. Sulu çekirdek / hidrojel kabuk mikrokapsülleri yapmak için mikroakışkan cihaz odaklı koaksiyel akış kavramı He ve ark.9'dan uyarlanmıştır, ancak orijinal yaklaşımda kullanılan aljinat yerine, PEG bazlı bir hidrojel kabuğa dahil edilmiştir. İlk olarak çekirdek-kabuk mikrokapsüllerinde primer hepatositin başarılı kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu10 gösterdik ve en son olarak hES ve iPS hücrelerinin kapsüllenmesini tanımladık7. Şekil 1A'da belirtildiği gibi, kapsüller, kabuk ve çekirdek akış akışlarının yağ fazına atılmadan önce bir yandan diğer yana koaksiyel akışa geçtiği bir akış odaklama cihazında üretilir. Çekirdek akışı, çözeltinin viskozitesini artıran hücreler ve katkı maddeleri içerir (reaktif olmayan PEG MW 35kD ve iyodiksanol - ticari adı OptiPrep), kabuk akışı ise reaktif moleküller (PEG-4-Mal) içerir. Sürekli koaksiyel akış akışı, çekirdek-kabuk mimarisini koruyan damlacıklar halinde ayrıklaştırılır. Çekirdek-kabuk yapısı, tıklama kimyası yoluyla PEG-4-Mal ile reaksiyona giren ve ince (~ 10 μm) bir hidrojel cilt veya kabuk oluşumuna neden olan di-tiol çapraz bağlayıcıya (DTT) maruz kalınarak kalıcı hale getirilir. Emülsiyon kırıldıktan ve kapsüller sulu bir faza aktarıldıktan sonra, PEG molekülleri çekirdekten yayılır ve su molekülleri ile değiştirilir. Bu, sulu çekirdek ve hidrojel kabuk mikrokapsülleri ile sonuçlanır.
Aşağıda, mikroakışkan cihazların nasıl yapılacağı, hücrelerin nasıl hazırlanacağı ve hPSC'lerin kapsüllenmesinin nasıl gerçekleştirileceği hakkında adım adım talimatlar verilmiştir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#181;m Syringe Filters</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>25-244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x DPBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>23220003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-arm PEG maleimide, 10kDa</td>
			<td>Laysan Inc.</td>
			<td>164-68</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml syringe luer-lock tip</td>
			<td>BD</td>
			<td>309646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-WELL NON-TREATED PLATE</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7672-7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquapel Applicator Pack</td>
			<td>Aquapel Glass Treatment</td>
			<td>47100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CAD software</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>AutoCAD v2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CELL STRAINER 100 &#181;m pore size</td>
			<td>cardinal</td>
			<td>335583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorotrimethylsilane</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>386529-100mL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II FL Automated Cell Counter</td>
			<td>Life technology</td>
			<td>A27974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital hot plate</td>
			<td>Dataplate</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital vortex mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>215370</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distilled water</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15230-162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheritol (DTT)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D0632-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12 media</td>
			<td>gibco</td>
			<td>11320-033</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>14-959-53A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge</td>
			<td>live</td>
			<td>13-100-675</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>50144906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Motorized Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus IX83</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laurell Spin Coaters</td>
			<td>Laurell Technologies</td>
			<td>WS-650MZ-23NPPB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead mammalian staining kit</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magic tape</td>
			<td>Staples</td>
			<td>483535</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Medical Tubing (0.015&#34; I.D. x 0.043&#34; O.D.)</td>
			<td>Scientific Commodities, Inc</td>
			<td>BB31695-PE/2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro stir bar</td>
			<td>Daigger Scientific</td>
			<td>EF3288E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MilliporeSigma Filter Forceps</td>
			<td>Fisher scientific</td>
			<td>XX6200006P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral oil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8410-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR 1 Basal Medium</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>85850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 14 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-14-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles-Stainless Steel&#160; 15 Gauge</td>
			<td>CML supply</td>
			<td>901-15-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep</td>
			<td>STEMCELL TECHNOLOGY</td>
			<td>7820</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HERA THERM Oven</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gemini</td>
			<td>400-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri Dish 150X20 Sterile Vent</td>
			<td>Sarstedt, Inc.</td>
			<td>82.1184.500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma Cleaning System</td>
			<td>Yield Engineering System, Inc.</td>
			<td>YES-G500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2443-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(ethylene glycol) 35kDa</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94646-250G-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PrecisionGlide Needle 27G</td>
			<td>BD</td>
			<td>305109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride</td>
			<td>SELLECK CHEM</td>
			<td>S1049-10mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon wafer 100mm</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>452</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slide glass (75mm &#180; 25mm)</td>
			<td>CardinalHealth</td>
			<td>M6146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Span 80</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S6760-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpeedMixer</td>
			<td>Thinky</td>
			<td>ARE-310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>8160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 2025</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y111069 0500L1GL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SU-8 developer</td>
			<td>Kayaku Advanced Materials</td>
			<td>Y020100 4000L1PE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades</td>
			<td>fisher scientific</td>
			<td>22-079-684</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>2065622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>New Era Pump System, Inc</td>
			<td>NE-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triethanolamine</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td>T58300-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE Express</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604-013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.02&#34; I.D. x 0.06&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tygon Tubing (0.04&#34; I.D. x 0.07&#34; O.D.)</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>06419-04</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrasonic cleaner FS20D</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>CPN-962-152R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum desiccator</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>F42025-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>435421-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#956;PG 101 laser writer</td>
			<td>Heidelberg Instruments</td>
			<td>HI 1128</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic fabrication of core-shell microcapsules carrying human pluripotent stem cell spheroids

