Name: detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization
Uploaded: 2021-09-20T15:00:00
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这项工作得到了神经解剖学/组织学/脑注射核心的支持，由NIH资助#5P01DK119130-02资助。作者要感谢UT西南活细胞成像设施（由Phelps博士领导）及其工作人员（Abhijit Bugde和Marcel Mettlen）的帮助，部分由NIH Grant #1S10OD021684-01支持，这是Harold C. Simmons癌症中心的共享资源，部分由NCI癌症中心支持资助， P30 CA142543.

注意：本研究中使用的小鼠是纯C57BL / 6J背景上的野生型雄性。总共使用4只小鼠进行多重ISH。所有小鼠在牺牲时大约8周大。一只雄性小鼠（约一岁）也用于证明与衰老相关的内源性荧光。动物被关在屏障设施内的通风笼子里 ，可以随意 获取食物和水。UT西南医学中心机构动物护理和使用委员会审查并批准了下述程序。有关试剂和工具的详细信息，请参见 材料表。
<p class="jov...

ISH的技术是在20世纪60年代后期发明的42。然而，直到20世纪80年代中期，它才被应用于中枢和周围神经系统中mRNA的检测43，44。考虑到神经系统的异质性和抗体反复出现的问题，在细胞水平上定位特定的转录本仍然是一个非常宝贵的工具。尽管如此，传统的ISH方法仍然费力且异常敏感。幸运的是，这项研究采用了一种称为RNAscope的高灵敏...

迷走神经传入者的细胞体包含在颈静脉，岩质和结节1，2，3中。它们的轴突通过迷走神经的几个分支一起传播到颅颈，胸部和腹部区域4，5，6，7。从它们的内脏末端，迷走神经传入物可以对广泛的生理和有害刺激做出反应8，9，10。然而，参与迷走神经传感的信号分子和受体的分布仍然很差。这部分是因为迷走神经节尽管体积小，但表达的受体范围很广，包括大量的GPCR8，11，12，13。此外，迷走神经传入神经元本质上是异质的，并且显示出不同的分子谱14。更复杂的是，颈静脉、岩神经节和结节附着在小鼠体内，从而形成单个神经节肿块。最后，在动物亚群中，结节连接到交感神经节上颈神经节15。
过去，研究人员已经转向免疫组织化学来研究迷走神经传入神经元的神经化学组成16，17，18。虽然使用经过验证的抗体进行免疫组化是有用的，但必须谨慎解释免疫组化研究的结果。例如，许多鉴定GPCR特异性抗体的努力都失败了19，20，21，22，23，24，25，导致研究人员得出结论，大多数针对GPCR的抗体是不可靠的。为了规避这些问题，定量PCR（qPCR）已被广泛用于评估啮齿动物迷走神经节质量26，27，28，29中的基因表达。然而，使用qPCR检查基因表达是以空间信息丢失为代价的。特别是，无法预测有多少细胞或什么细胞类型表达特定的目的基因（例如，结节细胞与颈细胞）。反复出现的问题还包括邻近组织的污染以及在解剖过程中包括可变长度的迷走神经，颈部上部和颈神经节15。由于上述困难，围绕迷走神经传入神经元中几种GPCR的表达和分布存在争议。一个特别令人费解的例子与ghrelin受体（Ghsr）有关。虽然一些研究发现这种受体在迷走神经传入神经元30，31，32中广泛表达，但其他人发现Ghsr mRNA在结节11，14中几乎检测不到。因此，有必要在迷走神经节质量中详细绘制Ghsr mRNA。
原位杂交（ISH）也被用于评估迷走神经节质量7、11、12、33、34、35的基因表达模式。因为在大多数情况下，基于RNA的技术仍然比基于抗体的技术更可靠和特异性36，37，ISH的研究已被证明对更好地理解迷走神经传入神经元的神经化学编码是有价值的。尽管如此，传统的ISH技术本身并非没有警告。放射性ISH是敏感的，但会产生背景，并且仍然很麻烦38。非放射性ISH不那么复杂，但也不那么敏感38。相比之下，最近开发的RNAscope ISH方法具有高度灵敏度，并且产生最小的背景39。目前的研究将多重荧光RNAscope应用于检测小鼠迷走神经传入神经元中的GPCR。我们专注于绘制Ghsr的分布图，并将其分布与胆囊收缩素受体（Cck1r）的分布进行比较，胆囊收缩素受体（Cck1r）是另一种已知在结节34中表达的GPCR。最后，将两种转录因子，成对的同源盒2b（Phox2b）和PR结构域锌指蛋白12（Prdm12）分别用作结节和颈静脉传入神经元的选择性标记物14。如果不可视化Phox2b或Prdm12，则很难确定地识别颈静脉传入物与结核传入物。本文还讨论了潜在的技术陷阱。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x PBS</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP399-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20x SSC</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM9763</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-80&#176;C freezer</td>
			<td>PHCBI</td>
			<td>MDF-DU901VHA-PA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adobe Photoshop 2021</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>photo and design software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baking oven</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Model:658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM880 Airyscan</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass</td>
			<td>Brain Research Laboratories</td>
			<td>2460-1.5D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostat</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM 3050 S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5 Forceps</td>
			<td>F.S.T.</td>
			<td>11252-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ecomount</td>
			<td>Biocare Medical</td>
			<td>EM 897L</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HybEZ oven</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>hybridization oven</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrophobic pen</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ-Fiji</td>
			<td>NIH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>Henry Schein</td>
			<td>100-7561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro centrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20170-333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minipump variable flow</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-876-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 520</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1487001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 570</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1488001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opal 690</td>
			<td>Akoya biosciences</td>
			<td>FP1 1497001KT</td>
			<td>Fluorescent biomarker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong Gold Antifade Mountant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>mounting medium for fluorescently labeled cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>323100</td>
			<td>multiplex kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Cck1r-C3</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>313751-C3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse DapB</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>310043</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Ghsr</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>426141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Phox2b-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>407861-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAscope probe Mouse Prdm12-C2</td>
			<td>ACD /Bio-Techne</td>
			<td>524371-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RnaseZap</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R2020</td>
			<td>Rnase decontaminating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small dissecting scissors</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z265977</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>1255015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Tek OCT medium</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>User manual</td>
			<td>ACD</td>
			<td>323100 USM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS 5620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN Imaging Software</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of g protein-coupled receptor expression in mouse vagal afferent neurons using multiplex in situ hybridization