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) üç boyutlu (3D) veya sferoid kültürleri, gelişmiş farklılaşma sonuçlarının ve ölçeklenebilirliğin faydalarını sunar. Bu yazıda, hPSC'leri çekirdek kabuklu mikrokapsüllerin içine hapsetmek için bir ko-eksenel akış odaklama cihazının kullanıldığı hPSC sferoidlerinin sağlam ve tekrarlanabilir oluşumu için bir strateji açıklanmaktadır. Çekirdek çözelti, hPSC'lerin tek hücreli süspansiyonunu içeriyordu ve yüksek moleküler ağırlıklı poli (etilen glikol) (PEG) ve yoğunluk gradyan ortamının dahil edilmesiyle viskoz hale getirildi. Kabuk akışı, PEG-4 kol-maleimid veya PEG-4-Mal'dan oluşuyordu ve çekirdek akışı boyunca iki ardışık petrol kavşağına doğru akıyordu. Damlacık oluşumu, ilk yağ kavşağında, kabuk çözeltisinin çekirdeğin etrafına sarılmasıyla meydana geldi. Kabuğun kimyasal çapraz bağlanması, ikinci yağ kavşağında, bu damlacıklara bir di-tiyo çapraz bağlayıcı (1,4-ditiyotreitol veya DTT) eklenerek meydana geldi. Çapraz bağlayıcı, tıklama kimyası yoluyla maleimid fonksiyonel gruplarıyla reaksiyona girer ve mikrokapsüllerin etrafında bir hidrojel kabuğunun oluşmasına neden olur. Enkapsülasyon teknolojimiz, saniyede 10 kapsül hızında 400 μm çapında kapsüller üretti. Ortaya çıkan kapsüller, bir hidrojel kabuğa ve tek hücrelerin agregalara hızla toplanmasına ve sferoidler oluşturmasına izin veren sulu bir çekirdeğe sahipti. Kapsülleme işlemi, hPSC'lerin yaşayabilirliğini olumsuz yönde etkilemedi, kapsüllemeden 3 gün sonra% >95 canlılık gözlendi. Karşılaştırma için, katı jel mikropartiküllerinde (sulu bir çekirdek olmadan) kapsüllenmiş hPSC'ler sferoidler oluşturmadı ve kapsüllemeden 3 gün sonra% <50 canlılığa sahipti. Çekirdek-kabuk mikrokapsülleri içindeki hPSC'lerin küresel oluşumu, kapsüllemeden sonraki 48 saat içinde meydana geldi ve sferoid çap, hücre aşılama yoğunluğunun bir fonksiyonuydu. Genel olarak, bu protokolde açıklanan mikroakışkan kapsülleme teknolojisi, hPSC'lerin kapsüllenmesi ve sferoid oluşumu için çok uygundu.

Yukarıda belirtilen protokolü izleyerek, okuyucu mikroakışkan cihazlar üretebilecek ve hücre taşıyan mikrokapsüller üretebilecektir. Şekil 3A , mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüllerin örneklerini göstermektedir. PEG-4-Mal'ın farklı formülasyonları, farklı morfolojilere sahip kapsüllerle sonuçlandı - buruşuk kapsüller zayıf jelasyon, düşük mekanik bütünlük ile ilişkiliydi ve karıştırılmış bir biyoreak...

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids at JoVE.com

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Bu makalede, insan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) koaksiyel akış odaklama cihazı kullanılarak kapsüllenmesi açıklanmaktadır. Bu mikroakışkan kapsülleme teknolojisinin hPSC sferoidlerinin verimli bir şekilde oluşturulmasını sağladığını gösteriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücre Sferoidlerini Taşıyan Core-Shell Mikrokapsüllerinin Mikroakışkan İmalatı

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Alan, bu kültürün oluşturduğu gelişmiş pluripotens ve farklılaşma potansiyeli nedeniyle insan pluripotent kök hücrelerinin 3D kültürlerine ilgi duyduğu düşünülmektedir. İnsan pluripotent kök hücre sferoidlerinin tekrarlanabilir oluşumuna yol açan kapsülleme stratejimizi tanımladık. Kapsüllendikten sonra, bu kök hücre sferoidleri, çok kuyulu plakalarda veya karıştırılmış biyoreaktörlerde ekime uygundur.Kapsülleme stratejimiz, pestilansın hayatta kalma kabiliyetini ve küresel oluşumun yüksek verimliliğini optimize etmektir. Kapsüllenmiş sferoidler, karıştırma veya sallanma ile ilişkili kesme veya mekanik enerjiye karşı korunur. Hücresel tedaviden türetilen kök hücrelerin geliştirilmesi, kısmen istenen hücresel ürünü ölçeklenebilir, verimli ve uygun maliyetli bir şekilde üretme yeteneğine bağlıdır.Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi bu yönde atılmış bir adımı temsil etmektedir. Burada açıklanan kapsülleme teknolojisi muhtemelen diğer hücrelerden diğer pluripotent kök hücrelere kadar çeşitli hücre tiplerinin 3D yetiştirilmesi için geçerli olacaktır. 4,8 gram 35 kilodalton PEG, 10,2 mililitre yoğunluk gradyanı ortamı ve 19,8 mililitre DMEM/F-12 ortamını karıştırarak 30 mililitre iki kat çekirdek stok çözeltisi hazırlayarak başlayın.Ardından bu çekirdek çözeltiyi 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Daha sonra, 48.5 mililitre mineral yağ ve 1.5 mililitre yüzey aktif maddeyi karıştırarak yüzde 3 yüzey aktif madde ile 50 mililitre mineral yağ hazırlayın. Daha sonra çözeltiyi 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirerek sterilize edin.Daha sonra, metin makalesinde açıklandığı gibi 1 molar DTT, 1 molar TEA ve yüzde 1 PF127 çözeltileri hazırlayın. Daha sonra 4.5 mililitre mineral yağı yüzde 3 yüzey aktif madde ve 300 mikrolitre 1 molar DTT ile karıştırarak bir çapraz bağlayıcı emülsiyonu hazırlayın. Çözeltiyi iki dakika boyunca vorteksledikten sonra, 20 santigrat derecede ultrasonik bir banyoda 45 ila 60 dakika boyunca sonikasyon yapın ve 27 gauge iğne ile 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyin.Daha sonra, mineral yağı yüzde 0,5 yüzey aktif madde ile 27 gauge iğneli 5 mililitrelik bir şırıngaya yükleyerek koruyucu yağ çözeltisi hazırlayın. Kabuk çözeltisini hazırlamak için, 400 mikrolitre DPBS'ye 32 miligram PEG4 maleimid ekleyin. Ardından, 6 mikrolitre 1 molar TEA ekleyin.Çözeltiyi 2 dakika boyunca vorteksleyin ve bir sıkma filtresinden santrifüj yapın. 27 gauge iğne ile 1 mililitrelik bir şırıngaya yüklemeden önce çözeltiyi rocker üzerinde 30 dakika karanlıkta tutun. Son olarak, 200 mikrolitrelik ortamda 20 milyon hPSC'yi yeniden askıya alarak nihai çekirdek çözümünü hazırlayın ve 30 mikrolitre yüzde 1 PF127 ve 200 mikrolitre 2X çekirdek çözeltisi ile karıştırın.1 mililitrelik bir şırıngaya küçük bir karıştırıcı çubuğu yerleştirin. Ardından, çekirdek çözeltisi içeren hücreyi 27 gauge iğne ile şırıngaya yükleyin. Bağlı PDMS damlacık cihazını, 4 adet 20 santimetre uzunluğunda ve 1 adet 5 santimetre uzunluğunda giriş mikrotüpünü, 1 adet 10 santimetre çıkış tüpünü ve 6 adet 0,5 santimetre montaj tüpünü mikrop öldürücü ışık kaynağının altına sterilizasyon için 30 dakika boyunca yerleştirerek başlayın.