本研究描述了小鼠颈静脉结节多重 原位 杂交（ISH）的方案，特别强调检测G蛋白偶联受体（GPCRs）的表达。使用RNAscope技术处理福尔马林固定的颈静脉结节，以同时检测两个代表性GPCR（胆囊收缩素和ghrelin受体）的表达，并结合一个标记基因的结节（成对的同源盒2b，Phox2b）或颈静脉传入神经元（PR结构域锌指蛋白12，Prdm12）。使用共聚焦显微镜对标记的神经节进行成像，以确定上述转录本的分布和表达模式。简而言之，发现Phox2b传入神经元大量表达胆囊收缩素受体（Cck1r），但不是ghrelin受体（Ghsr）。还发现了Prdm12传入神经元的一小部分来表达Ghsr和/或Cck1r.讨论了多重ISH的设计，处理和解释中潜在的技术警告。本文中描述的方法可能有助于科学家生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。

虽然RNAScope可以应用于任何年龄，性别或遗传背景的动物，但建议与年轻人（<3个月大）一起工作。这是因为荧光伪影（例如，脂褐素）是老年动物神经元中的常见发现41。来自老年小鼠的福尔马林固定神经节通常含有令人惊讶的强烈内源性荧光，很容易被误认为是真正的染色（图1A，B）。在任何情况下，建议在处理之前验证组织中内源性荧光?...

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Detection of G Protein-coupled Receptor Expression in Mouse Vagal Afferent Neurons using Multiplex In Situ Hybridization (Video) | JoVE

采用多重 原位 杂交（ISH）来同时可视化成年小鼠整个迷走神经节复合物中两个G蛋白偶联受体和一个转录因子的转录物。该协议可用于生成迷走神经传入神经元转录谱的准确图谱。

使用多重 原位 杂交检测小鼠迷走神经传入神经元中G蛋白偶联受体表达

This study describes a protocol for the multiplex in situ hybridization (ISH) of the mouse jugular-nodose ganglia, with a particular emphasis on detecting ...