Şimdi 4 adet 20 santimetre uzunluğundaki giriş mikrotüplerini forseps kullanarak kabuğa, yağa, çapraz bağlayıcı emülsiyonuna ve ayrışma cihazı girişlerine sığdırın. Ardından, tüplerin karşı ucunu karşılık gelen çözelti ile şırınga iğnesine yerleştirin. Bu arada, mikroakışkan cihazların çekirdek girişini ve ayrışma cihazlarının çıkışını 5 santimetrelik bir mikrotüp ile bağlayın.Akışkan çıkış portuna 1 çıkış tüpü yerleştirin ve karşı ucu bir toplama haznesine yerleştirin. Ardından, cihazı mikroskop aşamasına yerleştirin ve herhangi bir hareketi önlemek için boruyu takın. Akış denetimi için mikroskobu cihaz nozuluna hizalayın ve odaklayın.Her şırıngayı farklı şırınga pompalarına yerleştirin ve uygun şekilde sabitleyin. Her pompayı üreticinin protokollerine göre metin yazısında belirtilen akış hızlarına göre programlayın ve tüm pompalarda akışı başlatın. Her sıvının cihaza girmesini bekleyin ve kalan havayı dışarı iterken kanalları doldurun.Kapsül oluşumu stabilize edildiğinde, toplama tüpünün karşı ucunu 5 mililitre mTeSR ortamı içeren yeni bir konik tüpe yerleştirin. Yeterli kapsül toplandıktan sonra, 10 dakika boyunca inkübe edin. Yağ fazında bulunan kapsüller, tüpün tepesinde olacak ve tüpe hafifçe dokunulduğunda dibe çökelecektir.Kapsülleri almak için, toplama tüpünden yağı çıkararak başlayın. Ardından, kapsülleri 100 mikrometre gözenek boyutunda bir hücre süzgeci üzerine yerleştirin ve süzgeci bol miktarda ortamla yıkayın. Filtreyi 6 delikli bir kültür plakasının bir kuyucuğunun üstüne ters çevirin ve filtreden 2 mililitre ortam geçirerek mikrokapsülleri toplayın.Kök hücre kapsüllerini, yüzde 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede 6 kuyucuklu bir kültür kabında inkübe edin. Kapsülleri bir hücre süzgeci filtresinde toplayarak, fazla medya ile yıkayarak ve 2 mililitrelik ortama sahip 6 delikli plakalarda yeni bir kuyuya yeniden askıya alarak medyayı her gün değiştirin. 2 mililitre steril DPBS'ye 2 mikromolar Ethidium Homodimer-1'in 4 mikrolitresini ve 4 mikromolar Calcein-AM çözeltisinin 1 mikrolitresini ekleyerek canlılık testi yapın.Tam karıştırma sağlamak için vorteks. Bir hücre süzgeci üzerinde yaklaşık 100 mikrokapsül toplayın ve kapsüllerden orta difüzyona izin vermek için steril DPBS ile durulayın. Ethidium Homodimer-1 ve kalsein içeren hazırlanmış çözeltinin 1 mililitresini kullanarak 12 kuyucuklu bir kültür plakasında tekrar toplayın ve 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.Hücreleri floresan mikroskobu altında görselleştirin. Mikroakışkan damlacık üretimi kullanılarak üretilen optimal ve yetersiz mikrokapsüller, kabuktaki PEG4-Maleimide içeriğinin bir fonksiyonu olarak kapsül morfolojisinde farklılıklar göstermiştir. Parlak kenarlı pürüzsüz kapsüller, istenen mekanik bütünlük ile ilişkilidir.Boncukların kapsüllerin merkezinde toplanması, çekirdeğin sulu olduğunu ve boncukların hareket etmekte serbest olduğunu gösterir. Floresan anulus, bir hidrojel kabuğun varlığını gösterdi ve kabuk kalınlığını belirlemek için kullanıldı. H9 hücrelerinin kapsüllenmesinden 6 saat sonra canlı veya ölü boyamalar, hücrelerin kapsülleme çalışmaları sırasında rutin olarak yüzde 95'ten fazla canlılık elde ettiğini göstermiştir.Enkapsüllenmiş ve kapsüllenmemiş sferoidlerin büyüme hızı ve farklılaşma potansiyeli karşılaştırıldığında. Kapsülleme işleminin hPSC'ler üzerinde herhangi bir olumsuz etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Lütfen unutmayın, çekirdek kabuk ve yağ akışları arasında optimum akış hızı oranının belirlenmesi önemlidir.Bunu yapmamak, mekanik olarak güçlü olmayacak ve kullanım sırasında yırtılabilecek kapsüllere neden olabilir. Bu kapsülleme tekniğinin insan pluripotent kök hücreleri dışındaki hücre tipleri için olduğunu belirtmek isteriz. Benzer bir strateji kullanarak, öncelikle hipotezleştirilmiş, kanser hücre hatlarını ve mezenkimal kök hücreleri kapsülledik.Şu anda, ekibimiz yeni nesil mikro yakalamaları geliştiriyor. Bu mikro yakalamalar biyoaktiftir ve kök hücrelerin kapsüllenmiş farklılaşması için çapraz faktörlerle yüklenebilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