此过程非常敏感，允许以最少的背景可视化多个成绩单。该方法可以生成高度异质性细胞类型的转录谱的准确图谱。演示该程序的将是我和实验室的研究技术人员Johnson Bob-manuel。首先从两侧收集八周龄小鼠的整个迷走神经节性肿块，并借助解剖镜和手术器械。斩首小鼠后，使用小镊子去除胸骨，并将胸舌肌侧向气管，以暴露枕骨。清除整个肌肉和组织区域，直到颈动脉，迷走神经和舌下神经和大孔可见。然后用小弹簧剪刀切开整个舌下神经。将结节定位为靠近大孔的半透明肿块。用小剪刀，小心地折断枕骨。为了进一步暴露颈静脉神经节，将颈静脉表面的黑色素细胞定位为视觉标志。当发现神经节时，切断迷走神经节肿块之间的神经附件，轻轻拉动迷走神经的外周端，同时用小弹簧剪刀将颈神经节切向脑干，以提取整个神经节肿块。去除粘附在迷走神经上的结膜组织、神经节性肿块和脂肪。保持迷走神经约半厘米，以方便处理和定位样本。在1.5毫米微型离心管中借助细镊子将去除物置于神经节。并在福尔马林中以4摄氏度孵育24小时。然后用30%蔗糖24小时。孵育后，将神经节置于一块铝箔上直径为4毫米的最佳切割温度介质内。并在干冰床上表达样品。用低温恒温器将冷冻样品在零下20摄氏度切割成14微米厚的切片，并将切割的部分收集在玻璃显微镜载玻片上，作为三个系列42微米相隔。用PBS中的组织切片冲洗载玻片。在烤炉中以60摄氏度烘烤30分钟。然后，将载玻片以4%福尔马林在4摄氏度下后缀15分钟。将载玻片在50%70%和100%乙醇中连续脱水5分钟。并将过氧化氢溶液涂在样品上10分钟，然后在双蒸馏水中冲洗。对于原位杂交或ISH，用靶向检索试剂处理样品五分钟。然后依次在双蒸馏水和100%乙醇中冲洗样品，然后进行空气干燥。使用疏水笔，在样品周围形成屏障。当样品在40摄氏度和杂交烤箱下用蛋白酶处理30分钟时，在40摄氏度下预热探针并在使用前在室温下冷却。从烤箱中移出后，在杂交烤箱中将载玻片与所需的目标探针组合在40摄氏度下孵育两小时。用二氢二吡啶甲酸还原酶或DapB孵育阴性对照组织，在40摄氏度下靶向C1探针两小时。在洗涤缓冲液中冲洗载玻片，并在室温下储存在五次盐水柠檬酸钠中过夜。第二天，用洗涤缓冲液冲洗载玻片，然后用扩增试剂孵育。并按照手稿中所述用通道特异性试剂进行处理。清洗载玻片，然后用DapB处理30秒。然后立即将安装介质涂抹在每张载玻片上，并在组织切片上放置盖玻片。将组织水平保持在四摄氏度的载玻片架中，直到成像。通过设置所需的参数准备用于成像的共聚焦显微镜。获取线平均为 4 且像素大小至少为 1024 x 1024 的图像，以提高图像的质量。一旦对采集参数感到满意，请使用相同的设置开始采集图像。将假颜色归因于每个通道，以便于可视化。使用数字图像，通过识别RNA范围阳性谱的轮廓进行细胞计数，其中一个细胞核用DapB轻轻染色。计算表达每个转录本的RNA范围阳性谱的百分比。根据在阴性对照组织中获得的非特异性荧光，为每种激光选择最佳采集参数。年轻成年小鼠的结节神经节中的内源性荧光是最小的。并且用DapB探针孵育，它没有产生信号。在488纳米激光器的功率和增益增加时，会出现不需要的背景和随机荧光点。应用RNA示波器技术检测迷走神经节团组织切片中的三个基因。GHSR 和 CCK1R 的组织谱呈阳性。该谱包括结节喙部的Phox2b和CCK1R转录本。由于结卵传入神经元中的多重ISH，Phox2b信号特异性地积聚在位于节点神经节中的传入神经元中。CCK1R信号强烈标记了结节中的许多神经元。在低放大倍率下，表达低CCK1R或GSHR信号的细胞不容易被观察到。DapB有助于可视化组织并识别具有大而轻微染色的细胞核的迷走神经传入神经元。在高放大倍率下，Phox2b阳性轮廓明显。配置文件二和三是具有高和中度CCK1R信号的Phox2b细胞。概况四表示全球统一制度和CCK1R。由于颈静脉传入神经元的多重性 ISH，可以看到 PRDM12 转录本特异性地积聚在位于颈静脉神经节的传入神经元中。在高放大倍率下，在配置文件1和2中检测到CCK1R的中等信号。剖面图三是CCK1R或GHSR阴性的PRDM12细胞的代表。解剖的一致性是一个重要因素。同样重要的是，要验证成像采集参数不会产生不需要的背景信号。多重原位杂交已成为分子建立的黄金标准，特别是在神经解剖学领域。该方法可以很容易地与免疫组化相结合。

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