Geliştirme, Genişleme ve<em&gt; In vivo</em&gt; İnsan Embriyonik Kök Hücreleri (hESC) den İnsan NK Hücrelerinin İzleme ve ve Bağlı Pluripotent Kök Hücre (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Kas Yenilenmesinin Fare Modellerinde İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücre türevi Mezoangioblast benzeri Miyojenik Progenitörlerin Nakli

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

Microfluidic Picoliter Bioreactor for Microbial Single-cell Analysis: Fabrication, System Setup, and Operation

In this protocol the fabrication, experimental setup and basic operation of the recently introduced microfluidic picoliter bioreactor (PLBR) is described ...

Using Adhesive Patterning to Construct 3D Paper Microfluidic Devices

3D Kağıt mikroakışkan Cihazlar Construct Yapışkan Desenlendirme kullanma

We demonstrate the use of patterned aerosol adhesives to construct both planar and nonplanar 3D paper microfluidic devices. By spraying an aerosol ...

Human Pluripotent Stem Cell Culture on Polyvinyl Alcohol-Co-Itaconic Acid Hydrogels with Varying Stiffness Under Xeno-Free Conditions

İnsan Pluripotent kök hücre kültürü ile Xeno-Alerjik koşullar altında değişik sertlik polivinil alkol-Co-İtakonik asit Hydrogels

The effect of physical cues, such as the stiffness of biomaterials on the proliferation and differentiation of stem cells, has been investigated by ...

Core/shell Printing Scaffolds For Tissue Engineering Of Tubular Structures

Boru yapıları doku mühendisliği için Çekirdek / kabuk Baskı İskeleler

Three-dimensional (3D) printing of core/shell filaments allows direct fabrication of channel structures with a stable shell that is cross-linked at the ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...

A Culture Method to Maintain Quiescent Human Hematopoietic Stem Cells

Sessiz İnsan Hematopoetik Kök Hücrelerini Korumak İçin Bir Kültür Yöntemi

Human hematopoietic stem cells (HSCs), like other mammalian HSCs, maintain lifelong hematopoiesis in the bone marrow. HSCs remain quiescent in vivo, ...